一种猪流行性腹泻病毒的多重rt-pcr检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物监测技术领域，涉及一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测 试剂盒，具体为针对PEDV、PSV和SaV -步法三重RT-PCR的检测方法。
【背景技术】
[0002] 近年来仔猪腹泻病广泛流行于全国各地，患病仔猪发病率、死亡率均高达80%以 上，给养猪业造成严重的经济损失。冠状病毒科猪流行性腹泻病毒（PHW)、传染性胃肠炎 病毒（TGEV)以及呼肠孤病毒科猪A群轮状病毒（GARV)是导致猪腹泻的三种主要病毒性 病原。在腹泻病因的调查中常呈混合感染，关于这三种病毒的多重检测方法有很多文献报 道。另据文献报道猪博卡病毒（PBoV)、猪萨佩罗病毒（PSV)和猪札幌病毒（SaV)可以引起 猪的腹泻，但相对文献报道较少也没有引起足够的重视。PSV是单股正链RNA病毒，属于小 RNA病毒科，《病毒分类-国际病毒分类委员会（ICTV)第八次报告》最终将其命名为萨佩 罗病毒属，该属包括猪萨佩罗病毒、禽萨佩罗病毒和猿萨佩罗病毒。该病毒能引起中度或 严重的神经系统紊乱、腹泻、繁殖障碍和肺炎。PSV能在猪肠道上皮细胞繁殖，并随着粪便 排出体外，使该病毒在环境中大量存在，感染猪在康复后可继续排毒，因此在饲养猪群中感 染率较高。该病毒若与其他病原如猪瘟病毒（CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)以 及猪细小病毒（PPV)等混合感染，将造成病猪严重的临床症状。猪肠道杯状病毒（Porcine enteric calicivirus，PECV)包括猪诺如病毒（norovirus，NoV)和猪札幌病毒（Porcine sapovirus，SaV)。猪NoV只感染成年猪，且无临床症状；而猪SaV感染各年龄的猪尤其断奶 仔猪，并引起仔猪腹泻，给养殖业带来一定损失。SaV分为5个基因群（GI-GV)，其中GIII 为猪SaV，其余为人SaV，世界首例猪SaV(Sw/SV/Cowden/80/US)于1980年在美国报道，英 国、委内瑞拉和韩国等国家也陆续有暴发该病的报道，黄泽彬等于2009年首次报道该病也 存在于我国的猪群中。
[0003] 多重PCR是在同一反应体系中加入多对引物对多个目的基因同时进行扩增的试 验方法。该项技术具有省时、省力、降低成本、减少产物污染等优点。多重PCR能够捕获更 多的信息，使应用范围更加广泛，分析的基因更加复杂。因此建立一种能够同时检测PEDV、 PSV和SaV多重RT-PCR方法有助于快速鉴别诊断疾病。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于立一种快速、敏感的鉴别诊断PEDV、PSV和SaV多重RT-PCR检测 方法。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] 一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，包括引物组合物： PEDV-Pl :5' -CTGCCAATGTATTTGCCAC-3'、PEDV-P2 :5' -GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3' ； PSV-Pl :5' -TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3'、PSV-P2 :5' -GCCCTGCACAACTGCTTTC-3' ；SAV-P1 : 5' -TACGGGGGAATAGGTTT-3'、SAV-P2 :5' -CAGCCACATCTGGGTAGT-3'。
[0007] 本发明所述的RT-PCR检测的反应体系为为：PrimeScript lstep Enzyme Mix (内含 PrimeScript Reverse Transcriptase、TaKaRa Ex Taq Hot Start 及 RNase Inhibitor)2yl、2X lstep Buffer(内含反应 Buffer 和dNTP Mixture(终浓度 400 μ M) )25 μ 1、上游引物（10 μ M)各I μ 1、下游引物（10 μ M)各I μ 1、模板RNA 5 μ 1，加 DEPC 水至 50 μ 1。
[0008] 针对上述反应体系，反应条件具体为：50°C 30min ;94°C 2min ;94°C 30sec， 55°C 30sec，72°C 30sec，35 个循环；循环结束后再 72°C IOmin0
[0009] 本发明所述的引物组合物根据GenBank收录的PEDV序列（CV777) SI基因、PSV序 列（YC2011)保守基因和SAV序列Cowden(AF182760)VPl基因设计得到。
[0010] 本发明还提供了一种猪流行性腹泻病毒的多重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
[0011] 1)病料的处理：用IOmmol · L 1PBS缓冲液将粪样稀释10倍，在涡旋仪上振荡混匀 5min后，12000r · min 1离心5min，取上清液备用；
[0012] 2)RNA的提取：将样品分别依次利用氯仿、异丙醇萃取离心，弃上清，在沉淀中加 入冰乙醇混匀，室温下静置，沉淀即为总RNA ;
[0013] 3) RT-PCR反应体系的建立
[0014] 反应体系为 50 μ I :PrimeScript lstep Enzyme Mix (内含 Prime Script Reverse Transcriptase、TaKaRa Ex Taq Hot Start 及 RNase In hibitor)2 μ1、2X lstep Buffer(内含反应 Buffer 和 dNTP Mixture(终浓度 400 μΜ))25 μ 1、上游引物 (10μΜ)1μ1、下游引物（10μΜ)1μ1、模板RNA 5μ1，加 DEPC水至 50μ1 ;
[0015] 反应参数为：5〇Γ 3Omin ;94°C 2min ;94°C 3〇sec，55°C 3Ose c，72°C 3Osec,35 个 循环；循环结束后再72°C IOmin ;
[0016] 4)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳判定结果。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种用于检测猪流行性腹泻病毒的引物组 合物，所述的引物组合物包括：PEDV-P1 :5' -CTGCCAATGTATTTGCCAC-3'、PEDV-P2 : 5, -GGAAGTTCCTTGAACCTCG-3' ；PSV-P1 :5, -TGCTTGAGGAGTCGGAGAG-3，、PSV-P2 : 5? -GCCCTGCACAACTGCTTTC-3, ；SAV-P1 -TACGGGGGAATAGGTTT-3 \ SAV-P2 ： 5' -CAGCCACATCTGGGTAGT-3'。
[0018] 本发明所述的猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒、猪萨佩罗病毒和猪札幌病 毒。
[0019] 本发明的有益效果为：本发明建立的PEDV、PSV、SAV-步法多重RT-PCR检测方法， 特异性强，敏感度高，将RT和PCR两步反应一步进行，既节省了时间和步骤，同时也大大减 少了对RNA的污染和降解机率，可以在同一体系中同时检测3种引起猪腹泻的病毒，大大降 低了检测成本，为临床上病原感染性调查研究提供了简便、快速和准确的检测方法，具有重 要的实际应用价值。
【附图说明】
[0020] 图1是PEDV、PSV和SAV单项RT-PCR不同退火温度的电泳图；M. DNA标准DL2000 ; 1 ~8、9 ~16 和 17 ~24 的 Tm 值分别为 51. 0、5L 5、52. 4、53. 8、55. 5、56. 8、57. 6、58. (TC 8 个梯度；1~8为等量PEDV RNA模板；9~16 :为等量PSV RNA模板；17~24 :为等量SAV RNA模板；
[0021] 图2是PEDV、PSV和SAV单项RT-PCR不同引物浓度的电泳图；M. DNA标准DL2000 ; 1~8、9~16和17~24加入的引物量分别为L 5、L 35、L 2、L 0、0· 75、0· 5、0· 35和 0. 2 μ 1 ;1~8为等量SAV RNA模板；9~16 :为等量PSV RNA模板；17~24 :为等量PEDV R NA模板；
[0022] 图3是多重RT-PCR不同退火温度的电泳图；M. DNA标准DL2000 ; 1~8的Tm值分 别为 53. 0、53· 8、54· 5、55· 0、55· 5、56· 0、56· 8、57. 5°C 8 个梯度；
[0023] 图4是不同混合模板的多重RT-PCR的电泳图；M. DNA标准D L2000 ;1.为PEDV、 PSV 和 SAV 混合 RNA 模板；2 ~6 :为 PEDV-TGEV-GARV 三联弱毒疫苗 RNA、PSV、SAV、CSFV、 PRRSV RNA 模板；7 ~10 :PCV2、PRV、PPV DNA 模板以及 H2O ;
[0024] 图5是PEDV、PSV和SAV混合RNA模板不同浓度的电泳图；M. DNA标准DL2000 ; 1~ 7 :PEDV、PSV 和 SAV 混合 RNA 模板稀释度依次为 10°、101、102、103、104、10 5、106、107。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0026] 实验材料
[0027] 病毒：猪瘟病毒（CSFV)和猪圆环病毒II型（PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)、猪伪狂犬病毒（PRV)弱毒疫苗和猪萨佩罗病毒（PSV)、猪札幌病毒（SaV)由作者 实验室保存，猪细小病毒（PPV)、猪流行性腹泻病毒（PHW)、流行性腹泻-猪传染性胃肠 炎-猪A群轮状病毒三联弱毒株由浙江大学动物预防医学实验室提供。
[0028] 主要试剂及仪器：RNAiso Plus (Total RNA extraction reagent)(批号： v201301Da)、PrimeScriptTM One St印 RT-PCR Kit Ver. 2(批号：v201309Da、AK3402)、 TaKaRa Ex Taq Hot Start (批号：NA501CA)和 DL2000DNA Marker 购自大连宝生物工程有 限公司；氯仿、异丙醇、冰乙醇购自上海化学试剂有限公司。S1000TM Ther mal Cycler PCR 仪、Bio-RAD Gel DocTM XR+紫外凝胶成像分析系统和核酸电泳仪为美国Bio-RAD公司产 品。
[0029] 实施例1 RT-PCR反应体系的建立
[0030] 1)根据GenBank收录的PEDV序列（cv777) Sl基因