一种检测抗猪流行性腹泻病毒抗体的elisa检测试剂盒及其使用方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测抗猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA检测试剂盒及其使用方 法和用途。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻、脱水为主要特征 的急性高度接触性肠道传染病，哺乳仔猪感染后具有高致死率和高感染率。各个年龄 段的猪均易感染，该病最初于1971年在比利时和英国发现，此后，许多国家陆续报道该 病的流行，在仔猪尤为严重，1976年我国首次报道该病；1955年，国际病毒分类委员会 (International Committeeon Taxonomy of Viruses, ICTV)在第6 次报告中将猪流行性腹 泻病毒归为冠状病毒属。尽管我国部分猪场采取了 PEDV的疫苗免疫措施，但我国自2010年 以来，全国大部分养猪地区再度暴发该病，造成极其严重的损失。近年，韩国也发生该病流 行，至2013年以来该病又在美国、日本等国家也相继发生，造成巨大的经济损失。总体上， 该病已遍布世界养猪地区，给全世界养猪业造成严重的经济损失。
[0003] 目前，对PEDV的诊断方法主要有临床诊断、免疫胶体金、ELISA、RT-PCR等诊断方 法。他们的准确度、稳定性都很好逐渐被人们所重视。ELISA即酶联免疫吸附试验，它是目 前应用比较多，发展比较快的一种抗体检测方法。此方法即可检测抗原，能够直接检测出 粪便中的抗原，也可以检测抗体，当猪场当中出现腹泻的症状时即可用于检测，可做到早诊 断，早治疗，被广泛的应用于临床检测。
[0004] 现有文献中制备的检测试剂盒，准确度不高，市售的试剂盒的准确度较高，如，R&B 公司的Porcine-PEDV试剂盒，但是售价高，使用成本高。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种检测PEDV。
[0006] 本发明检测抗猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA检测试剂盒，它是以氨基酸序列如 SEQ ID NO :2所示的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白为抗原，检测待检样品中是否含有抗猪 流行性腹泻病毒的抗体。
[0007] 所述ELISA检测试剂盒为间接ELISA检测试剂盒，它包括如下组分：
[0008] (1)氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白；
[0009] (2)酶标板；
[0010] ⑶抗原包被液；
[0011] ⑷洗涤液；
[0012] ⑶封闭液；
[0013] (6)样品稀释液；
[0014] ⑵酶标二抗；
[0015] (8)底物液；
[0016] ⑶终止液。
[0017] 其中，所述抗原包被液是为碳酸盐溶液。
[0018] 其中，所述洗涤液是PBST溶液。
[0019] PBST 溶液：ρΗ7· 4,0· 2g KH2P04,0. 2g KC1，2. 9g Na2HP04. 12H20,8. Og NaCl， 0· 5mL Tween-20,加入去离子水定容至1000mL。
[0020] 其中，所述封闭液为5 %的脱脂牛奶、I %的BSA或3 %的明胶。
[0021] 其中，所述样品稀释液为PBST溶液。
[0022] 其中，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG。
[0023] 其中，所述底物液是浓度为0. 208mmol/L的TMB溶液。
[0024] 其中，所述终止液是浓度为2mol/L的H2SO4溶液。
[0025] 本发明还提供了前述检测试剂盒的使用方法，它包括如下步骤：
[0026] (1)包被：取氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白，用 包被液稀释至蛋白浓度为〇. 313~10 μ g/mL，包被酶标板，洗涤；
[0027] (2)封闭：加入封闭液封闭，洗涤；
[0028] (3)加待检样品：取待检样品，用稀释液稀释10~320倍，加入微孔板中，37°C温 育Ih，洗涤；
[0029] (4)加酶标二抗：取酶标二抗，用稀释液稀释2000倍，加入微孔板中，37°C反应 30min，洗绦；
[0030] (5)加底物：加入底物液，室温避光反应10~15min ;
[0031] (6)终止反应：加入终止液，终止反应，测定其0D450值。
[0032] 步骤（1)中，所述用包被液稀释至蛋白浓度为2. 5 μ g/mL。
[0033] 步骤（2)中，待检样品，用稀释液稀释20倍。
[0034] 本发明还提供了前述检测试剂盒在制备猪流行性腹泻病毒的检测试剂盒中的用 途。
[0035] 本发明包含重组N蛋白的ELISA检测试剂盒可以准确检测猪流行性腹泻病毒，与 市售的R&B公司的Porcine-PEDV试剂盒的检测结果基本一致，可以用于替代市售的试剂盒 使用，同时本发明试剂盒的特异性强、灵敏度高、简单、快速，制备方法简单，成本低廉。
[0036] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内 容所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0037] 图I PEDV N基因的RT-PCR扩增。M :DL2000 ;1 :阴性对照；2-3 :RT-PCR扩增产物 N基因；；
[0038] 图2重组质粒P GEM-T-N的双酶切鉴定。M :DNA Marker III ;1_2 :质粒PCR ;3 :阴 性对照；4-5 :BamH I和XhoI双酶切产物；
[0039] 图3 PEDV N基因核苷酸序列同源性比较；
[0040] 图4 PEDV N基因氨基酸序列同源性比较；
[0041] 图5 PEDV N基因进化树；图6重组质粒的质粒PCR。M :DNA Marker III ; 1-3 :质粒 PCR ;4 :对照；
[0042] 图 7 重组质粒 pET-28a-N 的双酶切鉴定。M :DNA Marker III ;1_2 :BamH I 和 XhoI 双酶切产物；
[0043] 图8重组蛋白不同诱导表达时间。M :蛋白Marker ;1 :pET-28a_N诱导前对照；2 : 诱导后Ih ;3 :诱导后2h ;4 :诱导后3h ;5 :诱导后4h ;6 :诱导后5h ;7 :诱导后6h ;8 :诱导后 7h ;9 :pET-28a诱导后对照；
[0044] 图9重组蛋白不同诱导表达温度。M :蛋白Marker ;1 :25°C诱导；2 :30°C诱导3 : 37°C诱导；
[0045] 图10重组蛋白不同诱导IPTG浓度。M :蛋白Marker ;1 :pET-28a诱导后对照；2 : pET_28a_N 诱导前；3 :0· 2mM ;4 :0· 4mM ；5 ：0. 6mM ；6 ：0. 8 ；7 ：1. OmM ；8 ：1. 2mM ；
[0046] 图11重组蛋白可溶性分析。M :蛋白Marker ;1 :pET_28a诱导后对照2 :总菌液； 3 :破菌后上清；4 :包涵体溶解液；
[0047] 图12重组蛋白的纯化结果。M:蛋白Marker ;1_2 :纯化后蛋白；
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