一种用于荧光免疫定量检测的样本缓冲液及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及荧光免疫定量检测领域，具体涉及一种用于荧光免疫定量检测的样本 缓冲液及其应用。
【背景技术】
[0002] 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发 光剂等作为示踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应，并借助于荧光显微镜、射线测量 仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，应用各种液相和固相免疫分析 方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定的方法。时间分辨荧光免疫分 析（Timed-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术，是 以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体，因镧系稀土离子具有独特的荧光特性，该 技术能够获得极高的信噪比，从而具有很高的灵敏度，且还具有标记物制备简便、储存时间 长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和 应用范围十分广泛等优点。时间分辨荧光免疫分析相对于酶免分析、放射免疫分析有更高 的临床应用价值。该技术适用于各种抗原抗体的临床检测，在市场上已得到广泛应用。
[0003] 荧光免疫层析是建立在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术和免 疫荧光微球标记技术基础上的以荧光微球为标记物，利用特异的抗原抗体反应来放大反 应，通过荧光定量分析仪判定结果的新技术。该技术具有简单、快速、准确和无污染等优点， 在临床医学检测、激素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速检测诸多诊断领域迅速发 展。随着即时检验（POCT)产业的深入发展，荧光免疫试剂由于其本身所带有的快速、简便、 易于携带、便于深入社区及边远山区等特点，成为目前POCT发展的主要领域，从而那些与 发病急、危害大的疾病相关的检测指标的荧光免疫试剂的需求越来越大。
[0004] 但是以全血样本作为荧光免疫定量层析检测样本进行检测仍然是POCT领域的一 大热点和难题。荧光免疫定量层析在以血浆/血清作为检测样本时，检测结果灵敏度高，检 测方法简便、快速、特异性高。但是以全血样本作为检测样本时，由于全血中红细胞的存在， 检测时一旦红细胞泄露到试纸条NC膜上，则会对荧光微球在NC膜检测线和控制线上的聚 集产生影响，从而造成检测结果的假阳或假阴性。考虑到分离血清/血浆及若干操作步骤， 至少需要一小时左右，而在无技术条件的医疗单位，还无法进行。因此，一种用全血进行分 析的床旁诊断分析法，即全血免疫层析法显的至关重要。用于全血样本检测的样本缓冲液 也就成为了荧光免疫定量检测试纸条在临床应用的关键。本发明致力于探寻一种能够快速 有效检测全血样本的荧光免疫定量检测试纸条和样本缓冲液，来检测全血样本。从而为医 院临床和患者提供更有效快速的服务和治疗。
[0005] 然而，目前市面上仅有的几家生产荧光免疫定量试纸的公司多是以抗人红细胞 (RBC)抗体作为全血检测样本缓冲液，这种方法需要进行动物免疫实验，培养细胞并涉及提 取和纯化RBC抗体等一系列实验操作，过程繁琐，而且对RBC抗体纯度要求很高。一旦纯度 达不到要求，对检测结果影响很大。截至目前，还没有关于采用小牛血清作为全血检测的样 本缓冲液的报道，因此，本发明第一次公开通过小牛血清作为样本缓冲液与全血样本按一 定比例混合进行检测的方法和应用。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种荧光免疫定量检测试纸条，能够快 速有效检测全血/血浆/血清样本。
[0007] 为实现上述目的，本发明首先提供一种用于荧光免疫定量检测的样本缓冲液，所 述样本缓冲液由小牛全血离心取血清后，加入PB缓冲液混合制得。
[0008] 所述小牛全血为新鲜采集的新生牛血，新生牛血里面的IgM含量最大，浓度最高， 利于保藏，且来源广泛，价格低廉，而且危险性和传染病源小，制作成的样本缓冲液性质稳 定。
[0009] 作为优选，所述小牛血清与所述PB缓冲液以1:1的体积比混合。该比例是小牛血 清与PB缓冲液的最佳比例，采用该比例混合的小牛血清中IgM浓度为凝集红细胞的最适浓 度，且能减少小牛血清的损耗。
[0010] 作为优选，所述离心为低速离心，以4000r/min离心5分钟最佳，目的是防止血浆 中的IgM等大分子蛋白被离心出来，从而影响样本缓冲液的使用。
[0011] 本发明还提供了前述样本缓冲液在全血/血浆/血清样本荧光免疫定量检测中的 应用。
[0012] 进一步地，所述应用为荧光免疫定量检测全血样本中的心肌标志物。
[0013] 本发明还提供了一种全血样本荧光免疫定量检测的方法，具体为将全血样本与前 述样本缓冲液混合后，加到荧光免疫定量检测试纸条的样品垫上，利用荧光定量分析仪检 测待测样本。
[0014] 作为优选，所述全血样本与所述样本缓冲液以1:2的体积比混合。
[0015] 进一步地，所述荧光免疫定量检测试纸条由玻璃纤维膜、聚酯玻纤、硝酸纤维素 膜、吸水滤纸和PVC板组成；所述玻璃纤维膜的厚度为0. 52_，纤维直径为0. 6-3. 0 μ m，其 作为样品垫滤全血效果最佳。
[0016] 进一步地，所述聚酯玻纤作为荧光标记垫，其厚度为0. 25mm，吸水量为49. 25mg/ cm2,其具有良好的亲水性和释放性，能减小对检测结果的干扰。所述荧光检测试纸中硝酸 纤维素膜作为反应区。
[0017] 本发明还提供了一种血浆/血清样本荧光免疫定量检测的方法，具体为将血浆/ 血清样本与前述样本缓冲液混合后，加到荧光免疫定量检测试纸条的样品垫上，利用荧光 定量分析仪检测待测样本。
[0018] 作为优选，所述血浆/血清样本与所述样本缓冲液以1:3的体积比混合。
[0019] 本发明的有益效果在于：
[0020] 本发明采用小牛血清制备样本缓冲液，不仅降低了产品的成本，而且具有良好的 稳定性和重复性；通过在小牛血清中加入一定比例的PB缓冲液，制备的荧光检测试纸样本 缓冲液，呈液体状，相比于目前国内外市场上的其他全血检测方法，以小牛血清作为样本缓 冲液，可以实现以全血、血浆或血清作为样本进行检测，成本低廉，且对检测结果无干扰。并 能够更好地用于荧光免疫定量分析，检测快速，结果准确，操作简便，而其他的全血检测方 法多以抗人红细胞抗体处理全血样本，制作成本高，过程繁琐，而且检测过程容易造成非特 异性反应，从而影响检测结果。
【附图说明】
[0021] 图1为荧光免疫定量检测试纸示意图；
[0022] 图2为红细胞凝集反应示意图；
[0023] 图3为BCA法测蛋白浓度标准曲线；
[0024] 图4为荧光免疫定量检测试纸条全血检测效果示意图（1~6分别为全血与样本 缓冲液按 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1,2:1 比例混合）；
[0025] 图5为心肌肌钙蛋白I浓度标准曲线。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027] 实施例1用于荧光免疫定量检测的样本缓冲液的制备
[0028] 用电子天平分别称取71. 6g Na2HPO4 ·12Η20, 31. 2g NaH2PO4 ·2Η20,分别溶于 1000 mL 蒸馏水，各自配制成0.2Μ母液。取19mL 0.2Μ NaH2PO4母液，81mL 0.2Μ Na2HPO4母液，混合 置于容量瓶中，加蒸馏水定容至lOOOmL，配制成0. 02M pH7. 4的PB缓冲液。取一定量新鲜 采集的小牛血清（新鲜小牛全血4000r/min离心5分钟），以1:1的比例与前述PB缓冲液 混合，振荡均匀。按180 μ L/支分装，待用。
[0029] 实施例2样本缓冲液中小牛血清与PB缓冲液混合比例的优化
[0030] 将新鲜采集的小牛血清原液，以及与PB缓冲液经2: 1，1: 1，，1:3系列稀释后，与定 量的红细胞溶液进行免疫沉淀反应，优化小牛血清与PB缓冲液的最适混合比，检测结果如 表1所示。
[0031] 表1 :小牛血清与PB缓冲液混合比例优化结果
【主权项】
1. 一种用于荧光免疫定量检测的样本缓冲液，其特征在于，所述样本缓冲液由小牛全 血离心取血清后，加入PB缓冲液混合制得。
2. 根据权利要求1所述的样本缓冲液，其特征在于，所述小牛血清与所述PB缓冲液以 1:1的体积比混合。
3. 根据权利要求1或2所述的样本缓冲液，其特征在于，所述小牛全血离心的离心条件 为 4000r/min，5 分钟。
4. 权利要求1-3任一项所述的样本缓冲液在全血/血浆/血清样本荧光免疫定量检测 中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为荧光免疫定量检测全血样本 中的心肌标志物。
6. -种全血样本荧光免疫定量检测的方法，其特征在于，将全血样本与权利要求1-3 任一项所述的样本缓冲液混合后，加到荧光免疫定量检测试纸条的样品垫上，利用荧光定 量分析仪检测待测样本。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述全血样本与所述样本缓冲液以1:2的 体积比混合。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述荧光免疫定量检测试纸条由 玻璃纤维膜、聚酯玻纤、硝酸纤维素膜、吸水滤纸和PVC板组成；所述玻璃纤维膜的厚度为 0? 52mm，纤维直径为 0? 6-3.Oym。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述聚酯玻纤作为荧光标记垫，其厚度为 0? 25mm，吸水量为 49. 25mg/cm2。
10. -种血浆/血清样本荧光免疫定量检测的方法，其特征在于，将血浆/血清样本 与权利要求1-3任一项所述的样本缓冲液混合后，加到荧光免疫定量检测试纸条的样品垫 上，利用荧光定量分析仪检测待测样本；所述血浆/血清样本与所述样本缓冲液以1:3的体 积比混合。
【专利摘要】本发明涉及荧光免疫定量检测领域，具体提供了一种用于荧光免疫定量检测的样本缓冲液及其应用。所述样本缓冲液由小牛全血离心取血清后，加入PB缓冲液混合制得，所述小牛血清与所述PB缓冲液以1:1的体积比混合。本发明还提供了一种全血样本荧光免疫定量检测的方法，将全血样本与所述样本缓冲液以1:2的体积比混合后，加到荧光免疫定量检测试纸条的样品垫上，利用荧光定量分析仪检测待测样本。利用本发明方法可以实现以全血、血浆或血清作为样本进行检测，成本低廉，且对检测结果无干扰。
【IPC分类】G01N33-531
【公开号】CN104730231
【申请号】CN201510136850
【发明人】陈勇, 张静, 邱笑违
【申请人】北京乐普医疗科技有限责任公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月26日