一种crp/saa定量联合检测免疫荧光层析试纸及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种荧光层析试纸及其制备方法，具体地说，是一种CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸及其制备方法；属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002]C-反应蛋白(C-react1n，CRP)是由肝脏合成的一种急性时相蛋白，痕量存在于健康人血清中，当机体受到感染或组织损伤时含量迅速升高，随着病情改善或组织结构功能的恢复其含量恢复到正常水平。目前CRP作为全身性炎症反应早期检测的灵敏指标，已在临床许多疾病的诊断、治疗和预后中广泛应用。根据血清、血浆或全血中CRP的浓度水平，可以有效的判断有无感染、疾病的危险程度及疾病是否处于活动期。
[0003]血清淀粉样蛋白A (Serum amyloid A protein, SAA)，同样是一种急性时相反应蛋白，是一种炎症或感染急性期的敏感指标，临床意义与CRP相类似，检测血液中SAA的浓度水平，有助于诊断非特异炎症、评估炎症活动程度、监控炎症活动及治疗后效果。
[0004]研究表明血液中CRP/SAA浓度水平与许多疾病的严重程度呈一定的正相关性，是许多疾病辅助诊断的检测项目，联合检测CRP/SAA浓度水平能更够有效的预测疾病及其发病的危险程度，机体中CRP/SAA水平上升预示着机体存在炎症感染或是疾病处于活动期；此外CRP/SAA联合检测能够有效的鉴别、诊断细菌和病毒感染，特别是婴幼儿感染性疾病早期，细菌和病毒是很难鉴别的，而联合检测血清CRP和SAA水平及SAA/CRP比值的变化有助于小儿细菌感染与病毒感染的鉴别诊断。CRP与SAA联合检测可提高检测敏感性和特异性，对鉴别诊断提供更充分的依据，二者联合检测具有优势互补和临床增值的意义，比单独检测一个项目更有意义。
[0005]而然，目前市场上没有出现CRP/SAA同时定量联合检测的产品，临床上对患者的CRP/SAA浓度的同时检测只能是逐项进行检测。一方面耗时耗力，另一方面造成试剂、耗材的浪费，增加了检测治疗的成本，而CRP与SAA在机体处于感染状态时，均以mg/L为单位量在机体内存在，具有同时检测的条件。
[0006]此外，目前的大多数快速检测试剂需要的样本量较大，无法应用指尖末梢血进行检测，需要采集静脉血进行检测，而血液的样本采集需要专业人员操作，这使快速检测试纸条很难推广普及到社区或个人在诊断、体检等方面的运用。研究表明手指末梢血采集操作简便、不需要专业人员操作、对机体的危害小，临床上的一些检测指标与静脉血没有差异。李骋在研究手指末梢血PCT、hs-CRP联合检测在儿童感染性疾病中的应用价值中表明检测末梢血与静脉血PCT、CRP的含量没有差别，手指末梢血可以用于联合检测血清中PCT、CRP的含量，可以诊断区别儿童感染性疾病。由此可见，发明一种同时适用手指末梢血CRP/SAA含量检测的试纸对快速检测试纸条普及到社区或个人在诊断、体检等方面的运用具有重要的意义。
【发明内容】
[0007]针对上述不足，本发明目的是提供一种既能定量联合检测人末梢血中CRP/SAA含量，也可用于定量联合检测静脉血中CRP/SAA含量的CRP/SAA定量联合快速检测试纸条，本发明还提供了该试纸的制备方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明提供的前一个技术方案是这样的:
[0009]—种CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸，包括带盖的盒体，盒体内设有检测试纸条，盒体内还设装有血液稀释液的血液稀释液瓶；所述的检测试纸条包括底衬，底衬上设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端衔接有荧光微球标记抗体结合垫，荧光微球标记抗体结合垫上衔接有样品垫，硝酸纤维素膜的另一端衔接有吸收垫；所述的荧光微球标记抗体结合垫包被有CRP单克隆抗体，SAA单克隆抗体；所述的硝酸纤维素膜上平行设有一条包被有CRP单克隆抗体的CRP检测线、一条包被有SAA单克隆抗体的SAA检测线和一条包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。
[0010]进一步的，上述的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸，所述的盒体的盒盖上设有加样孔和结果观察窗口。
[0011]进一步的，上述的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸，，所述的血液稀释液为含0.05-0.15wt%#血溶性表面活性剂、0.01% -0.03界七％抗凝剂、0.03-0.07界七％防腐剂的等渗溶液。
[0012]进一步的，上述的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸，所述样品垫为全血过滤膜样品垫。
[0013]进一步的，上述的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸，所述的荧光微球标记抗体结合垫包裹有Eu3+的聚苯乙烯乳胶微球标记的CRP/SAA单克隆抗体。
[0014]本发明提供的后一技术方案是这样的:
[0015]上述的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸的制备方法，依次包括下述步骤:
[0016]在底衬上粘贴硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端依次粘贴样品垫、荧光微球标记抗体结合垫，硝酸纤维素膜的另一端衔接吸收垫制得检测试纸条，将组装好的检测试纸条条安装在盒体底部卡槽中，盖上盒盖即得；
[0017]其中:
[0018]I)样品垫的制备方法
[0019]将全血过滤膜样品垫浸泡含有2%蔗糖、0.5% PVP10000的pH7.520mmol/L硼酸-硼砂缓冲液处理，室温干燥后，按照每1.5X30cm2均匀喷洒150 μ L含I %阻断剂、0.5% Tetronic 1307与2% BSA水溶液，再次干燥后，在密封袋中干燥保存；
[0020]2)荧光微球标记抗体结合垫的制备方法
[0021]用荧光微球复溶液分别稀释标记有CRP单克隆抗体的荧光微球、标记有SAA单克隆抗体的荧光微球，将标记后的两种荧光微球按体积尔比1:1混匀，喷至结合垫上，制备荧光微球标记抗体结合垫；
[0022]3)检测线和质控线的制备
[0023]用包被缓冲液分别稀释能与待测抗原CRP特异性结合的单克隆抗体，能与SAA特异性结合的单克隆抗体，以及羊抗鼠IgG多克隆抗体，然后采用稀释后的三种抗体在硝酸纤维素膜依次平行地划线形成CRP检测线、SAA检测线、质控线。
[0024]进一步，上述的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸的制备方法，步骤3)所述的三种抗体的浓度均为0.5?1.5mg/ml，用量为30 μ l/30cm。
[0025]进一步的，上述的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸的制备方法，所述包被缓冲液中含有3?5%海藻糖的0.01?0.05M pH7.4的PBS。
[0026]进一步的，上述的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸的制备方法，所述的荧光微球标记抗体的方法是:用10mg/ml EDC和50mg/ml NHS对荧光微球活化后，离心去除EDC (1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)，用pH6.0?
7.0的50mM MES (乙磺酸)100W超声重悬，按照10 μ g?50 μ g/0.1mg量，向荧光微球分别加入CRP单克隆抗体、SAA单克隆抗体，然后将上述两种加入抗体后的荧光微球混匀后室温涡旋搅拌lh，离心洗涤2?3次，沉淀用后荧光微球复溶液100W超声处理30s复溶，4°C保存。进一步的，上述的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸的制备方法，所述的荧光微球复溶液为含有2%BSA、0.1%PEG4000、5%海藻糖、5%蔗糖的pH 8.0 1mmoI/LTris-HCl缓冲液。与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下优点:1、本发明应用荧光层析技术，通过在试纸上同时设有包被CRP单克隆抗体的检测线、包被有SAA单克隆抗体的检测线和羊抗鼠IgG的质控线，能够同时准确的检测血液中CRP和SAA浓度，并且两种抗原互不干扰，结果通过仪器读取，具有快速、简便，无需专业人员操作等优点，可以推广应用于医院、社区、个人的疾病预测、诊断和监测中。2、本发明提供的技术方案将CRP检测和SAA检测整合在同一试纸，不仅可以定量联合检测人末梢血中CRP/SAA含量，也可用于定量联合检测静脉血中CRP/SAA含量，可以解决现有技术不能于同一试纸中同时定量检测CRP/SAA的问题；此外本发明还解决了使用手指末梢血作为样本检测CRP/SAA含量的问题，简化了操作难度，推动检测试纸条在社区或个人在疾病预测、诊断、体检等方面的运用。
【附图说明】
[0027]图1是本发明提供的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸立体结构示意图；
[0028]图2是本发明提供的CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸条结构示意图。
[0029]其中:盒体1，血液稀释液瓶2，盒盖3，加样孔31，结果观察窗口 32，底衬4，硝酸纤维素膜5，CRP检测线51，SAA检测线52，质控线53，荧光微球标记抗体结合垫6，样品垫7，吸收垫8。
【具体实施方式】
[0030]下面结合具体实施例的方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
[0031]实施例1
[0032]本发明提供的一种CRP/SAA定量联合检测免疫荧光层析试纸，参阅图1、图2，包括带盖的盒体1，所述的盒体I的盒盖3上设有加样孔31和结果观察窗口 32。
[0033]盒体内设有检测试纸条，盒体内还设有含0.05-0.15wt%#血溶性表面活性剂、0.01% -0.03被％抗凝剂、0.03-0.07wt%防腐剂的等渗溶液的血液稀释液瓶2 ;所述的检测试纸条包括底衬4，底衬4上设有硝酸纤维素膜5，硝酸纤维素膜5的一端衔接有荧光微球标记抗体结合垫6，所述的焚光微球标记抗体结合垫6包裹有Eu3+的聚苯乙稀乳胶微球标记的CRP/SAA单克隆抗体。荧光微球标记抗体结合垫6上衔接有样品垫7，