快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫荧光试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于临床医学诊断领域，具体设及一种快速定量检测可溶性生长刺激表达 基因2蛋白（ST2)和N末端脑钢肤（NT-proBNP)的免疫巧光试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 可溶性生长刺激表达基因2蛋白（ST2)基因是1989年由Tominaga等首先在BALB/ C-3T3细胞系中得到的，是IL-1(白细胞介素1)受体家族成员之一，该基因表达两种蛋 白产物：一种带有跨膜结构，称为跨模型ST2(ST化)，一种可W分泌到细胞外，称为分泌型 ST2 (sST2)。研究发现ST2可由屯、脏成纤维细胞和屯、肌细胞表达，是生物机械应力诱导产生 的一种屯、肌蛋白。ST2基因表达于肥大细胞激活的辅助性T细胞2 (化2)巨瞻细胞和屯、肌细 胞。人的ST2基因约40化，位于人类染色体2ql2,可编码一种可溶性蛋白（sST2)和一种跨 膜形式蛋白（ST2L)，两者的转录分别受到不同的启动子调控。
[0003] 研究表明sST2是IL-33的诱骗受体，它可W与比-33结合，从而阻断IL-33与 ST化结合，继而削弱IL-33/ST化信号通路的屯、血管保护作用在屯、肌受到过度牵拉造成损 伤的过程中，大量sST2生成使屯、肌缺乏足够的IL-33的保护，从而加速屯、肌重构和屯、室功 能障碍，最终导致死亡风险增高。比-33是IL-1家族成员，可W与祀细胞上的膜受体结合后 介导下游信号通路，或者被运输到祀细胞的细胞核作为DNA结合因子行使功能。研究表明， 机械应力可刺激屯、脏成纤维细胞产生IL-33,与其受体复合物（由ST化和IL-lRAcP组成） 结合后，将活化信号传递至细胞内，经过下游的IL-1相关蛋白激酶髓样分化因子88和肿 瘤坏死因子受体相关因子6等一系列信号分子，激活核转录因子kB(nuclear化ctorKB， NF-kB)和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)，从而调节 基因转录，导致化2细胞效应分子IL-5IL-4和IL-13等的释放。当屯、脏成纤维细胞和屯、肌 细胞受到过大的压力负荷时，该些效应分子可W使屯、脏作出适应性反应，防止过度牵拉导 致的屯、肌肥大和屯、肌纤维化发生。与此同时，屯、肌sST2大量生成，sST2与比-33结合后竞 争性抑制其与ST化结合，阻断经ST化的信号传导，最终抑制NF-B和MAPK激活，从而大大降 低IL-33/ST化信号通路的内源性屯、肌保护作用。ST2能够独立的判断屯、力衰竭预后，结合 NT-proBNP时，其对屯、衰的诊断，治疗，及预后的敏感性和特异性均高于ST2和NT-proBNP 单独诊断的结果，其中NT-proBNP是指N末端脑钢肤，脑钢肤炬-type-Natriuretic P巧tide,BNP)由日本学者Sudoh等于1988年首先在猪脑中发现，而化nt等在1995年第一 次对N-端脑钢肤前体（N-terminal-pro-BNP,NTproBNP)进行了描述。BNP主要由左屯、室 分泌，在屯、肌细胞受到容量负荷和压力负荷增高时，非活性前体Pro-BNP裂解为活性BNP和 非活性的NT-proBNP。2000年11月美国食品药物管理局批准美国Biosite公司的Triage? BNP检测应用于临床，发展到今天，美国屯、脏协会（AHA)和欧洲屯、脏病学会巧SC)等全球屯、 血管权威机构W及美国临床生化学院（NACP)在其制订的"屯、衰诊断和治疗指南"及"屯、脏 标志物的应用指南"中，把BNP/NT-proBNP列为不可缺少的屯、脏标志物，W指导屯、衰的治疗。 NT-proBNP能客观反映充血性屯、力衰竭（CH巧及严重程度，其血浆水平随屯、衰程度增加而 增高，能更好地辅助诊断屯、衰分级。超声判断CHF的金标准是左室射血分数（LVE巧下降， 而血清NT-proBNP水平升高则预示左室射血功能的减退更加严重，甚至比超声检查更具优 越性。
[0004] 免疫巧光技术（FluorescenceImmunoassaytechnique)是W巧光分子作 为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。生物素一亲合素系统 炬iotin-Streptavidin-System,BA巧是一种非常有效的生物反应放大系统。生物素一亲 合素系统几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素一亲合素与标记试剂高亲合力 的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广 泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。BAS在实际应用中所具有 的巨大优越性，主要表现在W下几个方面：
[0005] (1)生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成的生物素衍生物，不仅 保持了大分子物质的原有生物活性，而且比巧度高，具多价性。因此，BAS具有多级放大作 用，使其在应用时可极大地提高检测方法的灵敏度。
[0006] (2)亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS 的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。而且，BAS结合特性不会 因反应试剂的高度稀释而受影响，使其在实际应用中可最大限度地降低反应试剂的非特异 作用。
[0007] (3)亲和素结合生物素的亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，二者结合形成 复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶W及有机溶剂均 不影响其结合。因此，BAS在实际应用中，产物的稳定性高，提高测定的精确度。（4)生物素 和亲和素均可制成多种衍生物，不仅可与酶、巧光素和放射性核素等各类标记技术结合，用 于检测体液、组织或细胞中的抗原-抗体、激素一受体和核酸系统W及其他多种生物学反 应体系，而且也可制成亲和介质，用于分离提纯上述各反应体系中的反应物。
[000引 目前，检测ST2和NT-proNP的方法目前主要是酶联免疫技术巧LISA)，化ISA技术 存在W下缺点：检测设备要求高，成本高；干扰因素较多，重复性不好；检测时间长。因此酶 联免疫技术检测ST2和NT-proBNP不适合临床快速诊断。如何能够制作出快速的定量检测 设备成为需要迫切解决的问题。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供一种快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫巧光试纸 条，本发明另一目的时还提供一种快速定量检测ST2和NT-proBNP的免疫巧光试纸条的制 备方法。
[0010] 本发明的快速定量检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白（ST2)和N-末端脑钢肤 (NT-proBN巧的免疫巧光试纸条，包括试纸条支撑片（4)W及试纸条支撑片（4)上顺次搭接 粘贴的样品垫片（1)、检测膜（2)和吸水垫片（3)，所述样品垫片（1)和检测膜（2)之间设 有偶合物垫片巧），所述的偶合物垫片（5) -端上方设有第一层玻璃纤维垫片化-1)，其一 端下方设有第二层玻璃纤维垫片化-2)或者偶合物垫片（5) -端上方仅设有第一层玻璃纤 维垫片（6-1)或者不设有任一垫片，所述检测膜（2)上设有检测线1(7-1)、检测线2(7-2)， 所述检测线1 (7-1)包被有抗ST2单克隆抗体或多克隆抗体，所述检测线2 (7-2)包被有抗NT-proBNP单克隆抗体或多克隆抗体，所述的检测线1 (7-1)、检测线2 (7-2)设在检测膜（2) 的同一位置或设在相邻位置，若为不同位置，则检测线1(7-1)、检测线2(7-2)均位于控制 线做同一侧，控制线做包被有抗链霉亲和素（SAV)抗体，所述偶合物垫片妨上涂布有 含有不同巧光标记的ST2抗体和NT-proBNP抗体偶合物，
[0011] 所述偶尔物垫片巧）中的含有不同巧光标记的ST2抗体偶合物和NT-proBNP抗体 偶合物通过如下步骤制成：
[0012] l)Dye-649NHSEster-ST2抗体偶合物W及Biotin-NT-proBNP抗体的制备；
[0013] 1.l)Dye-649NHSEster-ST2 抗体偶合物的制备；
[0014] ST2抗体溶于碳酸盐缓冲液（；0. 5MBoartebuffer,抑=8.W中，活化的 Dye-649N服Ester溶解于二甲基亚讽值MS0)中溶解，然后把ST2抗体加入碳酸盐缓冲液 (0.5MBoartebuffer,抑=8. 5)中混匀后，加入准备好的Dye-649畑SEster溶液，37度反 应1小时，反应完成后，将偶合物溶液转移至超滤管中进行纯化，并多次用1XPBS磯酸盐缓 冲液冲洗，直至超滤管的底部无游离的巧光分子，并计算纯化后的Dye-649N服Ester-ST2 抗体偶合物的标记个数；
[0015] 1. 2)Biotin-NT-proBNP抗体的制备；
[0016] NT-proBNP抗体溶于磯酸盐缓冲液（PBS)中，活化的生物素炬iotin)溶解于二 甲基亚讽值MS0)中保证其活化度，然后把生物素炬iotin)加入溶于磯酸盐缓冲液（PBS) 中的NT-proBNP抗体溶液中，25度反应30分钟，反应完成后，将溶液转移至超滤管中，W 4000巧m并多次纯化，直至超滤管底部无游离的生物素炬iotin)，并计算每个NT-proBNP抗 体可能结合的生物素炬iotin)个数；
[0017] 2)DyLi曲t-800畑SEster-SAV的制备；
[001引抗链霉亲和素（SAV)粉末溶于磯酸盐缓冲液（PBS)中活化，然后把溶于磯酸盐缓 冲液牌巧中的抗链霉亲和素（SAV)快速溶解巧光素粉末，并加入碳酸盐缓冲液化05M Boratebuffer)进行缓冲，室温反应1小时，反应完成后，将溶液超滤离屯、浓缩，并