一种水貂肠炎细小病毒的间接免疫荧光检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种试剂盒，特别设及一种水貂肠炎细小病毒的间接免疫巧光检测试 剂盒，属于免疫学领域。
【背景技术】
[0002] 水貂细小病毒性肠炎是由细小病毒科细小病毒亚科水貂肠炎细小病毒（Mink enteritisvirus，MEV)感染水貂引起的一种急性，烈性传染病，发病率和死亡率高，是危害 水貂养殖业的=大疫病之一。该病在1947年加拿大的威廉堡首发，之后在各养殖国家均有 发生。我国在1974年首次发现此病。近年来，随着人们生活水平的提高，水貂养殖业蓬勃 发展，对貂种的需求量日益增大，每年从国外进口大量水貂，国内各貂场频繁调剂貂种，加 之养殖环境管理不当，虽然每年有灭活疫苗预防免疫，但是免疫失败常有发生，局部地区常 有突然的，剧烈的该病的流行，给养殖业带来了巨大的经济损失。
[0003] 该病的诊断主要通过临床症状初步诊断，确诊还需要实验室进行。实验室诊断有 PCR检测、血凝实验和病毒分离实验。传统的方法固然有实用性，但是也有弊端，血凝实验诊 断方法具有简单、快速等优点。但由于在MEV存在无血凝性的毒株MEV-S，因此该方法存在 漏检的可能。另外，诊断时所用的猪或猴红细胞需为新鲜红细胞，不仅HA敏感性受供血个 体的影响较大，而且其保存期短，限制了该种诊断方法的推广应用。病毒分离鉴定是实验室 常用的鉴定方法，但该方法耗费的时间较长，常常遇到MEV接种敏感细胞CWK或F81W后， 不一定会出现肉眼可见的明显的拉丝样的病变，且病变不宜与细小病毒属的其他病毒如水 貂阿留申病毒的感染区分。PCR方法用于检测病毒的核酸，具有很高的敏感性和特异性，但 容易出现假阳性。因此，建立特异的诊断和筛查方法对降低水貂细小病毒性肠炎的发病率 至关重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的在于提供一种水貂肠炎细小病毒的间接免疫巧光检测试剂 盒，该试剂盒操作简单，特异性好，敏感性高，耗时短，可W实现高通量检测；
[0005] 本发明的第二个目的在于提供一种使用W上所述的试剂盒在制备检测水貂肠炎 细小病毒试剂中的应用；
[0006] 本发明的第=个目的在于提供用于建立W上所述试剂盒的单克隆抗体及分泌该 单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0007] 本发明的第四个目的在于提供所述的杂交瘤细胞株W及单克隆抗体在制备检测 水貂肠炎细小病毒试剂中的用途。
[000引为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
[0009] 本发明通过超速离屯、的方法，纯化水貂肠炎细小病毒，将纯化后的水貂细小病毒 免疫6~8周龄雄性健康纯系BALB/c小鼠，抗原剂量为lOOug/只，一免采用弗氏完全佐剂 抗原进行腹腔注射，间隔14d后进行第二次免疫，腹腔注射含弗氏不完全佐剂含的同剂量 抗原，=免注射同剂量的不含佐剂的抗原，=免结束后检测抗体效价。细胞融合前=天腹腔 注射加强免疫一次。
[0010] 免疫结束后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞按常规方法进行细胞融合。筛选方法；用 纯化的MEVB做包被抗原，ELISA方法检测融合细胞上清中的抗体，筛选阳性杂交瘤细胞，并 亚克隆后扩大培养，注射BALB/c小鼠腹腔内诱生腹水。
[0011] 经化ISA检测筛选，获得1株分泌抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体的阳性杂交瘤 细胞株，命名为ZL1，分类命名为水貂肠炎细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院 微生物研究所，其微生物保藏号为；CGMCCNO. 10881，保藏时间为2015年6月3日。
[0012] 进一步的，本发明还提供了由所述的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
[0013] 再进一步的，本发明又提供了所述的单克隆抗体在制备检测水貂肠炎细小病毒试 剂中的用途。
[0014] 本发明利用得到的单克隆抗体建立了一种水貂肠炎细小病毒的间接免疫巧光检 测试剂盒，其特征在于，包括抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体；
[0015] 所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌产生，所述的杂交瘤细胞株命名为化1，保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏编号为CGMCCNO. 10881。
[0016] 在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、稀释液、洗漆液、终 止液和山羊抗鼠FITC-IgG。
[0017] 在本发明中，优选的，所述阳性对照为MEVB毒株接种于细胞培养板上生长为单层 的F81细胞；所述阴性对照为正常F81细胞；所述稀释液包括抗水貂肠炎细小病毒单克隆 抗体稀释液和山羊抗鼠FITC-IgG稀释液，抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体稀释液为含3% 灭活的山羊血清的TBS缓冲液，山羊抗鼠FITC-IgG稀释液为含3%灭活的山羊血清和l%o 伊文思藍的TBS缓冲液；所述洗漆液为含0. 3M甘氨酸的TBST缓冲液；所述终止液为50% 的甘油。
[0018] 在本发明的一个具体实施例中，优选的，所述的试剂盒包括：
[0019] 玻片和细胞培养板；用于待检样品抹片或者由接种待检样品无菌过滤的悬液的细 胞包被细胞培养板；
[0020] 抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体；单克隆抗体是由保藏编号为CGMCCNO. 10881 的杂交瘤细胞株分泌产生；
[0021] 稀释液；稀释液包括抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体稀释液和山羊抗鼠 FITC-IgG稀释液，抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体稀释液为含3%灭活的山羊血清的TBS 缓冲液，山羊抗鼠FITC-IgG稀释液为含3%灭活的山羊血清和1%。伊文思藍的TBS缓冲液；
[0022] 洗漆液：含0. 3M甘氨酸的TBST缓冲液；
[0023] 阳性对照；MEVB毒株接种于细胞培养板上生长为单层的F81细胞；
[0024] 阴性对照；正常F81细胞；
[0025] 终止液；50 %的甘油。
[0026] 本发明还提供了利用所述的试剂盒在制备检测水貂肠炎细小病毒试剂中的应用。
[0027] 在本发明中，优选的，包括W下步骤：
[002引 （1)待检样品抹片干燥或其悬液过滤除菌后接种于生长成细胞单层的F81细胞培 养板上48-6化后，洗漆；同时做阴性对照和阳性对照；（2)加入预冷的固定液固定，洗漆；
[0029] (3)加入抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体，37°C解育，洗漆；
[0030] (4)加入山羊抗鼠FITC-IgG，37°C解育，洗漆；最后加终止液终止反应，巧光显微 镜观察，出现特异的亮绿色巧光者为阳性，反之为阴性。
[0031] 为了确定出最佳反应条件，本发明在不同反应条件下，对水貂肠炎细小病毒单抗 和山羊抗鼠FITC-IgG二抗分别系列稀释后做棋盘滴定，W巧光强度高为评价指标，确定 它们的最佳使用浓度；然后固定水貂肠炎细小病毒单抗和山羊抗鼠FITC-IgG二抗的使用 浓度分别检测固定液、抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体（30min、45min和60min)和山羊 抗鼠FITC-IgG(45min、60min和90min)对检测效果的影响，选取巧光强度较高者作为最 佳的解育时间。经试验确定抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体的稀释倍数为1:100 ;山羊抗 鼠FITC-IgG的稀释倍数为1:100 ;固定液、抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体W及山羊抗鼠 FITC-IgG的作用时间分别为30min、45min和60min;
[0032] 在本发明中，优选的，所述阳性对照为MEVB毒株接种于细胞培养板上生长为单层 的F81细胞；所述阴性对照为正常F81细胞；所述固定液为4°C预冷的体积分数为70%的己 醇溶液；所述洗漆液为含0. 3M甘氨酸的TBST缓冲液；所述终止液为50 %的甘油。
[0033] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0034] 本发明利用单克隆抗体，建立诊断水貂肠炎细小病毒的间接免疫巧光检测方法。 该方法提高了对该病诊断的特异性，可W实现对该病的特异性诊断，在细胞水平上直接观 察到病毒感染细胞的部位。MEV间接免疫巧光检测方法的建立，提供了诊断MEV的新方法。
【附图说明】
[0035] 图1为纯化水貂肠炎细小病毒颗粒的电镜结果图；
[0036] 图2为显微镜下杂交瘤细胞ZL1的染色体图；其中，A图和B图均为其中一细胞染 色体图；
[0037] 图3为单克隆抗体ZL1的Westernblot分析结果；其中，M;蛋白质分子质量，标 准，1 ;ZL1杂交瘤细胞上清，2 ;SP2/0细胞上清；
[003引图4为显微镜下接种MEVB的F81细胞图；其中，A;正常F81细胞；B;接种MEVB毒 株组；
[0039] 图5为单克隆抗体ZL1的间接免疫巧光鉴定结果；其中，A;接种MEVB毒株组；B; 免疫巧光对照组（正常F81细胞）；
[0040] 图6为单克隆抗体ZL1与市售犬细小病毒单克隆抗体间接免疫巧光检测结果比对 图；其中，A图为单克隆抗体ZL1按照1:50的比例稀释后的间接免疫巧光图，B图为市售国 产单抗按照1:50的比例稀释后的间接免疫巧光图，C图为单克隆抗体ZL1按照1:100的比 例稀释后的间接免疫巧光图