一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子测量领域，特别涉及一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量 方法。
【背景技术】
[0002] 下箴刺桐碱又名海帕刺桐碱，CAS号487-58-1，分子式C14H18N2O 2，是豆科相思子属 和刺桐属植物中常见的生物碱。下箴刺桐碱能明显抑制小鼠耳廓肿胀，减少小鼠耳廓重量； 增加小鼠胸腺、脾脏重量，提高小鼠血清溶血素水平；明显降低〇：1 4和异硫氰酸萘酯所致的 肝损伤小鼠血清转氨酶活性及胆红素含量，保护肝损伤。小鼠实验提示海帕刺桐碱具有明 显的抗炎、增强免疫和降酶退黄、抗肝损伤作用，是鸡骨草等药材的有效成分之一，下箴刺 桐碱的结构与植物生长激素之一的生长素相似，均含吲哚基，但却是生长素拮抗剂，通过抑 制植物根毛的伸长而发挥作用。
[0003] 色氨酸分子含有吲哚基，结构与下箴刺桐碱、生长素的相似，微溶于乙醇，不溶于 氯仿、乙醚，在稀酸或稀碱中溶解。
[0004] 生长素、色氨酸、下箴刺桐碱的定量方法主要是液相色谱法、毛细管电泳法和酶连 免疫分析法。但这些方法存在仪器较贵或者检测费用高、样品处理步骤比较复杂、消耗时间 比较长等局限。
[0005] 荧光光谱法是利用物质吸收较短波长的光波后发射较长波长特征光谱的性质，对 物质定性或定量分析的方法，该方法灵敏度高，选择性强。
[0006] 色氨酸的定量很早就已经运用荧光方法，通常用三氯醋酸除去蛋白质后添加甲醛 与三氯化铁使色氨酸的荧光衍产物生成后以激发波长350nm，发射波长450nm进行测量，作 用原理是色氨酸与甲醛缩合成环状，经三氯化铁氧化成荧光较强的去甲哈尔曼，但此法也 没有考虑生长素和下箴刺桐碱等其他含吲哚基物质对测定结果的影响。
[0007] 下箴刺桐碱、色氨酸、生长素分子内都含吲哚基，均具天然荧光。单独存在时，各自 的荧光强度与其浓度具有良好的线性关系，但三者的荧光光谱几乎完全重叠，当激发波长 280nm时发射波长为350nm，因此三者混合时无法直接用荧光光谱法分别定量，虽然根据三 者的的亲水性可以用有机溶剂（乙酸乙酯）将生长素分离，但下箴刺桐碱与色氨酸的亲水 性非常接近，无法用常见的溶剂进行萃取分离，这样，在下箴刺桐碱的定量过程中，色氨酸 成了一种难以除去的杂质。
【发明内容】
[0008] 本发明为在色氨酸杂质存在条件下一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量 方法，其前处理时间短、检测成本低、能快速大批量检测。
[0009] 实现本发明目的的技术方案是：
[0010] 一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法，包含如下步骤：
[0011] 1)配制色氨酸标准溶液，绘制色氨酸标准曲线；
[0012] 2)配制色氨酸标准溶液与下箴刺桐碱标准溶液，测定标准混合溶液的荧光强度， 绘制混标准合液的标准曲线；计算混合标准溶液中色氨酸质量浓度（A)与下箴刺桐碱质量 浓度⑶的比值U(U = A/B)
[0013] 3)线性关系曲线1的绘制
[0014] 4)线性关系曲线2的绘制
[0015] 5)推导下箴刺桐碱的浓度的计算公式
[0016] 6)下箴刺桐碱溶液浓度的确定
[0017] 步骤1)中配制一定浓度梯度的色氨酸溶液，测定其荧光强度，以浓度值为横坐 标，对应各浓度值的荧光强度为纵坐标绘制色氨酸溶液标准曲线；
[0018] 步骤2)中配制色氨酸标准溶液与下箴刺桐碱标准溶液，并按一定体积比混合，计 算混合标准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐碱质量浓度B的比值U并记录；
[0019] 步骤3)中测定标准混合溶液的荧光强度X，空白对照组（蒸馏水）的荧光强度为 X。，在试管中分别滴加甲醛，静置1小时，再测定添加甲醛后的混合溶液的荧光强度Y，空白 对照组（蒸馏水中滴加甲醛）的荧光强度为Y。，
[0020] W = Y/X (1)
[0021] 式中W为横坐标，以色氨酸与下箴刺桐碱的质量浓度之比U为纵坐标，得到线性关 系曲线1 ;
[0022] 步骤4)中使用步骤2)试管中色氨酸质量浓度在步骤1)中对应的荧光强度值记 为Z，空白对照组如蒸馏水的荧光强度为Z。，计算减去空白值后的值Z'与减去空白值后的 不添加甲醛的色氨酸荧光强度值t之比V，以每只试管添加甲醛与不添加甲醛的测量值 之比W'为横坐标，以V为纵坐标，得线性关系曲线2 ;
[0023] 步骤5)中色氨酸标准曲线线性方程为
[0024] Tr =mA+n (2)
[0025] 线性关系曲线1的线性方程为
[0026] U = kff+j (3)
[0027] 线性关系曲线2的线性方程为
[0028] V = pff ; +q (4)
[0029] 推导下箴刺桐碱的浓度P的计算公式为
[0030] p = [V (X 一 X0) 一 n]/mU (5)
[0031] 即：
[0033] 其中X为不添加甲醛测得的待测液荧光强度，Y为添加甲醛后待测液的荧光强度， XD、Yc分别为添加甲醛前后空白对照的荧光强度，P的浓度单位与测定色氨酸标准曲线时A 的单位相同，P的单位为μ g/L。公式（6)的建立；
[0034] 步骤6)中取1份体积的待测下箴刺桐碱溶液，加9份pH7. 4磷酸氢二钠/磷酸二 氢钠缓冲溶液，试测此稀释液的荧光强度，荧光强度应在1000至4000范围内，若荧光强度 过高，可再适当稀释，并记录稀释倍数；测得合适的荧光强度X后，按步骤5)中的公式计算 出稀释后下箴刺桐碱溶液的浓度，再根据稀释倍数，计算出原溶液中下箴刺桐碱的浓度。
[0035] 有益效果
[0036] 本发明为一种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法，能直接用荧光光谱法 在色氨酸杂质存在条件下定量下箴刺桐碱的荧光量，避免色氨酸杂质对测试结果的影响， 本法前处理时间短、检测成本低、能快速大批量检测。
【附图说明】
[0037] 图1为添加等体积的浓度为40%甲醛前后，下箴刺桐碱溶液的荧光光谱；
[0038] 图2为添加等体积的浓度为40%甲醛前后，色氨酸溶液的荧光光谱；
[0039] 图3为色氨酸的荧光标准曲线；
[0040] 图4为线性关系曲线1 ;
[0041] 图5为线性关系曲线2。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合附图对本发明作进一步的阐述，但不是对本发明的限定。
[0043] 实施例
[0044] -种基于荧光定量法的下箴刺桐碱浓度测量方法，包含如下步骤：
[0045] 1)配制色氨酸标准溶液，绘制色氨酸标准曲线；
[0046] 2)配制色氨酸标准溶液与下箴刺桐碱标准溶液，测定标准混合溶液的荧光强度， 绘制混标准合液的标准曲线；计算混合标准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐碱质量浓 度B的比值U
[0047] 3)线性关系曲线1的绘制
[0048] 4)线性关系曲线2的绘制
[0049] 5)推导下箴刺桐碱的浓度的计算公式
[0050] 6)下箴刺桐碱溶液浓度的确定
[0051] 步骤1)中配制一定浓度梯度的色氨酸溶液，测定其荧光强度，以浓度值为横坐 标，对应各浓度值的荧光强度为纵坐标绘制色氨酸溶液标准曲线；
[0052] 步骤2)中配制色氨酸标准溶液与下箴刺桐碱标准溶液，并按一定体积比混合，计 算混合标准溶液中色氨酸质量浓度A与下箴刺桐碱质量浓度B的比值U并记录；
[0053] 步骤3)中测定标准混合溶液的荧光强度X，空白对照组（蒸馏水）的荧光强度为 X。，在试管中分别滴加甲醛，静置1小时，再测定添加甲醛后的混合溶液的荧光强度Y，空白 对照组（蒸馏水中滴加甲醛）的荧光强度为Y。，
[0054] W = Y/X (1)
[0055] 式中W为横坐标，以色氨酸与下箴刺桐碱的质量浓度之比（U)为纵坐标，得到线性 关系曲线1 ;
[0056] 步骤4)中使用步骤2)试管中色氨酸质量浓度在步骤1)中对应的荧光强度值记 为Z，空白对照组如蒸馏水的荧光强度为Z。，计算减去空白值后的值Z'与减去空白值后的 不添加甲醛的色氨酸荧光强度值t之比V，以每只试管添加甲醛与不添加甲醛的测量值 之比W'为横坐标，以V为纵坐标，得线性关系曲线2 ;
[0057] 步骤5)中色氨酸标准曲线线性方程为
[0058] Τ' = mA+n (2)
[0059] 线性关系曲线1的线性方程为
[0060] U = kff+j (3)
[0061] 线性关系曲线2的线性方程为
[0062] V = pff ; +q (4)
[0063] 推导下箴刺桐碱的浓度P的计算公式为
[0064] P = [V (X - X0) - n]/mU (5)
[0065] 艮P :
[0067] 其中X为不添加甲醛测得的待测液荧光强度，Y为添加甲醛后待测液的荧光强度， XD、Yc分别为添加甲醛前后空白对照的荧光强度，P的浓度单位与测定色氨酸标准曲线时A 的单位相同，P的单位为μ g/L。公式（6)的建立；
[0068] 步骤6)中取1份体积的待测下箴刺桐碱溶液，加9份pH7. 4磷酸氢二钠/磷酸二 氢钠缓冲溶液，试测此稀释液的荧光强度，荧光强度应在1000至4000范围内，若荧光强度 过高，可再适当稀释，并记录稀释倍数；测得合适的荧光强度X后，按步骤5)中的公式计算 出稀释后下箴刺桐碱溶液的浓度，再根据稀释倍数，计算出原溶液中下箴刺桐碱的浓度。 [0069] 下箴刺桐碱与色氨酸都具有天然荧光，在添加等体积的甲醛（浓度为40% )前后， 下箴刺桐碱溶液的荧光光谱如图1所示，可见荧光强度降低了一半。在添加等体积的甲醛