实时荧光定量pcr方法鉴定转基因植物中t-dna串联重复序列的拷贝数的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的 拷贝数的方法。
【背景技术】
[0002] 农杆菌介导的植物遗传转化是将外源基因导入植物基因组的一个有效可行的方 法，它已被广泛应用于如黄金水稻等作物的遗传工程中，是当代分子生物学的重要实验方 法。在农杆菌的转化过程中经常出现多个T-DNA插入同一个位点和多插入位点的频繁出 现，这些T-DNA串联重复结构经常会导致目标基因的共抑制甚至是基因沉默，从而影响后 续的实验。因此，一个高效简便的筛选单拷贝转基因植物的方法对研宄植物的遗传改良和 基因功能等方面有着重要的意义。
[0003] 传统的DNA印记（Southern blot)对于检测转基因植物中基因的拷贝数是非常有 效和实用的方法。但是当有大量的转基因株系需要检测时，用Southern blot这个方法就会 非常得费时费力。此外，Southern blot实际上检测的是转基因插入位点的数量，只有在转 基因植物基因组酶切位点非常接近串联结构时，Southern blot可检测到转基因的拷贝数， 而其他情况下，Southern blot均无法准确的检测转基因的拷贝数。实时焚光定量PCR技 术最近被广泛用于转基因植物拷贝数的检测，例如：水稻、甘蔗、棉花等。前人的研宄表明， 利用定量PCR来筛选大量的转基因植物是一种可行的方式。然而还无法确定这种方法能否 在有大量转基因株系的情况下快速、准确的定量T-DNA的拷贝数。
[0004] 尽管有些研宄已经证明，T-DNA串联重复结构是在进行植物转化过程之后形成的， 但是T-DNA串联重复结构的形成机理还不是完全清楚。总所周知，在T-DNA整合到基因组 DNA的过程中，植物DNA的插入位点和T-DNA的末端会有小的缺失，T-DNA的串联重复序列 会含有T-DNA和质粒的同源序列。然而，更深入的了解T-DNA重复之间填充的序列可能对 完全阐明T-DNA重复的形成有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中 T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法。
[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现的。
[0007] -种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方 法，步骤包括：
[0008] 通过农杆菌介导的植物转化方法将含有筛选基因BAR的植物表达载体pSKI015连 接上HMGA基因，转入到野生型Col-4拟南芥中，获得了 300个独立转基因株系；
[0009] 使用两个参考质粒如序列表，该两个参考质粒都含有一个编码拟南芥高迀移率蛋 白HMGA的内参基因，其中一个质粒是将HMGA基因与PSKI015载体上的BAR基因连接，另一 个质粒是将HMGA基因与含有左边界LB和右边界RB的T-DNA正向重复序列连接，分别形成 TOPO_HMGA_BAR 和 TOPO_HMGA_LR 两个参考质粒；
[0010] 将经过草甘膦筛选的转基因拟南芥的RNA进行提取，反转录获得CDNA作为检测的 模板，分别使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物进行实用定量PCR的方式检测突变 体植物的拷贝数；
[0011] 计算公式：
【主权项】
1. 一种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方 法，其特征在于，步骤包括： 通过农杆菌介导的植物转化方法将含有筛选基因 BAR的植物表达载体pSKI015连接上 HMGA基因，转入到野生型Col-4拟南芥中，获得了 300个独立转基因株系； 使用两个参考质粒如序列表，该两个参考质粒都含有一个编码拟南芥高迀移率蛋白 HMGA的内参基因，其中一个质粒是将HMGA基因与PSKIOl5载体上的BAR基因连接，另一个 质粒是将HMGA基因与含有左边界LB和右边界RB的T-DNA正向重复序列连接，分别形成 TOPO_HMGA_BAR 和 TOPO_HMGA_LR 两个参考质粒； 将经过草甘膦筛选的转基因拟南芥的RNA进行提取，反转录获得cDNA作为检测的模 板，分别使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物进行实用定量PCR的方式检测突变体 植物的拷贝数； 计算公式：
t代表目标T-DNA基因，r代表HMGA基因 艮的公式：Rt= (FatXFJ/Fbt2 Fat，Fet，Fbt分表代表植物目标基因的荧光强度。
2. 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复 序列的拷贝数的方法，其特征在于，（1)应用PCR引物5'actttcccaaattgctttttaaaatcc和 5' tgacaataatgaatgtttagcattacc，通过PCR方法克隆HMGA基因的DNA全长序列，酶切后连 接到植物表达载体PSKI015上，得到pSKI015-HMGA载体。
3. 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复 序列的拷贝数的方法，其特征在于，（2)将构建好的PSKI015-HMGA载体转化农杆菌GV3101， 转化后的农杆菌在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选，抗性菌落再经PCR引物 actttcccaaattgctttttaaaatcc 和 tgacaataatgaatgtttagcattacc 验证 HMGA 基因的 有无，含有目的基因的农杆菌再经液体LB的培养，使菌液OD6cJ直达到0. 8-1. 2,将没有开放 的拟南芥花序在前述准备好的农杆菌的菌液中浸没1分钟，避光保湿处理一天，之后，将拟 南芥放到正常条件下生长，以获得转基因种子，将收获的种子接种在具有草甘膦的抗性筛 选培养基上，进行转基因植物的筛选，筛选获得的转基因拟南芥提取RNA，反转录。
4. 根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序 列的拷贝数的方法，其特征在于，（1)中植物生长在16小时-18小时的光/暗条件下的人 工气候室，光强为230 μ E/min/m2,温度为20°C /17°C。
【专利摘要】本发明公开了一种实时荧光定量PCR方法鉴定转基因植物中T-DNA串联重复序列的拷贝数的方法，步骤包括：通过农杆菌介导的植物转化方法将含有筛选基因BAR的植物表达载体pSKI015连接上HMGA基因，转入到野生型Col-4拟南芥中；使用两个参考质粒连接载体；将经过草甘膦筛选的转基因拟南芥的RNA进行提取，反转录获得cDNA作为检测的模板，分别使用草甘膦抗性基因和HMGA基因的定量引物进行实用定量PCR的方式检测突变体植物的拷贝数。本发明的有益效果在于可以有效屏蔽T-DNA串联结构对识别转基因植物拷贝数的影响，而且定量PCR与Southern blot相比更加方便高效。
【IPC分类】A01H5-00, C12N15-65, C12N15-84, C12Q1-68
【公开号】CN104745696
【申请号】CN201510128008
【发明人】魏书, 席玉珍, 刘晶晶, 宋大鹏
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月23日