专利名称：实时荧光定量rt-pcr检测东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中实时荧光定量RT-PCR检测东部马脑炎病毒和西部马 脑炎病毒的试剂盒。
背景技术：
东部马脑炎病毒(easternequine encephalitis virus, EEEV)和西部马脑炎病 毒(western equine encephalitis virus, WEEV)为披膜病毒科甲病毒属内两种抗原性相 近的病毒，主要流行于美洲地区。它们均通过蚊虫传播，可感染马，鸟及人类，并可引起严重 的脑炎症状。EEEV感染的致死率可达36%，是致死率最强的脑炎病毒之一。TOEV对成人毒 性较低，但儿童感染可产生严重脑炎，死亡率大约10%。但均有较严重的神经系统后遗症。 尽管目前中国国内尚没有东方马脑炎病毒和西方马脑炎病毒感染的报道，但他们一但输入 传播，将会严重危害人民健康，因此建立灵敏的可同时检测EEEV和TOEV的检测方法，对于 该病的传播控制具有重要意义。由于WEEV和EEEV强烈的致病性，目前已有一些检测方法的研究，临床上已得到应 用的有间接血凝抑制(IHI)，ELISA方法检测病人抗血清及RT-PCR方法等。除此之外，实验 室研究应用的还有普通多重RT-PCR及实时定量RT-PCR等，普通RT-PCR方法需要进行凝胶 电泳，实验耗时，且结果无法定量。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测马脑炎病毒的试剂盒。本发明所提供的检测马脑炎病毒的试剂盒，包括如下⑴和(2)所示的引物对(1) EEEV 上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT，EEEV 下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT ；(2) WEEV 上游弓丨物AGGGATACCCCCGAAGGTT ；WEEV 下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT。所述试剂盒包括如下(3)和⑷所示探针(3)探针序列为 5 ‘ -AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC-3 ‘，在序列 AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC 的 5'端连接荧光基团 HEX，3'端连接淬灭剂 TAMRA ；(4)探针序列为 5 ‘ -CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG-3 ‘，在序列 CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG的5 ‘端连接荧光基团FAM，3 ‘端连接淬灭剂TAMRA。所述马脑炎病毒为东部马脑炎病毒和/或西部马脑炎病毒。本发明的另一个目的是提供检测马脑炎病毒的实时定量PCR试剂。本发明所提供的检测马脑炎病毒的实时定量PCR试剂，由如下⑴和⑵所示的 引物对、如下(3)和(4)所示探针以及实时荧光定量反转录PCR扩增缓冲液和酶液组成；(I)EEEV 上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT，
EEEV 下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT ；(2) WEEV 上游弓丨物AGGGATACCCCCGAAGGTT，WEEV 下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT ；(3)探针序列为 5 ‘ -AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC-3 ‘，在序列 AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC 的 5'端连接荧光基团 HEX，3'端连接淬灭剂 TAMRA ；(4)探针序列为 5 ‘ -CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG-3 ‘，在序列 CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG的5 ‘端连接荧光基团FAM，3 ‘端连接淬灭剂TAMRA ；(1)所示引物对中各引物在实时定量PCR试剂中的浓度均为500nmol/L ；(2)所示引物对中各引物在实时定量PCR试剂中的浓度均为250nmol/L ；所述实时荧光定量反转录PCR扩增缓冲液和酶液购自Qiagen公司。所述(3)所示探针在实时定量PCR试剂中的浓度为250nmol/L ；所述(4)所示探针在实时定量PCR试剂中的浓度为150nmol/L。所述马脑炎病毒为东部马脑炎病毒和/或西部马脑炎病毒。本发明的又一个目的是提供如下(1)和(2)所示的引物对在制备检测马脑炎病毒 的试剂盒中的应用(1) EEEV 上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT，EEEV 下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT ；
(2) WEEV 上游弓丨物AGGGATACCCCCGAAGGTT，WEEV 下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT。所述马脑炎病毒为东部马脑炎病毒和/或西部马脑炎病毒。本发明的又一个目的是提供如下(1)和(2)所示的引物对和如下(3)和(4)所示 的探针在制备检测马脑炎病毒的试剂盒中的应用(1) EEEV 上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT，EEEV 下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT ；(2) WEEV 上游引物 AGGGATACCCCCGAAGGTT，WEEV 下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT ；(3)探针序列为 5 ‘ -AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC-3 ‘，在序列 AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC 的 5'端连接荧光基团 HEX，3'端连接淬灭剂 TAMRA ；(4)探针序列为 5 ‘ -CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG-3 ‘，在序列 CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG的5'端连接荧光基团FAM，3'端连接淬灭剂TAMRA。所述马脑炎病毒为东部马脑炎病毒和/或西部马脑炎病毒。本研究设计了 TOEV和EEEV的实时定量PCR检测的试剂盒，利用体外培养病毒的 RNA作为模板，该试剂盒可用于检测EEEV和TOEV，具有较好的灵敏性和特异性，能检测到 EEEV的最低病毒滴度为0. 2TCID5(1/ml，能检测到TOEV病毒滴度为lTCID5(1/ml。
图1为对WEEV的灵敏性检测的标准曲线。图2为对EEEV的灵敏性检测的标准曲线。图3为对TOEV的灵敏性检测结果。
图4为对EEEV的灵敏性检测结果。图5为EEEV模拟标本的检测结果。图6为TOEV模拟标本的检测。图7为阴性对照的实时定量RT-PCR扩增结果。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、实时荧光定量RT-PCR检测东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的试剂盒 及其应用一、引物和探针的设计利用SDS2. 0软件进行设计。西部马脑炎病毒(WEEV)的实时定量检测引物和探针 选自病毒结构蛋白E3区域，东部马脑炎病毒(EEEV)的实时定量检测引物和探针选择病毒 非结构蛋白NSP3区域，通过序列比对分析，与其他病毒的序列同源性小于50%。TOEV和 EEEV的检测引物和探针序列见表1。表IWEEV和EEEV的检测弓丨物和探针序列
引物或探针名称序列(5' —3')起始核苷酸位置
EEEV上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT5236EEEV下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT5296EEEV荧光探针HEX-AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC-TAMRA5265WEEV上游引物AGGGATACCCCCGAAGGTT8247WEEV下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT8329WEEV荧光探针FAM-CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG- TAMRA8301二、反应体系的建立和优化1、样品的准备将西部马脑炎病毒WEEV毒株McMiIlan(McMiIlan病毒株，GenBank登录号 GQ287640. 1，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载 过该材料的非专利文献是Nagata LP, Hu WG, Parker Μ, Chan D, Rayner GA etal.， Infectivity variation and genetic diversity among stains of western equine enc 印 halitisvirus，J. Gen. Virol. 2006,87, 2353-2361)和东部马脑炎病毒 EEEV 毒 株 SSP. NorthAmerican Variant(SSP. North American Variant 病毒株，GenBank 登录 号X63135，公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载 过该材料的非专利文献是Volchkov. V E，Volchkova. V. A. and Netesov SV, Complete nucleotidesequence of the Eastern equine encephalitis virus genome, Mol· Gen. Mikrobiol. Virusol. 1991,5,8-15)分别接种 BHK-21 细胞(购自 ATCC, CAT. CCL 10)， 2-3天后细胞出现明显病变，收集细胞培养上清，并测定培养上清中的病毒滴度，EEEV 2X 107TCID50/ml, WEEV 107TCwID50/ml ； TCID (tissue culture infective dose)。同时培养基孔肯亚病毒(公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行 病研究所获得，记载过该材料的非专利文献是施华芳，张海林，自登云，李兆祥等，云南首 次从患者体内分离到基孔肯亚病毒，中国人兽共患病杂志，1990年第一期)、乙型脑炎病毒 日本乙型脑炎病毒(JEV)(公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 获得，记载过该材料的非专利文献是杨银辉，朱晓光，张永国，康晓平等。利用基因芯片 技术对一株未知病毒的筛查与鉴定。中华检验医学杂志，2007，30 (12) :1360-1363)、森林 脑炎病毒(公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载过该 材料的非专利文献是胡玉洋，杨银辉，刘洪，康晓平，朱晓光，司炳银，祝庆余，森林脑炎病 毒(TBEV)实时定量TaqMan PCR检测方法的建立，解放军医学杂志2006，31，745-748)、登 革病毒2型(公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载过 i亥才才 禾Utfiid :Murthy HM, Clum S, Padmanabhan R. Dengue virus NS3 serine protease. Crystal structure and insightsinto interaction of the active site with substrates by molecular modeling and structuralanalysis ofmutational effects. J Biol Chem，1999，274(9) :5573_5580.)、圣路易脑炎病毒(公众可从中国人民解放军 军事医学科学院微生物流行病研究所获得，记载过该材料的非专利文献是Phillpott RJ, Venugopal K，Brooks Τ. Immunization with DNA polynucleotidesprotects mice against lethal challenge with St. Louis encephalitis virus. Arch. Virol. 1996， 141 :743-749)、辛德比斯病毒(公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研 究所获得，记载过该材料的非专利文献是熊鸿燕，刘育京等，短波紫外线与交联淀粉碘对 血浆中辛德比斯病毒灭活的研究，中国消毒学杂志，1998年第四期)作为阴性对照。提取 WEEV (McMi 11 an病毒株.)和 EEEV (SSP. North American Variant 病毒株)培养病毒的 RNA， 10倍系列稀释后作为实时定量RT-PCR反应的模板。同时提取基孔肯亚病毒、乙型脑炎病 毒、森林脑炎病毒、登革病毒2型、圣路易脑炎病毒、辛德比斯病毒RNA作为该反应体系的阴 性对照。病毒培养和RNA提取均在BSL-3级生物安全实验室中进行。2、病毒感染细胞，进行毒力滴定将WEEV和EEEV的培养上清分别进行10倍系列稀释(10-108，共8个浓度，10倍 系列稀释)，每个稀释浓度的病毒上清分别感染培养于96孔细胞板中的BHK-21细胞(购自 ATCC,CAT. CCL 10)，每个细胞孔接种IOOul，每个浓度重复4个孔。同时设未感染病毒的正 常细胞对照。接种后每日观察不同浓度下的细胞生长情况，连续观察7日。若病毒成功感 染培养细胞并增埴，则可使细胞病变并死亡。将可致4个复孔中2个细胞孔内出现明显的 病变死亡的病毒量定义为ITCID5tl，通过观察各个微孔中细胞病变情况确定病毒培养上清原 液中的病毒滴度。结果表明，上述病毒培养上清原液中EEEV的病毒滴度为2X 107TCID5Q/ml，WEEV 的病毒滴度为107TCID5Q/ml。3、反应体系的优化为了提高检测的灵敏度，本研究优化了反应体系中的引物和探针浓度，确定了 最佳的反应条件。首先分别取东方马脑炎病毒EEEV的引物浓度125nmOl/L、250nmol/L、 375nmol/L、500nmol/L、625nmol/L、750nmol/L进行检测，探针及其他反应成分的浓度保持不变。以系列稀释的RNA模板进行检测，选取检测到的RNA含量极限最低的引物浓度为合适 的检测浓度，进而对探针的检测浓度进行优化，选取东方马脑炎病毒的探针浓度IOOnmol/ L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L、300nmol/L进行检测，选取检测到的RNA含量极限最 低的探针浓度为合适的检测浓度。然后采取相同的方法对WEEV的引物和探针浓度进行摸 索，同样以能检测到的RNA含量极限最低的引物及探针浓度为合适的检测浓度。4、最优反应体系的建立反应体系中含有实时荧光定量反转录PCR扩增反应液、上游引物、下游引物、荧光 探针和模板，其中，上游引物序列和下游引物序列分别为EEEV 上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT (序列表中序列 1)禾口EEEV 下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT (序列表中序列 2)；WEEV 上游引物AGGGATACCCCCGAAGGTT (序列表中序列 3)禾口WEEV 下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT (序列表中序列 4)；荧光探针序列为EEEV 荧光探针HEX-AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC-TAMRA (探针序列为序列 表中序列5)，WEEV 荧光探针FAM-CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG-TAMRA(探针序列为序列表中 序列6)。所述实时荧光定量反转录PCR扩增反应液由实时荧光定量反转录PCR扩增缓冲液 (Qiagen 公司产品，Quanti-tect Probe RT-PCR kit, cat. 204443)和酶系混合液(Qiagen 公司产品，Quanti-tect Probe RT-PCR kit, cat. 204443)组成。
所建立的反应体系如下
实时荧光定量反转录PCR扩增反应液缓冲液
酶系混合液
EEEV上游引物IOmM
EEEV下游引物IOmM
WEEV上游引物IOmM
WEEV下游引物IOmM
EEEV荧光探针IOmM
WEEV荧光探针IOmM
RNA模板
补水至
10 μ L 0. 2μ L 1 μ L(终浓度 500nmol/L) 1 μ L(终浓度 500nmol/L) 0. 5 μ L(终浓度 250nmol/L) 0. 5 μ L(终浓度 250nmol/L) 0. 5 μ L(终浓度 250nmol/L) 0. 3 μ L(终浓度 150nmol/L) 2μ L 20 μ L
三、实时荧光定量RT-PCR检测TOEV和EEEV的灵敏性和特异性 分别提取实验二中病毒培养上清原液中WEEV和EEEV病毒的RNA，所提取的TOEV 的RNA所对应的病毒滴度为107TCID5(1/ml，10倍系列稀释，共8个稀释度，所对应的病毒滴 度为Io6TciD5c1Ail-Iir1TCID5c1Ail,各稀释度对应的病毒滴度值具体见表2，分别作为实时定 量PCR反应的模板；EEEV的RNA所对应的病毒滴度为2 X 107TCID50/ml，10倍系列稀释，共8 个稀释度，所对应的病毒滴度为2 X 106TCID5(1/ml-2 X IiT1TCID5cZml，各稀释度对应的病毒滴 度值具体见表2，分别作为实时定量RT-PCR反应的模板。同时提取基孔肯亚病毒、乙型脑炎 病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、圣路易脑炎病毒、辛德比斯病毒RNA作为建立该反应体系的阴性对照。病毒培养和RNA提取均在BSL-3级生物安全实验室中进行。分别以上述系列稀释的TOEV和EEEV的RNA作为模板，进行实时定量RT-PCR反 应，确定该检测方法的灵敏性，同时取6个阴性对照基孔肯亚病毒、乙型脑炎病毒、森林脑 炎病毒、登革病毒、圣路易脑炎病毒和辛德比斯病毒脑炎相关病毒的RNA作为模板，验证该 检测方法的特异性。使用的仪器为Roche LightCycler2.0。反应体系如步骤二中所示。扩增条件为50°C反转录30min，然后95°C加热IOmin以灭活反转录酶，进而进行 扩增反应95°C 15s，55°C lmin，共45个循环。反应过程中，在55°C退火过程中进行荧光检 测，530nm波长检测TOEV的扩增，560nm波长检测EEEV的扩增。检测结果如下(1)阴性对照结果阴性对照的检测结果见图7，图7中A图为560nm波长下的扩增 结果，反应了 EEEV引物及探针的扩增特异性；B图为530nm波长下的扩增结果，反应了 TOEV 引物及探针的扩增特异性。A图和B图中每条扩增曲线所显示的荧光强度均未能随着循环 数的增加而出现指数增长，扩增结果表明这6个阴性对照模板均未能扩增，表明该扩增体 系及设计的引物和探针具有较好的特异性。(2)TOEV灵敏度结果不同稀释倍数下的WEEV样品的检测结果如图3和表2所示。 以CP值<38的扩增结果判断为阳性。CP值为每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光域 值时所经历的循环数。荧光域值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍。以每个稀释度的对数值为横坐标，以其对应的CP值为纵坐标，绘制标准曲线，结 果如图1所示。在二重反应体系中，所能检测到的TOEV的最低病毒滴度为lTCID5(1/ml，每个反应 体系所出现的信号均为单一通道的信号，说明该检测体系无交叉反应出现。实验设3次重复，结果均一致。(3) EEEV灵敏度结果不同稀释倍数下的EEEV样品的检测结果如图4和表2所示。以CP值<38的扩 增结果判断为阳性。以每个稀释度的对数值为横坐标，以其对应的CP值为纵坐标，绘制标准曲线，结 果如图2所示。在二重反应体系中，所能检测到的EEEV的最低病毒滴度为0. 2TCID5(1/ml，每个反 应体系所出现的信号均为单一通道的信号，说明该检测体系无交叉反应出现。实验设3次重复，结果均一致。表2实时定量RT-PCR检测
权利要求
检测马脑炎病毒的试剂盒，包括如下(1)和(2)所示的引物对(1)EEEV上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT，EEEV下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT；(2)WEEV上游引物AGGGATACCCCCGAAGGTT，WEEV下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括如下(3)和(4)所示 的探针(3)探针序列为5 ‘ -AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC-3 ‘,在序列 AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC 的 5'端连接荧光基团 HEX，3'端连接淬灭剂 TAMRA ；(4)探针序列为5 ‘ -CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG-3 ‘，在序列 CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG的5'端连接荧光基团FAM，3'端连接淬灭剂TAMRA。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述马脑炎病毒为东部马脑炎病 毒和/或西部马脑炎病毒。
4.检测马脑炎病毒的实时定量PCR试剂，由如下(1)和(2)所示的引物对、如下(3)和 (4)所示探针以及实时荧光定量反转录PCR扩增缓冲液和酶液组成；(1)EEEV上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT， EEEV 下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT ；(2)WEEV 上游引物AGGGATACCCCCGAAGGTT， WEEV 下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT ；(3)探针序列为5 ‘ -AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC-3 ‘，在序列 AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC 的 5'端连接荧光基团 HEX，3'端连接淬灭剂 TAMRA ；(4)探针序列为5 ‘ -CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG-3 ‘，在序列 CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG的5'端连接荧光基团FAM，3'端连接淬灭剂TAMRA ；(1)所示引物对中各引物在实时定量PCR试剂中的浓度均为500nmol/L；(2)所示引物对中各引物在实时定量PCR试剂中的浓度均为250nmol/L。
5.根据权利要求4所述的实时定量PCR试剂，其特征在于 所述⑶所示探针在实时定量PCR试剂中的浓度为250nmol/L ； 所述(4)所示探针在实时定量PCR试剂中的浓度为150nmol/L。
6.根据权利要求4或5所述的实时定量PCR试剂，其特征在于所述马脑炎病毒为东 部马脑炎病毒和/或西部马脑炎病毒。
7.如下(1)和(2)所示的引物对在制备检测马脑炎病毒的试剂盒中的应用(1)EEEV上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT， EEEV 下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT ；(2)WEEV 上游引物AGGGATACCCCCGAAGGTT， WEEV 下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述马脑炎病毒为东部马脑炎病毒和/ 或西部马脑炎病毒。
9.如下(1)和(2)所示的引物对和如下(3)和(4)所示的探针在制备检测马脑炎病毒 的试剂盒中的应用(1)EEEV上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT， EEEV 下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT ；(2)WEEV 上游引物AGGGATACCCCCGAAGGTT， WEEV 下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT ；(3)探针序列为5 ‘ -AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC-3 ‘，在序列 AGCAGCCTACCTTTCCGACAATGGTTGTC 的 5 ‘端连接荧光基团 HEX，3 ‘端连接淬灭剂 TAMRA ；(4)探针序列为5 ‘ -CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG-3 ‘，在序列 CTTTCGAATGTCACGTTCCCATGCG的5'端连接荧光基团FAM，3'端连接淬灭剂TAMRA。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述马脑炎病毒为东部马脑炎病毒和/ 或西部马脑炎病毒。
全文摘要
本发明公开了实时荧光定量RT-PCR检测东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒的试剂盒。本发明所提供的检测马脑炎病毒的试剂盒，包括如下(1)和(2)所示的引物对(1)EEEV上游引物TGTGCGTACCTCCTCATCGTT，EEEV下游引物GACTGGCGTGAATCTCTGCT；(2)WEEV上游引物AGGGATACCCCCGAAGGTT，WEEV下游引物GTGAATAGCACACGGGTGGTT。该试剂盒可用于检测EEEV和WEEV，具有较好的灵敏性和特异性，能检测到EEEV的最低病毒滴度为0.2TCID50/ml，能检测到WEEV病毒滴度为1TCID50/ml。
文档编号C12Q1/70GK101967524SQ20101029189
公开日2011年2月9日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者刘洪 , 常国辉, 康晓平, 户义, 李裕昌, 李靖, 杨银辉, 林方, 祝庆余, 蔡绪禹 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所