专利名称：多拷贝高效表达重组菌丝霉素的毕赤酵母的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及重组菌丝霉素基因多拷贝表达载体及其重组酵母的制备方法。
背景技术：
菌丝霉素(Plectasin)是Mygind等从真菌(腐生子囊菌，the saprophytic ascomycete Pseudoplectania nigre 11a)中分离得到首例防御素(Mygind et al.， Nature, 2005,437 :975 980)。其高级结构包含一个α - β模型，由一个α -螺旋和两个反平行的β-折叠组成，由三个二硫键稳定(Cys4-Cys30，Cysl5-Cys37，Cysl9-Cys39)。菌丝霉素高抗革兰氏阳性菌、无细胞毒性、无溶血性及脑脊液渗透性好，在治疗革兰氏阳性菌病方面具有相当大的潜力，是具有治疗潜能的新的肽抗生素。采用基因工程手段构建菌丝霉素基因工程菌，相对于化学合成和直接从生物组织中提取的方式以其生产工艺简单，成本低廉等优点。中国专利申请号为201010115149. 6的发明专利申请公开了一种酵母工程菌制备重组菌丝霉素的方法，但该方法存在如下不足1)主要为单拷贝整合，表达量有限；幻发生多次自发交换产生多拷贝基因的概率极低，幻筛选多拷贝的工作量大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种重组菌丝霉素基因多拷贝表达载体及其重组酵母的制备方法，该方法采用同尾酶法体外构建菌丝霉素多拷贝表达盒，一次整合即可将多个表达盒插入酵母染色体，有效提高菌丝霉素在酵母中的表达丰度，实现其廉价生产。本发明采用如下技术方案，其特征在于该方法，包括以下步骤(一 )菌丝霉素基因所述来源于真菌的菌丝霉素基因优选自腐生子囊菌假黑盘菌(the saprophytic ascomycete Pseudoplectania nigrella)(专利号为 201010115149. 6)中经过密码子优化改造得到的菌丝霉素基因(SEQ ID NO. 1)核苷酸序列。( 二)重组菌丝霉素单拷贝表达载体的构建所述的表达载体衍生于酵母表达载体，优选的，所述酵母表达载体为pPIC系列表达载体，优选的，所述的表达载体采用PPICZ α Α。所述的单拷贝表达载体含有一个拷贝的菌丝霉素表达盒，所述的菌丝霉素表达盒包括以下元件(a)起始信号元件为醇氧脱氢酶强启动子(AOX)；(b) α -因子信号肽基因及融合在其C端的菌丝霉素基因；(c)终止信号元件为AOX(TT)；在菌丝霉素基因的5'-端设计限制性内切酶BioI酶切位点，并保留了 BioI酶切位点后的酵母Kex2切割位点(KR)编码序列，以便分泌表达后信号肽的切割获得重组
3Plectasin，在基因3'-端设计TAATAA终止子序列及)(ba I酶切位点，以便多肽表达的终止及载体构建，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，菌丝霉素基因片段经 Xho I和)(ba I双酶切后克隆至经相同酶切后的表达载体pPICZ α A上，构建重组表达载体 pPICPlectasin。(三)重组菌丝霉素多拷贝表达载体的构建所述的多拷贝表达载体中含有2个以上，更优选4-16个，最优选4-8个串联排列
的菌丝霉素表达盒。将菌丝霉素单拷贝表达载体pPICPlectasin经BglII和BamHI双酶切，得到含有醇氧化酶基因启动子、α -信号肽因子、菌丝霉素基因、醇氧化酶基因末端终止子的完整表达盒序列作为串联单元，连接到经BglII单酶切的表达载体pPICPlectasin上，利用BglII 和BamHI同尾酶的特性(同向连接后连接处序列发现变化使BglII和BamHI无法识别)，可以反复酶切连接操作，构建获得一系列菌丝霉素多拷贝表达载体。(四)重组菌丝霉素不同拷贝酵母的构建及拷贝数的鉴定所述的酵母优选为毕赤酵母，所述的毕赤酵母优选毕赤酵母X-33。重组菌丝霉素多拷贝表达载体pPICPlectasinQn)经内切酶BglII线性化处理， 电击转化毕赤酵母X-33，将电击后的混合液涂布在含100 μ g/ml Zeocin的YPDS平板上， ^TC培养至出现菌落，经菌落PCR鉴定阳性转化子，甘油管保存阳性转化子。酵母基因组提取试剂盒提取各阳性转化子基因组DNA，并根据菌丝霉素基因序列设计引物和探针FP 5~-GAGGCTGAAGCTGGTTTTGGT ； RP 5~-AATAGACTTACAATGGTTATGACATTGCA ；探针(Probe):
FAM-CCATGGGATGAAGATGA-MGB,以线性化单拷贝表达载体pPICPlectasin作为单拷贝标准品建立标准曲线，实时荧光定量PCR鉴定转化子的拷贝数。(五)重组菌丝霉素不同拷贝酵母的诱导表达将含不同菌丝霉素基因拷贝数的重组酵母接种在BMGY中，振荡培养使菌增殖至 OD = 5-6，离心收集菌体，将菌体重悬在BMMY中，使其OD值达到1. 0，在下进行甲醇诱导。每隔M小时补加甲醇至甲醇终浓度为0. 5%，在摇瓶水平比较重组菌丝霉素不同拷贝酵母的表达量，发现菌丝霉素单拷贝和四拷贝转化子拷贝数与表达量存在线性关系。通过附图和实施例对本发明具体实施方式
进行说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
图1.重组菌丝霉素单拷贝表达载体pPICPlectasin示意2.菌丝霉素多拷贝表达载体构建示意3.菌丝霉素单拷贝、二拷贝、四拷贝、八拷贝表达载体Bglll/BamHI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析1，6 =DNA分子量标准；2-5 单拷贝，二拷贝、四拷贝、八拷贝37 °C酶切4h图4.实时荧光定量PCR验证毕赤酵母菌丝霉素多拷贝转化子整合拷贝数标准曲线用红色表示；各拷贝样品用蓝色表示图5. Tricine-SDS-PAGE检测多拷贝转化子120h发酵液上清
1-4 菌丝霉素单拷贝，二拷贝，四拷贝，八拷贝转化子诱导120h的发酵液上清；5:蛋白分子量标准
具体实施例方式下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如“分子克隆实验室手册” (New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。本发明的实施例中使用的毕赤酵母X33及pPIC系列表达载体pPICZ α A均购自 hvitrogen公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)，限制性内切酶购自 NEB 公司(New England Biolabs)。实施例1菌丝霉素基因工程菌的构建1. 1基于酵母偏爱密码子设计Plectasin的基因根据巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用的偏爱性(http://WWW. kazusa. or. jp/codon/)人工设计Plectasin的基因，所得序列如SEQ ID NO. 1所示。1. 2重组菌丝霉素单拷贝表达载体的构建在Plectasin基因的5’ -端设计了 Plectasin基因中不具备但载体多克隆位点上具有的限制性内切酶》ιοΙ酶切位点，并保留了 BioI酶切位点后的酵母Kex2切割位点 (KR)编码序列，以便分泌表达后信号肽的切割，获得重组Plectasin，在基因3’ -端设计 TAATAA终止子序列及^CbaI酶切位点，以便多肽表达的终止及载体构建所设计用于表达的 Plectasin基因，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，Xho I和)(ba I双酶切后克隆至》ιοΙ和)(ba I双酶切后的表达载体pPICZ α A上，构建重组菌丝霉素单拷贝表达载体pPICPlectasin (图1)，测序正确后转化并保存在大肠杆菌DH5 α中。1. 3重组菌丝霉素多拷贝表达载体的构建提取大肠杆菌DH5ci中重组菌丝霉素单拷贝表达载体pPICPlectasin，利用表达载体存在的一对同尾酶Bgl II/BamHI位点来构建重组菌丝霉素多拷贝表达载体 pPICPlectasin (2n).Plectasin单拷贝表达载体pPICPlectasin中含有的表达盒(pAOXl及目的基因)，约3.61Λ。单拷贝表达载体上下游侧翼分别为独个的Bgl II及BamH I位点。限制性内切酶BamH I、BglII为同尾酶，含目的基因的pPICPlectasin用Bgl II及BamH I消化分离表达盒(约1.61Λ)，用BglII单酶切获得线性质粒pPICPlectasin，将表达盒再插入线性质粒pPICPlectasin以产生串联重复表达盒，重复该插入程序可产生一系列逐渐增加数目表达盒的载体(图2)，用体外形成的多拷贝子转化毕赤酵母增加了多拷贝表达盒重组子出现的频率。图3为构建的Plectasin —，二，四和八拷贝重组载体，分别为3. 6,5. 2,8. 4和 14.8kb，经BamH I、Bgl II双酶切后产生的表达盒分别为1. 6、3. 2、6. 4和12. 8kb。1. 4菌丝霉素各拷贝表达载体转化筛选及拷贝数鉴定Bgl II线性化菌丝霉素二拷贝、四拷贝、八拷贝表达载体，电转化毕赤酵母X-33 感受态细胞及阳性转化子的筛选。甘油管保存阳性转化子。将鉴定的重组表达载体pPICPlectasin^i)经内切酶Bgl II线性化处理，电击转化(1.2Κν，25μΡ，400Ω)处理好的感受态毕赤酵母Χ_33，电击结束后，加入冰预冷的 IM山梨醇，混勻后转入离心管中，30°C静止浊；取适量样品涂YPDS平板(含100yg/mL Zeocin)，倒置培养至出现菌落。根据优化的菌丝霉素基因序列设计上下游引物F 1,-GTTTTGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCA-3~ ；Rl，-ACCACCCTTAGCACAGTAACCACCCTTGTAACCCTTAATA-3~。煮冻煮菌落PCR法检测转化子。琼脂糖凝胶(1 % )电泳检测PCR结果，甘油管保存阳性转化子。酵母基因组提取试剂盒提取各阳性转化子基因组DNA，并根据菌丝霉素基因序列设计引物和探针如下，实时荧光定量PCR鉴定转化子的拷贝数。 FP 5~-GAGGCTGAAGCTGGTTTTGGT ；RP 5~-AATAGACTTACAATGGTTATGACATTGCA ；探针(Probe)FAM-CCATGGGATGAAGATGA-MGB线性化单拷贝表达载体pPICPlectasin作为单拷贝标准品建立标准曲线。起始质粒拷贝数为5. 16X107，进行两倍梯度稀释，共10个梯度，每个梯度三个平行样品作为扩增的标准曲线。将提取的各拷贝转化子基因组稀释成50ng/y L作为PCR模板。荧光定量PCR反应体系
Template1.5 μ L
2XMix7.5 μ L
ROX0.3μ L
FP(200nM)0.3μ L
RP(200nM)0.3μ L
Probe(250nM)0.36 μ L
ddH204.99 μ L
Total 循环参数 启动50°C 预变性95°C 变性95°C 退火延伸60 0C
15μ L
2min 5min 15s
60s 循环40次
提取各拷贝转化子的毕赤酵母X-33基因组DNA进行荧光定量PCR验证(图4)，结果发现菌丝霉素单拷贝，二拷贝，四拷贝和八拷贝转化子的Ct值存在线性关系，即后者总比前者早一个循环达到荧光信号阈值，整个扩增曲线斜率为-3. 289, R2为0. 992，扩增效率为101.41%。其中单拷贝至八拷贝三个平行样品Ct值的平均值分别为32. 174,31.269, 30.019,28. 671。实施例2重组菌丝霉素的诱导表达的接种量接种鉴定正确的菌丝霉素二拷贝，四拷贝，八拷贝转化子至IOmL BMGY培养基中，300C，250rpm摇至OD600nm4. 0 (对数生长期，大约16_18h)；室温，2500g离心5min。弃上清，用50mL BMMY培养基重悬细胞至OD6tltlnmL 0 ；在250mL三角瓶中加入上述培养物，加盖4层灭菌纱布，放入摇床继续生长；每M小时，加甲醇至终浓度为0. 5%继续诱导；在下列的各个时间点，011，对11，4811，7211，9611，12011取11^培养基至1. 5mL离心管并测量该时间点的OD值，室温12000rpm离心2_;3min，诱导时间为120h。将菌悬液稀释为相同的 OD值，离心收集上清至离心管中，-20°C保存。Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明，单拷贝和四拷贝重组菌株120h的发酵上清液在约4. 4kDa处有明显加粗的条带，与菌丝霉素理论分子量相符，结合凝胶成像软件分析发现四拷贝转化子的菌丝霉素表达量是单拷贝转化子的 4倍(图5)，表达量和拷贝数之间存在线性关系。 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要书及其等同物界定。
权利要求
1.一种表达菌丝霉素的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞的染色体中整合有表达菌丝霉素的构建物，所述构建物含有2-16个串联排列的菌丝霉素表达盒，每个所述菌丝霉素表达盒包括以下元件(a)起始信号元件为醇氧脱氢酶强启动子(AOX) ； (b) α -因子信号肽基因及融合在其C端的菌丝霉素基因；(c)终止信号元件为AOX (TT)。所述酵母细胞在甲醇诱导下表达菌丝霉素，表达量与菌丝霉素基因拷贝数之间存在线性关系。
2.如权利要求1所述的表达菌丝霉素的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母或汉逊酵母，优选的，所述酵母细胞选自毕赤酵母，更优选的，所述酵母细胞选自毕赤酵母Χ-33。
3.如权利要求1所述的表达菌丝霉素的酵母细胞，其特征在于，所述的构建物衍生于酵母表达载体，优选的，所述酵母表达载体为PPIC系列表达载体，更优选的，所述的表达载体采用PPICZ α Α,且菌丝霉素基因包括SEQ ID NO. 1所示的序列。
4.一种构建物，其特征在于，所述构建物含有2-16个串联排列的菌丝霉素表达盒，每个所述菌丝霉素表达盒包括以下元件(a)起始信号元件为醇氧脱氢酶强启动子(AOX)； (b) α -因子信号肽基因及融合在其C端的菌丝霉素基因；(c)终止信号元件为AOX(TT)；
5.构建权利要求4所述的构建物的方法，其特征在于，所述方法包括(1)将菌丝霉素基因定点插入包括起始信号元件、信号肽和终止信号元件的质粒中，以获得单拷贝表达质粒；(2)对所述单拷贝表达质粒含有完整的菌丝霉素表达盒，其中，所述表达盒包含(a) 起始信号元件为醇氧脱氢酶强启动子(AOX) ； (b) α-因子信号肽基因及融合在其C端的菌丝霉素基因；(c)终止信号元件为AOX(TT)；(3)采用限制性内切酶BglII和BamHI粘性末端能互补的原则，通过反复酶切、连接和转化操作，将所述菌丝霉素表达盒重复插入所述质粒中，从而获得含有2-16个串联排列的菌丝霉素表达盒的构建物。
6.权利要求1所述的表达菌丝霉素的酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤用权利要求4所述的构建物转化酵母细胞，其所述的构建物整合入酵母染色体中， 从而获得权利要求1所述的表达菌丝霉素的酵母细胞。
全文摘要
本发明公开了一种多拷贝表达重组菌丝霉素的毕赤酵母的制备方法。该方法包括根据毕赤酵母翻译的密码子偏爱性，设计出菌丝霉素表达基因的序列；将优化的菌丝霉素基因融合在表达载体pPICZαA的α-因子信号肽C端，构建单拷贝表达载体，该载体含有由起始信号元件醇氧脱氢酶强启动子(AOX)、α-因子信号肽基因及融合在其C端的菌丝霉素基因和终止信号元件AOX(TT)等组成的菌丝霉素表达盒；利用限制性内切酶BglII和BamHI粘性末端能互补的原则，通过反复酶切、连接和转化操作，获得含菌丝霉素基因的不同拷贝串联表达盒的重组质粒，电转化毕赤酵母后，在甲醇诱导下能高效分泌表达菌丝霉素，表达量与菌丝霉素基因拷贝数之间存在线性关系。本发明所构建的多拷贝高表达酵母细胞可用于提高产量、降低成本，适于菌丝霉素的规模化生产。
文档编号C12R1/865GK102409003SQ201010291818
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者张军, 杨雅麟, 滕达, 王少然, 王建华 申请人:中国农业科学院饲料研究所