一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，包括以下步骤：a、改造并扩增菌丝霉素基因；b、构建酵母细胞中表达菌丝霉素基因的重组质粒pYES2-CPS-Plec；c、用重组质粒pYES2-CPS-Plec转化酿酒酵母INVSC1细胞；d、筛选阳性菌株，并进行酶切鉴定；e、培养转化菌，获得抗菌肽菌丝霉素菌液；f、对抗菌肽菌丝霉素的活性进行鉴定。本发明获得的菌丝霉素对大肠杆菌DH5α有明显的抑菌作用，且抑菌效果强于改造前的菌丝霉素。本发明采用的酿酒酵母表达系统具有以下优点：抑菌效果更好；生长速率快，易于高密度培养，产量高，无需采用甲醇诱导；表达分泌的蛋白产品易于分离纯化；具有多种翻译后修饰特性，如多肽折叠、糖基化、甲基化、乙酰化等；遗传背景清楚，易于对表达载体进行操作。
【专利说明】一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和基因工程【技术领域】，具体涉及一种用酿酒酵母生产菌丝霉 素的方法。
【背景技术】
[0002] 中国是畜牧养殖大国，每年生产的动物饲料达1亿吨以上，而在存放过程中因饲 料腐败变质引起的损失超过10亿元。目前解决这一问题普遍采用的措施是在饲料中添加 化学防腐剂，但残留在动物机体内的化学防腐剂不仅影响了畜禽产品的质量，还威胁到人 们的身体健康，如引发肠胃炎等疾病，影响肝、肾功能等。另一方面，由于在我国动物饲料中 长期大量地添加抗生素，严重影响动物消化道微生态平衡，造成一些病原菌耐药性的发生， 使得针对由这些病原菌所引起的感染所进行的预防和治疗变得非常困难。因此，替代化学 防腐剂和抗生素在动物养殖中的使用，真正实现畜牧业的和谐、健康发展是我国畜牧养殖 业急需攻克的难题。
[0003] 传统的抗生素是通过与微生物特定部位的受体结合，从而破坏微生物的正常结构 或阻断酶的活性及必要的代谢途径等来实现抑菌或杀菌的作用。微生物的靶位点发生简 单的基因突变就可对付抗生素的攻击，从而产生耐药性。与传统抗生素相比，微生物对抗 菌肽产生耐药性的过程则要困难很多。这是因为抗菌肽的主要作用机理是通过与细胞膜 上的氨基酸相互作用，以此穿透细胞膜、扼杀细菌，所以细菌必须改变膜的表面结构，即改 变相当部分的基因，才能对付抗菌肽的攻击，而这几乎是不可能的。抗菌肽的另一个突出 优点是抗菌谱广，传统抗生素只针对某一类细菌具有抗性，而抗菌肽通常对G+和G-菌均 具有抗性。此外，抗生素的残留问题越来越受到广泛的重视，而抗菌肽是一种小分子多肽， 在动物的消化道内可以被降解为氨基酸，因而不存在残留的问题。在国外，已有多种成熟 的抗菌肽产品在临床医疗中应用，而且取得了较好的效果。例如，来自两栖动物的抗菌肽 马盖宁（magainin)，已被用于某些感染性疾病的临床治疗；来自微生物的抗菌肽乳链菌素 (nisin)，已被美国FDA批准为血液防腐剂添加成分。我国在抗菌肽的研究方面还处于探索 阶段，在关键技术上还不成熟。抗生素残留已经成为我国畜产品走向国际市场的最大障碍 之一，因此发展具有自主知识产权的新型抗菌肽产品来替代化学防腐剂和抗生素的使用， 对于我国畜牧业的安全、健康、和谐发展具有重要意义。
[0004] 菌丝霉素是丹麦生物技术公司在2005年从腐生子囊菌的分泌蛋白中分离出的首 例真菌防御素。防御素是存在于动物和高等植物中的一类富含半胱氨酸的天然抗菌肽，它 们对多种微生物均具有较强的防御能力，因此，防御素是目前颇具吸引力的一类新型候选 抗菌药物。菌丝霉素的成熟功能片段只有40个氨基酸，其分子量约为4. 4KDa，其空间结构 由一个α-螺旋和两个反向平行的β-折叠组成是典型的防御素 CSa β结构。其生物学 活性主要表现为对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，尤其是对肺炎链球菌、脓性链球菌、金 黄色葡萄球菌等，菌丝霉素的抗菌方式类似于现在广泛使用的万古霉素。此外，菌丝霉素在 体外抑菌试验、动物试验及一些临床试验中表现出无细胞毒性、无溶血性、脑脊液渗透性好 等优势，且能有效治疗由肺炎链球菌引起的实验腹膜炎、肺炎小鼠，亦能有效杀灭对传统抗 生素有抵抗力的一些菌种，对引发肺炎、脑膜炎和链球菌性扁桃体炎的肺炎球菌也有疗效， 不产生耐药性，与传统使用的抗生素之间不存在交叉抗性，因此作为新一代抗生素替代品 具有巨大的发展潜力。
[0005] 现有的菌丝霉素表达系统目前有以下几个来源，1)从腐生子囊菌的分泌蛋白中分 离得到，但是含量很低且难以分离纯化；2)化学合成生产菌丝霉素周期短，但该方法成本 高昂；3)通过基因工程手段获得，主要是采用原核表达和真核表达系统。其中原核表达系 统虽表达量高、生长周期短，但其翻译后加工修饰体系不完善，表达产物活性低，且分离纯 化产物难度大。目前采用的真核表达系统大多都是甲醇营养型毕赤酵母，该方法能够高密 度发酵，但仍存在以下不足之处：抑菌效果有限；发酵周期长；发酵过程中必须添加大量甲 醇诱导表达，而甲醇易燃易爆且有毒，存在一定的危险性；发酵成本高，影响因素多；所以 目前的培养基和培养条件都还不成熟。
【发明内容】
[0006] 本发明为了克服现有技术存在的不足，如分离纯化难度大，生产周期长、成本高， 残留甲醇带来的危害，以及产物活性低等缺陷，提供一种利用酿酒酵母表达抗菌肽菌丝霉 素的方法。
[0007] -种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，包括以下步骤：
[0008] 合成并扩增菌丝霉素基因，序列见SEQ N01 ;利用该基因和启动子Ppgk基因，以及 α -信号肽基因构建能够在酵母中表达该菌丝霉素基因的重组质粒；然后用重组质粒转化 酿酒酵母；筛选阳性菌株，培养转化菌，最后获得抗菌肽菌丝霉素菌液。
[0009] 启动子Ppgk基因，全长793bp，序列见SEQ Ν02 ;α-信号肽基因，全长277bp，序列 见 SEQ N03。
[0010] 克隆启动子Ppgk基因的过程如下：
[0011] 以南阳K菌株基因组为模板，设计合成引物扩增启动子Ppgk基因；
[0012] 引物 Ppgk-Fl :5, GAG CAC CGG TTA TTT TAG ATT CCT GAC TTC AAC TC3'
[0013] 引物 Ppgk-F2 :5, CAG CCA GCT GTG TTT TTA TAT TTG TTG TAA AAA GTA G3,；
[0014] PCR 反应条件：94 °C 5min 预变性，94 °C 30s-59 °C 30s-72 °C 70s，30 个循环， 72°C 7min ;经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20°C备用；将得到的 Ppgk基因与T-载体连接，得到Ppgk-T载体，转化大肠杆菌DH5a菌株，37°C下，用Age I和 Pvu II双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定；
[0015] 克隆a -信号肽基因的过程如下：
[0016] 以质粒PPIC9K为模板，设计合成引物扩增a-信号肽基因；
[0017] 弓丨物 a -F1 :5' GCGCGGTACCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC3,
[0018] 引物 a-F2 :5, TATCAAATGCGGCCGCCGTAAGCTTCAGCCTCTCTTTTC 3,；
[0019] PCR 反应条件：94 °C 5min 预变性，94 °C 30s-59 °C 30s-72 °C 60s，30 个循环， 72°C 7min ;经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20°C备用；将得到的 a -信号肽基因与T-载体连接，得到a -信号肽-T载体，转化大肠杆菌DH5 a菌株，37°C 下，用Κρη I和Not I双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定；
[0020] 克隆改造后的菌丝霉素基因的过程如下：
[0021] 人工合成改造后的菌丝霉素成熟肽的DNA片段并将其保存于PMD19Simple质粒 中；再根据其基因序列人工设计合成一对特异引物，以保存于PMD19Simple质粒中的菌丝 霉素基因片段为模板通过PCR技术克隆扩增目的基因片段；
[0022] 引物 Plec F1 :5, GCG GCC GCA AGA TGG GTT TTG GTT GT3'
[0023] 引物 Plec R1 :5, TCT AGA CTT GTC GTC GTC TTA GTA ACA C3,；
[0024] PCR 反应条件：94 °C 5min 预变性，94 °C 30s-56 °C 30s-72 °C 20s，30 个循环， 72°C7min ;经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20°C备用；将得到的菌丝 霉素基因与T-载体连接，得到Plec-T载体，转化大肠杆菌DH5a菌株，37°C下，用Not I和 Xbal I双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定。
[0025] 构建重组质粒分泌型表达载体pYES2-CPS_Plec的过程如下：
[0026] 用Age I和Pvu II分别酶切pYES2载体和Ppgk-T载体，产物经1. 5 %琼脂糖凝胶 电泳后，回收Ppgk基因片段和pYES2载体片段；T4连接酶，16°C连接a得到pYES2-Ppgk载 体，转化大肠杆菌DH5 α菌株；转化后提取质粒DNA进行酶切鉴定；
[0027] 用Κρη I和Not I分别酶切pYES2_Ppgk载体和α -信号肽-Τ载体，产物经1. 5 % 琼脂糖凝胶电泳后，回收α -信号肽基因片段和pYES2_Ppgk载体片段；Τ4连接酶，16°C连 接2h得到pYES2-CPS载体，转化大肠杆菌DH5 α菌株；转化后提取质粒DNA进行酶切鉴定；
[0028] 用NotI、XbaI分别酶切pYES2-CPS载体和Plec-T载体，产物经1.5%琼脂糖 凝胶电泳后，回收菌丝霉素基因片段和PYES2-CPS载体片段；Τ4连接酶，16°C连接2h得到 pYES2-CPS-Plec载体，转化大肠杆菌DH5 α菌株；转化后提取质粒DNA进行酶切鉴定。
[0029] 所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，
[0030] 用重组质粒电转化酿酒酵母INVScl细胞；筛选阳性菌株，并进行鉴定，所述筛选 阳性菌株的方法是利用酿酒酵母尿嘧啶缺陷型培养基平板培养；
[0031] 然后用酿酒酵母尿嘧啶缺陷型液体培养基培养转化菌7?9天，获得抗菌肽菌丝 霉素菌液，沉淀并浓缩菌丝霉素，所述沉淀是用丙酮沉淀法，浓缩是用三氯醋酸法。
[0032] 重组质粒pYES2-CPS_Plec转化酿酒酵母INVScl的具体过程如下：
[0033] 1)制备酿酒酵母INVScl感受态细胞；
[0034] 2)转化质粒pYES2-CPS_Plec到酿酒酵母INVScl感受态细胞中：
[0035] ①取10ul的浓度为0· l-2ug/ul的pYES2-CPS-Plec质粒加入到80ul酿酒酵母感 受态细胞中，充分混合后转移到预冷的〇. 2cm规格的电击杯中，冰浴5min ;
[0036] ②电击仪参数：1500V，25uF，200欧，时间4-5ms进行电击；
[0037] ③立即向电击杯中加入预冷的山梨醇溶液，充分混合后；
[0038] ④30°C静置孵育lh后，取菌液涂布于酿酒酵母尿嘧啶缺陷型培养基平板上， 30°C，倒置培养至长出单克隆；
[0039] 3)酶切鉴定筛选阳性菌落：从酿酒酵母尿嘧啶缺陷型培养基平板上用枪头挑取 单菌落振荡培养，提取质粒DNA ;
[0040] 4)将上一步提取的质粒转化大肠杆菌DH5 α，提质粒，用Κρη I、Xba I酶切，选取 阳性质粒，在α信号肽上游设计一条检测引物，测序，确认α信号肽和菌丝霉素在同一读 码框内；
[0041] 测序引物：
[0042] Test Primer :5'-GGT ACC ATG AGA TTT CCT TC-3'。
[0043] 制备酿酒酵母INVScl感受态细胞的具体过程：
[0044] ①活化菌种，取10ul酿酒酵母INVScl冻存甘油菌至3πι1ΥΗ)液体培养基中，30°C， 200rpm过夜培养；
[0045] ②取300ul上述经活化的菌液至50πι1ΥΗ)液体培养基中，30°C，200rpm培养；
[0046] ③待上述菌液浓度达到0D600 = 1. 0?1. 3时，将菌液倒入50ml离心管中，置于 冰上lOmin后，4°C，3000rpm，离心5min收集细胞；
[0047] ④用50ml预冷的无菌水重悬细胞，4°C，3000rpm，离心5min后收集细胞；
[0048] ⑤重复步骤④；
[0049] ⑥用10ml预冷的lmol/L山梨醇重悬细胞，4°C，3000rpm，离心5min ;
[0050] ⑦用160ul预冷的lmol/L山梨醇轻轻吹打悬浮细胞，分装到1. 5ml的EP管中，每 管80ul,置于冰上待用。
[0051] 抗菌肽菌丝霉素酿酒酵母工程菌的表达：
[0052] 1)培养工程菌表达重组菌丝霉素：
[0053] ①转接200ul抗菌肽菌丝霉素酿酒酵母工程菌至20ml酿酒酵母尿嘧啶缺陷型液 体培养基中，30°C，200rpm过夜振荡培养；
[0054] ②测菌液的0D600值Y，按照公式X = (Y*20) /0. 4,计算将菌液0D600稀释到0. 4 所需要的SC-U液体培养基的量X ;
[0055] ③4-C，4000rpm，离心5min，弃上清，按照②中计算的X值加入酿酒酵母尿啼陡缺 陷型液体培养基，吹打重悬，混合均匀；
[0056] ④30°C，200rpm，振荡培养7?9天；
[0057] 2)丙酮沉淀蛋白；
[0058] 3)三氯醋酸沉淀浓缩，用于Tricine-SDS-PAGE电泳。
[0059] 丙酮沉淀蛋白的具体过程如下：
[0060] ①取10ml菌液，4000rpm离心5min，收集上清；
[0061] ②取4ml上清加入20ml-20°C预冷的丙酮，混匀；
[0062] ③静置于_20°C处理2h ;
[0063] ④ 4°C，12000rpm，离心 lOmin，弃上清；
[0064] ⑤加入200ul的无菌水溶解沉淀。
[0065] 三氯醋酸沉淀浓缩的具体过程如下：
[0066] 采用生工生物工程（上海）股份有限公司的试剂盒，
[0067] ①在丙酮沉淀处理后得到的蛋白溶液200ul中加入50ul沉淀液A，涡旋振荡10s， 混匀；
[0068] ② 4。(：孵育 lh;
[0069] ③ 4。。，12000rpm 离心 15min ;
[0070] ⑤加入600ul洗涤液B涡旋振荡10s ;
[0071] ⑥ 4°C，冷藏 lOmin 后，4°C，12000rpm 离心 15min 得沉淀；
[0072] ⑦在通风橱中倒掉上清，沉淀物通风瞭干30min ;
[0073] ⑧加入20ul溶解液C并涡旋振荡10s，如果溶液为黄色，加入1?5ul调和液S， 使其变为蓝色。
[0074] 本发明采用Tricine-SDS-PAGE作为鉴定方法对抗菌肽菌丝霉素进行鉴定。
[0075] 本发明的目的是提供一种菌丝霉素在酿酒酵母中高效表达的方法，本发明构建了 生产菌丝霉素的酿酒酵母表达菌株，其优点在于：表达量高，生长速率快，易于高密度培养， 适用于固体或液体发酵；发酵过程中，无需添加甲醇诱导，避免了因甲醇残留带来的危害； 表达分泌的蛋白产品易于分离纯化，产物纯度高；具有多种翻译后修饰特性，如多肽折叠、 糖基化、甲基化、乙酰化等；酿酒酵母遗传背景清楚，易于对表达载体进行操作；发酵条件 易控制，成本较低。
【专利附图】
【附图说明】
[0076] 图1为重组质粒pYES2-CPS_Plec的构建过程示意图；
[0077] 图2为启动子Ppgk基因的PCR扩增产物电泳图；
[0078] 图3为启动子Ppgk基因连T载体后的质粒DNA酶切鉴定电泳图；
[0079] 图4为α _信号肽基因的PCR扩增产物电泳图；
[0080] 图5为α -信号肽基因连τ载体后的质粒DNA酶切鉴定电泳图；
[0081] 图6为菌丝霉素基因的PCR扩增产物电泳图；
[0082] 图7为菌丝霉素连Τ载体后的质粒DNA酶切鉴定电泳图；
[0083] 图8为载体pYES2_Ppgk转化大肠杆菌后，提取质粒DNA的酶切鉴定电泳图；
[0084] 图9为载体pYES2-CPS转化大肠杆菌后，提取质粒DNA的酶切鉴定电泳图；
[0085] 图10为载体pYES2-CPS-Plec转化大肠杆菌DH5 α后，提取质粒的酶切鉴定电泳 图；
[0086] 图11为载体pYES2-CPS-Plec转化酿酒酵母后，提取质粒DNA的酶切鉴定电泳图；
[0087] 图12为本发明酿酒酵母工程菌培养液上清Tricine-SDS-PAGE电泳图；
[0088] 图13为本发明酿酒酵母工程菌培养液上清对大肠杆菌的活性检测图。
[0089] 图1包括A和B两部分。
[0090] 在图 2 中，泳道 Μ 为 D2000Plus marker(5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、 50(^?、25(^?、10(^?)，泳道1、2为启动子？?81^基因的？0?产物。
[0091] 在图3中，泳道Μ为D2000Plus marker，泳道1-6为Ppgk-T载体的酶切产物。
[0092] 在图 4 中，泳道 Μ 为 D2000marker (2000bp、lOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳 道1、2为α-信号肽基因基因的PCR产物。
[0093] 在图5中，泳道Μ为D2000marker，泳道1-4为a -信号肽-T载体的酶切产物。
[0094] 在图6中，泳道Μ为D2000marker，泳道1-4为菌丝霉素基因的PCR产物。
[0095] 在图7中，泳道Μ为D2000marker，泳道1-3为Plec-T载体的酶切产物。
[0096] 在图8中，泳道Μ为D2000marker，泳道1_4为pYES2_Ppgk载体转化大肠杆菌 DH5a的酶切产物。
[0097] 在图9中，泳道Μ为D2000marker，泳道1-4为pYES2-CPS载体转化大肠杆菌DH5 a 的酶切产物。
[0098] 在图10中，泳道Μ为D2000marker，泳道1-10为pYES2-CPS_Plec载体转化大肠杆 菌后的酶切产物。
[0099] 在图11中，泳道Μ为D2000marker，泳道1-4为pYES2-CPS-Plec载体转化酿酒酵 母的酶切产物。
[0100] 在图12中，Μ为Premixed Protein Marker，泳道1为阴性对照（空载体），泳道3 为菌丝霉素蛋白。
[0101] 在图13中，1为10ug氨苄青霉素，2为菌丝霉素未改造基因按照本发明方法制备 的工程菌培养216h 200ul上清，3为本发明酿酒酵母工程菌培养216h 200ul上清，4为无 菌水200ul。
【具体实施方式】
[0102] 以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作详细描述，而不会限制本发明。
[0103] 如图1所示，本发明的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其包括以下步骤：
[0104] a、启动子Ppgk基因 、α -信号肽基因及菌丝霉素基因的获得：克隆启动子Ppgk基 因，所述Ppgk基因来自南阳K菌株，全长793bp ;克隆α-信号肽基因，所述α-信号肽基 因是来自质粒PPIC9K，全长277bp ;合成改造的菌丝霉素基因，全长123bp ;
[0105] b、构建酵母细胞中表达菌丝霉素基因的重组质粒pYES2-CPS_Plec ;
[0106] c、用重组质粒pYES2-CPS_Plec转化酿酒酵母INVScl细胞，所述转化重组质粒的 方法是电转化法，采用Bio-red公司电转化仪预设PIC程序；
[0107] d、筛选阳性菌株，并进行鉴定，所述筛选阳性菌株的方法是利用酿酒酵母尿嘧啶 缺陷型培养基平板培养；
[0108] e、用酿酒酵母尿嘧啶缺陷型液体培养基在30°C，200rpm/min的条件下培养转化 菌7?9天，获得抗菌肽菌丝霉素菌液，沉淀并浓缩菌丝霉素，所述沉淀是用丙酮沉淀法，浓 缩是用三氯醋酸法；
[0109] f、对抗菌肽菌丝霉素进行鉴定，所述抗菌肽菌丝霉素采用Tricine-SDS-PAGE作 为鉴定方法。
[0110] 本发明一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法的具体操作过程为：
[0111] 1、启动子Ppgk基因、α-信号肽基因及菌丝霉素基因的获得
[0112] 克隆启动子Ppgk基因：
[0113] 以南阳K菌株（购于广东省微生物研究所）为模板，设计合成引物扩增启动子 Ppgk 基因（图 2)。PCR 反应条件：94°C 5min 预变性，94°C 30s-59°c 30s-72°c 70s，30 个循 环，72°C7min。经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20°C备用。将得到的 Ppgk基因与T-载体（购于宝生物工程（大连）有限公司）连接，转化大肠杆菌DH5a菌 株，37°C下，用Agel和Prv II双酶切筛选阳性菌株（图3)。送阳性菌液送公司测序分析验 证菌丝霉素基因序列的正确性。
[0114] 克隆α-信号肽基因：
[0115] 以质粒PPIC9K(购于长沙赢润生物技术有限公司）为模板，设计合成引物扩增 a -信号肽基因（图 4)。PCR 反应条件：94°C 5min 预变性，94°C 30s-59°C 30s-72°C 60s，30 个循环，72°C7min。经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20°C备用。将得 到的Ppgk基因与T-载体连接，转化大肠杆菌DH5a菌株，37°C下，用Κρη I和Not I双酶 切筛选阳性菌株（图5)。送阳性菌液送公司测序分析验证菌丝霉素基因序列的正确性。
[0116] 合成和克隆菌丝霉素基因：
[0117] 对NCBI GenBank中囷丝霉素成熟肤的基因序列进彳丁改造，改造后序列见序列表， 并将该DNA片段保存于PMD19Simple质粒（购于宝生物工程（大连）有限公司）中。再 根据其基因序列人工设计合成一对特异引物，以保存于PMD19Simple质粒中的菌丝霉素 (Plectasin)基因片段为模板通过PCR技术克隆扩增目的基因片段（图6)。PCR反应条件： 94°〇5!1^11预变性，941：3〇8-561：3〇8-721：2〇8,30个循环，721：71^11。经2%琼脂糖凝胶 电泳后，回收纯化目的片段，保存于_20°C备用。将得到的菌丝霉素基因与T-载体连接，转 化大肠杆菌DH5a菌株，37°C下，用NOT I和Xbal I双酶切筛选阳性菌株（图7)。送阳性 菌液送公司测序分析验证菌丝霉素基因序列的正确性。
[0118] 表1所用引物序列
[0119]
【权利要求】
1. 一种用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤： 改造菌丝霉素基因，合成并扩增菌丝霉素基因，序列见SEQ N01 ;利用该改造的基因和 启动子Ppgk基因，以及α -信号肽基因构建能够在酵母中表达该菌丝霉素基因的重组质 粒；然后用重组质粒转化酿酒酵母；筛选阳性菌株，培养转化菌，最后获得抗菌肽菌丝霉素 菌液。
2. 根据权利要求1所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于， 启动子Ppgk基因，全长793bp，序列见SEQ Ν02 ; α -信号肽基因，全长277bp，序列见 SEQ N03〇
3. 根据权利要求2所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于， 克隆启动子Ppgk基因的过程如下： 以南阳K菌株基因组为模板，设计合成引物扩增启动子Ppgk基因； 引物 Ppgk-Fl :5' GAG CAC CGG TTA TTT TAG ATT CCT GAC TTC AAC TC3, 引物 Ppgk-F2 :5' CAG CCA GCT GTG TTT TTA TAT TTG TTG TAA AAA GTAG3' ； PCR 反应条件：94°C 5min 预变性，94°C 30s-59°C 30s-72°C 70s，30 个循环，72°C 7min ; 经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20°C备用；将得到的Ppgk基因与 T-载体连接，得到Ppgk-T载体，转化大肠杆菌DH5a菌株，37°C下，用Age I和PvuII双酶 切筛选阳性菌株，测序鉴定； 克隆a-信号肽基因的过程如下： 以质粒PPIC9K为模板，设计合成引物扩增a-信号肽基因； 引物 a-Fl :5, GCGCGGTACCATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC3' 引物 a-F2 :5, TATCAAATGCGGCCGCCGTAAGCTTCAGCCTCTCTTTTC3,； PCR 反应条件：94°C 5min 预变性，94°C 30s-59°C 30s-72°C 60s，30 个循环，72°C 7min ; 经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20°C备用；将得到的a-信号肽基 因与T-载体连接，得到a-信号肽-T载体，转化大肠杆菌DH5a菌株，37°C下，用Κρη I和 Not I双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定； 克隆改造后的菌丝霉素基因的过程如下： 人工合成改造后菌丝霉素成熟肽的DNA片段并将其保存于PMD19Simple质粒中；再根 据其基因序列人工设计合成一对特异引物，以保存于PMD19Simple质粒中的菌丝霉素基因 片段为模板通过PCR技术克隆扩增目的基因片段； 引物 Plec F1 :5, GCG GCC GCA AGA TGG GTT TTG GTT GT3， 引物 Plec R1 :5, TCT AGA CTT GTC GTC GTC TTA GTA ACA C3,； PCR 反应条件：94°C 5min 预变性，94°C 30s-56°C 30s-72°C 20s，30 个循环，72°C 7min ; 经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目的片段，保存于-20°C备用；将得到的菌丝霉素基因 与T-载体连接，得到Plec-T载体，转化大肠杆菌DH5a菌株，37°C下，用Not I和Xbal I 双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定。
4. 根据权利要求3所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于， 构建重组质粒分泌型表达载体pYES2-CPS-Plec的过程如下： 用Age I和Pvu II分别酶切pYES2载体和Ppgk-T载体，产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳 后，回收Ppgk基因片段和pYES2载体片段；T4连接酶，16°C连接2h得到pYES2-Ppgk载体， 转化大肠杆菌DH5 α菌株；转化后提取质粒DNA进行酶切鉴定； 用KpnI和N0tI分别酶切pYES2-Ppgk载体和α-信号肽-T载体，产物经1.5(%琼脂 糖凝胶电泳后，回收a -信号肽基因片段和pYES2-Ppgk载体片段；T4连接酶，16°C连接2h 得到PYES2-CPS载体，转化大肠杆菌DH5 a菌株；转化后提取质粒DNA进行酶切鉴定； 用Not I、Xba I分别酶切pYES2-CPS载体和Plec-T载体，产物经1. 5 %琼脂糖凝 胶电泳后，回收菌丝霉素基因片段和PYES2-CPS载体片段；T4连接酶，16°C连接2h得到 pYES2-CPS-Plec载体，转化大肠杆菌DH5 α菌株；转化后提取质粒DNA进行酶切鉴定。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于， 用重组质粒电转化酿酒酵母INVScl细胞；筛选阳性菌株，并进行鉴定，所述筛选阳性 菌株的方法是利用酿酒酵母尿嘧啶缺陷型培养基平板培养； 然后用酿酒酵母尿嘧啶缺陷型液体培养基培养转化菌7?9天，获得抗菌肽菌丝霉素 菌液，沉淀并浓缩菌丝霉素，所述沉淀是用丙酮沉淀法，浓缩是用三氯醋酸法。
6. 根据权利要求5所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于， 重组质粒pYES2-CPS-Plec转化酿酒酵母INVScl的具体过程如下： 1) 制备酿酒酵母INVScl感受态细胞； 2) 转化质粒pYES2-CPS-Plec到酿酒酵母INVScl感受态细胞中： ① 取l〇ul的浓度为0. l-2ug/ul的pYES2-CPS-Plec质粒加入到80ul酿酒酵母感受态 细胞中，充分混合后转移到预冷的〇. 2cm规格的电击杯中，冰浴5min ; ② 电击仪参数：1500V，25uF，200欧，时间4-5ms进行电击； ③ 立即向电击杯中加入预冷的山梨醇溶液，充分混合后； ④ 30°C静置孵育lh后，取菌液涂布于酿酒酵母尿嘧啶缺陷型培养基平板上，30°C，倒 置培养至长出单克隆； 3) 酶切鉴定筛选阳性菌落：从酿酒酵母尿嘧啶缺陷型培养基平板上用枪头挑取单菌 落振荡培养，提取质粒DNA; 4) 将上一步提取的质粒转化大肠杆菌DH5a，提质粒，用Κρη I、Xba I酶切，选取阳性 质粒，在α信号肽上游设计一条检测引物，测序，确认α信号肽和菌丝霉素在同一读码框 内； 测序引物： 5'-GGT ACC ATG AGA ΤΤΤ CCT TC-3' 。
7. 根据权利要求6所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于， 制备酿酒酵母INVScl感受态细胞的具体过程： ① 活化菌种，取l〇ul酿酒酵母INVScl冻存甘油菌至3πι1ΥΗ)液体培养基中，30°C， 200rpm过夜培养； ② 取300ul上述经活化的菌液至50πι1ΥΗ)液体培养基中，30°C，200rpm培养； ③ 待上述菌液浓度达到0D600 = 1. 0?1. 3时，将菌液倒入50ml离心管中，置于冰上 lOmin 后，4°C，3000rpm，离心 5min 收集细胞； ④ 用50ml预冷的无菌水重悬细胞，4°C，3000rpm，离心5min后收集细胞； ⑤ 重复步骤④； ⑥ 用10ml预冷的lmol/L山梨醇重悬细胞，4°C，3000rpm，离心5min ; ⑦用160ul预冷的lmol/L山梨醇轻轻吹打悬浮细胞，分装到1. 5ml的EP管中，每管 80ul，置于冰上待用。
8. 根据权利要求5所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于， 抗菌肽菌丝霉素酿酒酵母工程菌的表达： 1) 培养工程菌表达重组菌丝霉素： ① 转接200ul抗菌肽菌丝霉素酿酒酵母工程菌至20ml酿酒酵母尿嘧啶缺陷型液体培 养基中，30°C，200rpm过夜振荡培养； ② 测菌液的0D600值Y，按照公式X = (Y*20) /0. 4,计算将菌液0D600稀释到0. 4所需 要的SC-U液体培养基的量X ; ③ 4-C，4000rpm，离心5min，弃上清，按照②中计算的X值加入酿酒酵母尿啼陡缺陷型 液体培养基，吹打重悬，混合均勻； ④ 30°C，200rpm，振荡培养7?9天； 2) 丙丽沉淀蛋白； 3) 三氯醋酸沉淀浓缩。
9. 根据权利要求8所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于， 丙酮沉淀蛋白的具体过程如下： ① 取10ml菌液，4000rpm离心5min，收集上清； ② 取4ml上清加入20ml-20°C预冷的丙酮，混匀； ③ 静置于_20°C处理2h ; ④ 4°C，12000rpm，离心 lOmin，弃上清； ⑤ 加入200ul的无菌水溶解沉淀。
10. 根据权利要求8所述的用酿酒酵母生产菌丝霉素的方法，其特征在于， 三氯醋酸沉淀浓缩的具体过程如下： 采用生工生物工程（上海）股份有限公司的试剂盒， ① 在丙酮沉淀处理后得到的蛋白溶液200ul中加入50ul沉淀液A，涡旋振荡10s，混 匀； ② 4°C孵育lh; ③ 4°C，12000rpm 离心 15min ; ⑤ 加入600ul洗涤液B涡旋振荡10s ; ⑥ 4°C，冷藏 lOmin 后，4°C，12000rpm 离心 15min 得沉淀； ⑦ 在通风橱中倒掉上清，沉淀物通风瞭干30min ; ⑧ 加入20ul溶解液C并涡旋振荡10s，如果溶液为黄色，加入1?5ul调和液S，使其 变为蓝色。
【文档编号】C12N15/81GK104232712SQ201410561507
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】夏新界, 崔延春 申请人:长沙中科晶博生物科技有限公司