专利名称：一种埃博霉素b的发酵生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于埃博霉素B的生产技术领域，涉及一种埃博霉素B的发酵生产工艺。
背景技术：
埃博霉素B (Epothilone B)是粘细菌纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)产生的一种聚酮次级代谢产物，它与临床上广泛应用的抗肿瘤化疗药物紫杉醇具有相同的稳定微管活性，且对紫杉醇耐药的肿瘤细胞具有活性。另外埃博霉素来源于微生物代谢产物的特征使其被人们认为是一种比紫杉醇类药物更具市场前途的抗癌药物。埃博霉素的发现可以追溯到上世纪八十年代德国国家生物技术研究中心(GBF) 的微生物学家对土壤中粘细菌的大量研究工作。1987年他们在寻找抗真菌药物时发现了一株粘细菌(Sorangium cellulosum So ce90)能产生一类具有微弱抗真菌活性的大环内酯类化合物，命名为Epothilone (埃博霉素)。当时这个化合物并没有引起研究人员的重视。 1995年默克实验室的研究人员发现了埃博霉素具有和紫杉醇类似的促微管聚合活性。从此，埃博霉素以其比紫杉醇更好的水溶性，更简单的结构，对紫杉醇抗性肿瘤细胞的高活性以及可以通过微生物发酵制备而迅速成为继紫杉醇之后发现的促微管聚合化合物中最令人兴奋的研究热点。目前诺华、施贵宝、默克、罗氏等大型跨国制药公司都在埃博霉素药物的临床研究上投入了大量的人力物力，美国FDA于2007年10月16日批准施贵宝公司的埃博霉素产品(Ixab印ilone，BMS-247550, IxempraTM，“伊沙匹隆”)单用或与卡培他滨合用治疗对其他化疗药物无效的转移性或局部晚期乳腺癌。预期未来将有多种埃博霉素药物上市。与临床研究相比，埃博霉素的生产技术远远落后。其主要的瓶颈在于发酵产量低， 粘细菌发酵制备埃博霉素的产量仅在mg/L发酵液水平。其中有两个重要原因，第一是埃博霉素对生产菌株的毒性和反馈抑制作用较大程度导致埃博霉素发酵产量很难提高；第二个导致埃博霉素生产成本高的原因是发酵结束后产物中存在大量埃博霉素同系物，导致目标产物分离纯化成本非常高。如何提高埃博霉素的发酵产量，降低生产成本成为目前埃博霉素药物研发的一个重要方向。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种埃博霉素B的发酵生产工艺，提高埃博霉素B的发酵生产能力，降低生产成本。本发明是通过以下技术方案来实现一种埃博霉素B的发酵生产工艺，包括以下步骤1)按IOOml接种1 IOmg菌种的比例，将纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum) 接种于发酵液中，然后加入菌种质量100 800倍的特异性吸附埃博霉素B的分子印迹聚合物，在25 :35°C下摇床发酵96 192h ；2)发酵完成后，分离并收集发酵液中的吸附了埃博霉素B的分子印迹聚合物，然后用甲醇多次萃取，将埃博霉素B从分子印迹聚合物中分离出来，分别收集含有埃博霉素B 的甲醇和分子印迹聚合物。所述的发酵液中含有黄豆粉20 50g/L、玉米淀粉5 10g/L、磷酸二氢钠1 2g/L、磷酸氢二钠 1 2g/L、MgS04 ·7Η20 2 5g/L、FeSO4 · 7Η20 0· 1 0. 5g/L、CaCl2 2 5g/L、MnCl2 0. 1 0. 5g/L 和葡萄糖 10 15g/L, pH 为 7. 2 7. 5。在发酵培养时还进行葡萄糖的补加在发酵培养的第1 4 每隔30min按每 IOOml发酵液加入0. 05 0. 2g葡萄糖的比例补加，在第48h至发酵结束每隔10 15min 按每IOOml发酵液加入0. 1 0. 4g葡萄糖的比例补加。所述的发酵液中还含有土豆淀粉、葡聚糖、甘露糖中的一种，其含量为5 10g/L ；所述的发酵液中还含有蛋白胨、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、黄豆粉、KN03、NH4SO4中的一种作为氮源，氮源的含量为2 8g/L。所述的分子印迹聚合物的制备为按照埃博霉素B:功能单体交联剂引发剂溶剂=1 0 6) (20 30) (0.6 1) (3 20)的摩尔比，将上述反应原料加入到反应容器中，在保护气氛下超声振荡20 30min，在搅拌下通入氮气20 30min ；然后在45 55°C下聚合反应12 24h,再在55 65°C下聚合反应8 12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40 60 μ m的聚合反应物；所述的功能单体为甲基丙烯酸；所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；将收集的聚合反应物用水充分洗涤后，然后用乙酸甲醇体积比=1 9 3 7 的混合溶液连续洗涤，脱去埃博霉素B，冷冻干燥后得到埃博霉素B的分子印迹聚合物。所述的引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰；所述的溶剂为去离子水、甲醇或乙腈。所述的摇床的转速为100 160r/min。所述的纤维堆囊菌(Sorangiumeellulosum)为 ATCC15384、ATCC25569 或 ATCC25531。所述的纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)为经过理化诱变、原生质体融合或 Genome shuffling改造而筛选到的高产菌株。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的埃博霉素B的发酵生产工艺，通过以下改进1)添加特异性吸附埃博霉素B的分子印迹聚合物；幻对培养基的改进，包括对碳源、氮源的组合；幻葡萄糖的脉冲式的补加以消除葡萄糖抑制效应；更进一步还可以对纤维堆囊菌进行理化诱变、杂交或原生质体融合而筛选到的高产菌株，从而提高埃博霉素B的产量。在埃博霉素B发酵生产时添加特异性吸附埃博霉素B的分子印迹聚合物，这样在发酵时分子印迹聚合物在达到吸附平衡之前将持续的吸附发酵时产生的埃博霉素B，解决了埃博霉素B发酵时的反馈抑制作用，实现连续液体发酵生产埃博霉素B ；另一方面，埃博霉素B被分子印迹聚合物吸附，也有利于其在发酵产物中的分离，只要离心分离收集作为沉淀的分子印迹聚合物，就可以将其从发酵液中分离，然后再从分子印迹聚合物将埃博霉素B萃取出来就可以了，而分子印迹聚合物经过干燥处理还可以重复使用。在添加分子印迹聚合物和葡萄糖的脉冲式的补加以后，埃博霉素B的产量达到了48mg/L，与目前的发酵生产水平O^ig/L)相比提高了 1倍。而培养基的进一步优化可分别取一种碳源，一种氮源和共有成分组成液体培养基，分析各个培养基的发酵产量，优选出最优碳源和氮源。
图1为改进工艺后的埃博霉素B产量分析的HPLC谱图。
具体实施例方式本发明通过在进行发酵时将添加作为吸附剂的分子印迹聚合物，以便于埃博霉素 B的连续生产和分离，以及培养基和葡萄糖补充两个方面的改进，以提高埃博霉素B产量。 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例1分子印迹聚合物的制备及埃博霉素B的发酵，包括以下步骤1)分子印迹聚合物的制备按以下比例将埃博霉素B lmmol、甲基丙烯酸4mmol，乙二醇二甲基丙烯酸酯 20mmol，偶氮二异丁氰10mg，乙腈3ml混合装入反应管，通氮排氧30min，在氮气保护下将反应管封口，置于50°C水浴中聚合M小时，再于60°C水浴中聚合12小时得到聚合反应产物；将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60 μ m的聚合物颗粒；将得到的聚合物颗粒于用水洗涤后，再用乙酸甲醇(体积比1 9)混合溶液中通过索氏萃取器抽提48h，达到规定的萃取时间后再用甲醇抽提二次，每次12h，印迹聚合物真空冷冻干燥(温度-20°C、压力20Pa)得到埃博霉素B分子印迹聚合物吸附剂。2)埃博霉素B的发酵将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂，按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌 ATCC25531细胞干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/10mg/3g的用量投入到埃博霉素B 的发酵液中；发酵液的组成为黄豆粉20g/L，玉米淀粉5g/L，磷酸二氢钠2g/L，磷酸氢二钠2g/ L, MgSO4 · 7H20 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, CaCl2 5g/L, MnCl2O. lg/L,葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；发酵温度为30°C，发酵摇床转速为120rpm，发酵时间为96小时；在发酵培养时还进行葡萄糖的补加在发酵培养的第1 4 每隔30min按每 IOOml发酵液加入0. Ig葡萄糖的比例补加，在第4 至发酵结束每隔IOmin按每IOOml发酵液加入0. 2g葡萄糖的比例补加；将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于2500rpm的离心机上分离 30分钟进行分离分子印迹聚合物，弃去上清液，下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素B 的分子印迹聚合物。3)埃博霉素B的分离埃博霉素B的洗脱采用溶剂萃取法以甲醇作为萃取液，常温下将含有埃博霉素B的分子印迹聚合物在索氏萃取器中用甲醇重复萃取3次后，再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次；
含有埃博霉素B的甲醇溶液旋转蒸发(转速为lOOrpm，温度为40°C )回收甲醇， 甲醇重复利用；蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素B粗品。甲醇洗涤过的埃博霉素B的分子印迹聚合物，经真空干燥、研磨、过40 60 μ m筛或真空干燥即可重复使用，能够保证高效吸附埃博霉素B的使用次数为3次。将含埃博霉素B的甲醇0. 22 μ m微孔滤膜过滤后，作为HPLC分析的样品，定量分析其产品含量。HPLC分析条件为色谱柱为AT LiCHROM C18反相柱；检测波长为M9nm ；流动相的制备工艺为取350mL超纯水与650mL甲醇混勻，然后用乙酸调pH为4 ；流速为Iml/ min ；进样量为10 μ L ；埃博霉素B的保留时间为11. 5min。检测结果如图1所示，其中埃博霉素B保留时间处峰面积定量分析其含量，结果显示其含量为获得埃博霉素B发酵产量为48mg/L。实施例2分子印迹聚合物的制备及埃博霉素B的发酵，包括以下步骤1)分子印迹聚合物的制备按以下比例将埃博霉素B lmmol、甲基丙烯酸3mmol，乙二醇二甲基丙烯酸酯 25mmol，偶氮二异丁氰10mg，甲醇8ml混合装入反应管，通氮排氧30min，在氮气保护下将反应管封口，置于45°C水浴中聚合M小时，再于65°C水浴中聚合12小时得到聚合反应产物；将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60 μ m的聚合物颗粒；将得到的聚合物颗粒于用水洗涤后，再用乙酸甲醇(体积比3 7)混合溶液中通过索氏萃取器抽提48h，达到规定的萃取时间后再用甲醇抽提二次，每次12h，印迹聚合物真空冷冻干燥(温度-20°C、压力20Pa)得到埃博霉素B分子印迹聚合物吸附剂。2)埃博霉素B的发酵将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂，按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌 ATCC15384细胞干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/5mg/2g的用量投入到埃博霉素B的发酵液中；发酵液的组成为黄豆粉10g/L，10g/L 土豆淀粉，玉米淀粉5g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钠 lg/L，磷酸氢二钠 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，FeSO4 · 7H20 0. 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；发酵温度为30°C，发酵摇床转速为120rpm，发酵时间为96小时；在发酵培养时还进行葡萄糖的补加在发酵培养的第1 4 每隔30min按每 IOOrnl发酵液加入0. 05g葡萄糖的比例补加，在第4 至发酵结束每隔IOmin按每100ml发酵液加入0. Ig葡萄糖的比例补加。将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于2500rpm的离心机上分离 30分钟进行分离分子印迹聚合物，弃去上清液，下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素B 的分子印迹聚合物。3)埃博霉素B的分离埃博霉素B的洗脱采用溶剂萃取法以甲醇作为萃取液，常温下将含有埃博霉素B的分子印迹聚合物在索氏萃取器中用甲醇重复萃取3次后，再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次；含有埃博霉素B的甲醇溶液旋转蒸发(转速为lOOrpm，温度为40°C)回收甲醇，甲醇重复利用；蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素B粗品。甲醇洗涤过的埃博霉素B的分子印迹聚合物，经真空干燥、研磨、过40 60 μ m筛或真空干燥即可重复使用。实施例3分子印迹聚合物的制备及埃博霉素B的发酵，包括以下步骤1)分子印迹聚合物的制备按以下比例将埃博霉素B Immol、甲基丙烯酸3. 5mmol,乙二醇二甲基丙烯酸酯 30mmol，偶氮二异丁氰5mg，乙腈3ml混合装入反应管，通氮排氧30min，在氮气保护下将反应管封口，置于50°C水浴中聚合M小时，再于60°C水浴中聚合12小时得到聚合反应产物；将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60 μ m的聚合物颗粒；将得到的聚合物颗粒于用水洗涤后，再用乙酸甲醇(体积比3 7)混合溶液中通过索氏萃取器抽提48h，达到规定的萃取时间后再用甲醇抽提二次，每次12h，印迹聚合物真空冷冻干燥(温度-20°C、压力20Pa)得到埃博霉素B分子印迹聚合物吸附剂。2)埃博霉素B的发酵将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂，按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌 ATCC25569细胞干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/5mg/2g的用量投入到埃博霉素B的发酵液中；发酵液的组成为黄豆粉10g/L，10g/L葡聚糖，玉米淀粉5g/L，NH4S045g/L,磷酸二氢钠 lg/L，磷酸氢二钠 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，FeSO4 · 7Η200· 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；在发酵培养时还进行葡萄糖的补加在发酵培养的第1 4 每隔30min按每 IOOml发酵液加入0. Ig葡萄糖的比例补加，在第4 至发酵结束每隔15min按每IOOml发酵液加入0. 4g葡萄糖的比例补加。发酵温度为30°C，发酵摇床转速为120rpm，发酵时间为96小时；将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于2500rpm的离心机上分离 30分钟进行分离分子印迹聚合物，弃去上清液，下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素B 的分子印迹聚合物。3)埃博霉素B的分离埃博霉素B的洗脱采用溶剂萃取法以甲醇作为萃取液，常温下将含有埃博霉素B的分子印迹聚合物在索氏萃取器中用甲醇重复萃取3次后，再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次；含有埃博霉素B的甲醇溶液旋转蒸发(转速为lOOrpm，温度为40°C)回收甲醇，甲醇重复利用；蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素B粗品，获得埃博霉素B发酵产量为52mg/L。甲醇洗涤过的埃博霉素B的分子印迹聚合物，经真空干燥、研磨、过40 60 μ m筛或真空干燥即可重复使用。实施例4分子印迹聚合物的制备及埃博霉素B的发酵，包括以下步骤1)分子印迹聚合物的制备按以下比例将埃博霉素B Immol、甲基丙烯酸3. 5mmol,乙二醇二甲基丙烯酸酯30mmol，偶氮二异丁氰5mg，甲醇3ml混合装入反应管，通氮排氧30min，在氮气保护下将反应管封口，置于50°C水浴中聚合M小时，再于60°C水浴中聚合12小时得到聚合反应产物；将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60 μ m的聚合物颗粒；将得到的聚合物颗粒于用水洗涤后，再用乙酸甲醇(体积比1 9)混合溶液中通过索氏萃取器抽提48h，达到规定的萃取时间后再用甲醇抽提二次，每次12h，印迹聚合物真空冷冻干燥(温度-20°C、压力20Pa)得到埃博霉素B分子印迹聚合物吸附剂。2)埃博霉素B的发酵将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂，按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌 ATCC25531细胞干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/lmg/4g的用量投入到埃博霉素B的发酵液中；发酵液的组成为黄豆粉10g/L，10g/L甘露糖，玉米淀粉5g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钠 lg/L，磷酸氢二钠 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，FeSO4 · 7Η200· 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；发酵温度为35°C，发酵摇床转速为IOOrpm，发酵时间为192小时；在发酵培养时还进行葡萄糖的补加在发酵培养的第1 4 每隔30min按每 IOOml发酵液加入0. 05g葡萄糖的比例补加，在第4 至发酵结束每隔15min按每IOOml发酵液加入0. 4g葡萄糖的比例补加。将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于2500rpm的离心机上分离 30分钟进行分离分子印迹聚合物，弃去上清液，下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素B 的分子印迹聚合物。3)埃博霉素B的分离埃博霉素B的洗脱采用溶剂萃取法以甲醇作为萃取液，常温下将含有埃博霉素B的分子印迹聚合物在索氏萃取器中用甲醇重复萃取3次后，再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次；含有埃博霉素B的甲醇溶液旋转蒸发(转速为lOOrpm，温度为40°C)回收甲醇，甲醇重复利用；蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素B粗品，获得埃博霉素B发酵产量为50mg/L。甲醇洗涤过的埃博霉素B的分子印迹聚合物，经真空干燥、研磨、过40 60 μ m筛或真空干燥即可重复使用。实施例5分子印迹聚合物的制备及埃博霉素B的发酵，包括以下步骤1)分子印迹聚合物的制备按以下比例将埃博霉素B lmmol、甲基丙烯酸2mmol，乙二醇二甲基丙烯酸酯 20mmol，偶氮二异丁氰5mg，含甲醇20%的去离子水3ml混合装入反应管，通氮排氧30min， 在氮气保护下将反应管封口，置于50°C水浴中聚合M小时，再于60°C水浴中聚合12小时得到聚合反应产物；将得到的反应产物破碎、研磨、过筛得到粒径40-60 μ m的聚合物颗粒；将得到的聚合物颗粒于用水洗涤后，再用乙酸甲醇(体积比2 8)混合溶液中通过索氏萃取器抽提48h，达到规定的萃取时间后再用甲醇抽提二次，每次12h，印迹聚合物真空冷冻干燥(温度-20°C、压力20Pa)得到埃博霉素B分子印迹聚合物吸附剂。
2)埃博霉素B的发酵发酵菌株的Genome shuffling改造利用纤维堆囊菌ATCC25569作为起始菌株， 理化工艺诱变筛选高产埃博霉素B菌株3-6株，利用纤维堆囊菌原生质体融合体系，获得诱变高产菌株的融合杂种，并且融合杂种和诱变高产菌株回交4-5次，通过杂交菌株后代选择、产量分析和基因组鉴定，可获得高产埃博霉素B shuffling改造菌株；将制备得到的分子印迹聚合物作为吸附剂，按发酵液的体积/接种纤维堆囊菌 ATCC25569Genome shuffling改造菌株干重/分子印迹聚合物的质量=100ml/2mg/8g的用量投入到埃博霉素B的发酵液中；发酵液的组成为黄豆粉10g/L，土豆淀粉10g/L，玉米蛋白粉5g/L，KNO3 5g/L，磷酸二氢钠 lg/L，磷酸氢二钠 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，FeSO4 · 7H20 0. 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；发酵温度为^°C，发酵摇床转速为120rpm，发酵时间为120小时；在发酵培养时还进行葡萄糖的补加在发酵培养的第1 4 每隔30min按每 IOOml发酵液加入0. Ig葡萄糖的比例补加，在第4 至发酵结束每隔15min按每IOOml发酵液加入0. 2g葡萄糖的比例补加。将上述发酵结束的含有分子印迹聚合物的发酵液置于2500rpm的离心机上分离 30分钟进行分离分子印迹聚合物，弃去上清液，下层沉淀物即为分离到的含有埃博霉素B 的分子印迹聚合物。3)埃博霉素B的分离埃博霉素B的洗脱采用溶剂萃取法以甲醇作为萃取液，常温下将含有埃博霉素B的分子印迹聚合物在索氏萃取器中用甲醇重复萃取3次后，再用大量甲醇充分洗涤分子印迹聚合物数次；含有埃博霉素B的甲醇溶液旋转蒸发(转速为lOOrpm，温度为40°C )回收甲醇，甲醇重复利用；蒸干甲醇后获得剩余固形物即为埃博霉素B粗品，获得埃博霉素B发酵产量为58mg/L。甲醇洗涤过的埃博霉素B的分子印迹聚合物，经真空干燥、研磨、过40 60 μ m筛或真空干燥即可重复使用。
权利要求
1.一种埃博霉素B的发酵生产工艺，其特征在于，包括以下步骤1)按IOOml接种1 IOmg菌种的比例，将纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)接种于发酵液中，然后加入菌种质量100 800倍的特异性吸附埃博霉素B的分子印迹聚合物， 在25 35°C下摇床发酵96 19 ；2)发酵完成后，分离并收集发酵液中的吸附了埃博霉素B的分子印迹聚合物，然后用甲醇多次浸提，将埃博霉素B从分子印迹聚合物中分离出来，分别收集含有埃博霉素B的甲醇和分子印迹聚合物。
2.如权利要求1所述的埃博霉素B的发酵生产工艺，其特征在于，所述的发酵液中含有黄豆粉20 50g/L、玉米淀粉5 10g/L、磷酸二氢钠1 2g/L、磷酸氢二钠1 2g/L、 MgSO4 ·7Η202 5g/L、FeS04 ·7Η20 0· 1 0. 5g/L、CaCl2 2 5g/L、MnCl2 0· 1 0. 5g/L 禾口葡萄糖10 15g/L，pH为7. 2 7. 5。
3.如权利要求1或2所述的埃博霉素B的发酵生产工艺，其特征在于，在发酵培养时还进行葡萄糖的补加在发酵培养的第1 4 每隔30min按每IOOml发酵液加入0. 05 0. 2g葡萄糖的比例补加，在第48h至发酵结束每隔10 15min按每IOOml发酵液加入 0. 1 0. 4g葡萄糖的比例补加。
4.如权利要求2所述的埃博霉素B的发酵生产工艺，其特征在于，所述的发酵液中还含有土豆淀粉、葡聚糖、甘露糖中的一种，其含量为5 10g/L ；所述的发酵液中还含有蛋白胨、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、ΚΝ03、ΝΗ4504ψ的一种作为氮源，氮源的含量为2 8g/L。
5.如权利要求1所述的埃博霉素B的发酵生产工艺，其特征在于，所述的分子印迹聚合物的制备为按照埃博霉素B:功能单体交联剂引发剂溶剂=1 0 6) (20 30) (0.6 1) (3 20)的摩尔比，将上述反应原料加入到反应容器中，在搅拌下通入氮气20 30min ；然后在45 55°C下聚合反应12 Mh，再在55 65°C下聚合反应 8 12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40 60 μ m的聚合反应物；所述的功能单体为甲基丙烯酸；所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；收集的聚合反应物并用水充分洗涤后，然后用乙酸甲醇体积比=1 9 3 7的混合溶液浸提多次，脱去埃博霉素B，冷冻干燥后得到埃博霉素B的分子印迹聚合物。
6.如权利要求5所述的埃博霉素B的发酵生产工艺，其特征在于，所述的引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰；所述的溶剂为去离子水、甲醇或乙腈。
7.如权利要求5所述的埃博霉素B的发酵生产工艺，其特征在于，所述的摇床的转速为 100 160r/min。
8.如权利要求1所述的埃博霉素B的发酵生产工艺，其特征在于，所述的纤维堆囊菌 (Sorangium cellulosum)为 ATCC15384、ATCC25569 或ATCC25531。
9.如权利要求1所述的埃博霉素B的发酵生产工艺，其特征在于，所述的纤维堆囊菌 (Sorangium cellulosum)为经过理化诱变、杂交、原生质体融合或Genome shuffling改造而筛选到的高产菌株。
10.一种埃博霉素B的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤按照埃博霉素B:功能单体交联剂引发剂溶剂=1 0 6) (20 30) (0.6 1) (3 20)的摩尔比，将上述反应原料加入到反应容器中，在保护气氛下超声振荡20 30min，在搅拌下通入氮气20 30min ；然后在45 55°C下聚合反应12 24h,再在55 65°C下聚合反应8 12h ；聚合反应完成后将反应产物破碎、研磨、过筛后得到粒径为40 60 μ m的聚合反应物；所述的功能单体为甲基丙烯酸；所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的引发剂为偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰；所述的溶剂为去离子水、甲醇或乙腈；将收集的聚合反应物用水充分洗涤后，然后用乙酸甲醇体积比=1 9 3 7的混合溶液连续洗涤，脱去埃博霉素B，冷冻干燥后得到埃博霉素B的分子印迹聚合物。
全文摘要
本发明公开了一种埃博霉素B的发酵生产工艺，即提高埃博霉素B生产菌株纤维堆囊菌的埃博霉素B发酵产量的工艺。该工艺包括1)发酵过程中埃博霉素B分子印迹聚合物吸附剂的添加；2)适合纤维堆囊菌产生的黄豆粉、玉米淀粉等的选定；3)发酵过程中葡萄糖脉冲添加等步骤，从而使得埃博霉素B的纤维堆囊菌发酵生产产量达到50mg/L的水平。
文档编号C12P17/18GK102373252SQ20111034609
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者李慧, 陈松, 龚国利 申请人:陕西科技大学