专利名称：检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法
技术领域：
本发明属于工业微生物领域，涉及一种检测谷胱甘肽促进氧化葡糖杆菌产 2-酮-L-古龙酸过程中细胞内蛋白质变化的方法。
背景技术：
蛋白质是构成细胞的重要组成部分，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明细胞在不同生长条件下的变化机制。一方面可以对其上游的基因组学信息进行验证，提供后续基因改造的依据，另一方面又可以对其下游的代谢物研究提供指导。蛋白组学的发展，主要依托高效的蛋白分离和鉴定技术，主要有二维凝胶电泳和液相色谱分离两种分离方法，其中，液相色谱分离然后经质谱鉴定蛋白质，具有高度自动化，高分辨率的优势，是目前蛋白组学发展的主流。基于液相色谱分离，Q-TOF鉴定蛋白技术的使用，可以从整体水平上检测细胞在发酵过程中各种结构蛋白以及功能蛋白的变化水平。氧化葡糖杆菌被用于维生素C的工业发酵，此发酵是氧化葡糖杆菌与巨大芽孢杆菌共同作用完成的，然而氧化葡糖杆菌单独发酵，生长缓慢，产量较低。添加谷胱甘肽后，菌体生长及2-酮-L-古龙酸产量显著提高，其作用机理尚不明确，对以后对氧化葡糖杆菌进行分子改造尚不能提供有利信息。
发明内容
本发明的目的是通过高通量的蛋白组学的手段来了解添加谷胱甘肽进行氧化葡糖杆菌发酵过程中的蛋白质变化规律，进一步揭示谷胱甘肽促进氧化葡糖杆菌生长及
2-酮-L-古龙酸生产的作用机制，为对氧化葡糖杆菌进行分子生物学改造提供有利信息， 从而提高其生长及生产能力，提供一种检测谷胱甘肽提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中细胞内蛋白质变化的方法。本发明的技术方案概述如下一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，包括如下步骤(1)细胞内蛋白质的测定①细胞收集及淬灭取3-5份氧化葡糖杆菌以8% 16%的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取
3-5份所述氧化葡糖杆菌以8% 16 %的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在 32°C，转速为200 250rpm的条件下培养发酵，在发酵过程中选取lh、 15h为取样点取出发酵液样品，在4°C下，以4000 6000rpm的转速离心，收集下层的细胞， 并用PH为7. 2 7. 4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞，获得3-5份从培养基A中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基A中发酵1 收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵1 收集淬灭的破碎细胞；所述发酵培养基A为80g · L—1山梨糖，20g · L—1玉米浆，Ig · L—1 KH2PO4, 0. 2g · L-1MgSO4，和 12g · L-1 尿素，余量为水；所述发酵培养基B为80g · L—1山梨糖，20g · L—1玉米浆，Ig · L—1 KH2PO4, 0. 2g · L^1MgSO4, and 12g · Γ1 尿素，0. 8 1. 5mg · mL"1 的谷胱甘肽，余量为水；②提取细胞内蛋白取步骤①获得的破碎细胞，每份100 200mg分别置于离心管中，每管加入0. 5 2ml细胞裂解液，混勻，冰上间歇超声破碎20 50s ；加入5 15 μ L的质量比为2 4 1 的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C静置反应10 30min ；加入5 15 μ L 80 120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4°C静置1 汕；15000rpm离心25 40min ；取上清， 得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为8mol *L-1尿素，质量浓度为4%的(3_[(3_胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，40mM的Tris，余量为水；③蛋白浓度测定采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；④沉淀蛋白分别取包含50 150 μ g蛋白的步骤③获得的各个蛋白溶液，加入4 6倍体积的-20°C _40°C的丙酮，沉淀12 20h ；离心，弃上清，沉淀用_20°C _40°C的体积浓度为70% -85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；_80°C贮存；⑤蛋白还原以及酶解向步骤④所得的各个干燥蛋白中，添加10 40 μ L 40 60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；加入1 4yL三(2-羧乙基)膦，在50 60°C反应lh，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1 2μ L甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10 15min，终止还原反应；向上述溶液中，加浓度为0. 2 0. 3 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液20 30 μ L，37°C 反应12 18小时，进行蛋白酶解；⑥蛋白标记在每个经步骤⑤酶解的蛋白酶解液中分别加入一管用60 80 μ L乙醇溶解的 iTRAQ标记试剂，室温反应Ih ；⑦溶液混合将步骤溶液⑥获得的溶液混合得3-5份混合液，使每个混合液中都包括从培养基 A中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基A中发酵15h 收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基B中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白和从培养基B中发酵1 收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白；于_20°C保存；⑧差异表达蛋白鉴定将⑦中得到的混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；
(2)主成分分析采用matlab对步骤(1)⑧中得到的数据进行标准化后，进行主成分分析，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；(3)过程分析将步骤( 获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现谷胱甘肽在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。利用本发明的方法可以从揭示氧化葡糖杆菌受谷胱甘肽作用后细胞内蛋白变化规律，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，对氧化葡糖杆菌进行分子改造提供理论基础。同时也为工业混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。
图1为对四组样品蛋白(混合溶液)数据进行主成分分析A、得分图“ ▲”表示来自培养基B Ih的样品/来自培养基A Ih的样品，“〇”表示来自培养基A 1 的样品/来自培养基A Ih的样品，“■”表示来自培养基B 1 的样品 /来自培养基A Ih的样品；B、物质载荷2为硫胺素转运蛋白及以其为辅酶的重要酶表达情况GSH-lh/KV_lh，表示来自培养基B Ih的样品/来自培养基A Ih的样品；KV-Mh/KV-lh，表示来自培养基A 1 的样品/来自培养基A Ih的样品，GSH-15h/KV-lh，表示来自培养基B 1 的样品/来自培养基A Ih的样品；图3为三羧酸循环、磷酸戊糖途径中的关键酶表达情况GSH-lh/KV_lh，表示来自培养基B Ih的样品/来自培养基A Ih的样品；KV-Mh/KV-lh，表示来自培养基A 1 的样品/来自培养基A Ih的样品，GSH-15h/KV-lh，表示来自培养基B 1 的样品/来自培养基 A Ih的样品；
具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明实施例1一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，其特征是包括如下步骤(1)细胞内蛋白质的测定①细胞收集及淬灭取3份氧化葡糖杆菌以8%的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取3份所述氧化葡糖杆菌以8 %的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在28°C，转速为200rpm条件下培养发酵，在发酵过程中选取lh、Mh为取样点取出发酵液样品，在4°C 下，以4000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用pH为7. 2的磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨用于破碎细胞，获得3份从培养基A中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞，3份从培养基A中发酵1 收集淬灭的破碎细胞，3份从培养基B中发酵Ih 收集淬灭的破碎细胞，3份从培养基B中发酵1 收集淬灭的破碎细胞；所述发酵培养基A为80g · L—1山梨糖，20g · L—1玉米浆，Ig · L—1 KH2PO4, 0. 2g · L-1MgSO4，和 12g · L-1 尿素，余量为水；所述发酵培养基B为80g · L—1山梨糖，20g · L—1玉米浆，Ig · L—1 KH2PO4, 0. 2g · L^1MgSO4, and 12g · Γ1 尿素，0. 8 1. 5mg · mL"1 的谷胱甘肽，余量为水；②提取细胞内蛋白取步骤①获得的破碎细胞，每份IOOmg分别置于离心管中，每管加入0. 5ml细胞裂解液，混勻，冰上间歇超声破碎20s ；加入5 μ L的质量比为2 1的DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C静置反应IOmin ；加入5μ L SOmM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4°C静置Ih ； 15000rpm离心25min ；取上清，得到蛋白溶液。所述细胞裂解液为8mol · L—1尿素，质量浓度为4%的(3-[(3_胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)(CHAPS)，40mM的Tris，余量为水；③蛋白浓度测定采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；④沉淀蛋白 分别取包含50 μ g蛋白的步骤③获得的各个蛋白溶液，加入4倍体积的-20°C的丙酮，沉淀12h ；离心，弃上清，沉淀用-20°C的体积浓度为70%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80°C贮存；⑤蛋白还原以及酶解向步骤④中所得的各个干燥蛋白中，添加IOyL 40mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；加入IyL三(2-羧乙基)膦，在50°C反应lh，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1 μ L甲基硫代磺酸甲酯，室温反应lOmin，终止还原反应；向上述溶液中，加浓度为0. 2 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液30 μ L，37。C反应12小时， 进行蛋白酶解；⑥蛋白标记在每个经步骤⑤酶解的蛋白酶解液中分别加入一管用60 80 μ L乙醇溶解的 iTRAQ标记试剂，室温反应Ih ；⑦溶液混合将步骤溶液⑥获得的溶液混合得3份混合液，使每个混合液中都包括从培养基A 中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基A中发酵15h 收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基B中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白和从培养基B中发酵1 收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白；于_20°C保存；⑧差异表达蛋白鉴定将⑦中得到的混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；
(2)主成分分析采用matlab对步骤(1)⑧中得到的数据进行标准化后，进行主成分分析，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；(3)过程分析将步骤( 获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现谷胱甘肽在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。添加谷胱甘肽后，氧化葡糖杆菌发酵过程中，胞内鉴定到的蛋白如表1所示。表1氧化葡糖杆菌胞内蛋白
权利要求
1. 一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，其特征是包括如下步骤(1)细胞内蛋白质的测定①细胞收集及淬灭取3-5份氧化葡糖杆菌以8% 16%的体积比分别接种到发酵培养基A中，另取3-5 份所述氧化葡糖杆菌以8% 16%的体积比分别接种到发酵培养基B中，将两种接种后的培养基在 32°C，转速为200 250rpm的条件下培养发酵，在发酵过程中选取lh、1 为取样点取出发酵液样品，在4°C下，以4000 6000rpm的转速离心，收集下层的细胞，并用 pH为7. 2 7. 4的磷酸盐缓冲液清洗，用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨破碎细胞， 获得3-5份从培养基A中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基A中发酵1 收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞，3-5份从培养基B中发酵1 收集淬灭的破碎细胞；所述发酵培养基 A 为:80g .L—1 山梨糖，20g .L—1 玉米浆，Ig .L—1 KH2PO4,0. 2g .L4MgSO4, 和Ug·!/1尿素，余量为水；所述发酵培养基 B 为:80g .L—1 山梨糖，20g .L—1 玉米浆，Ig .L—1 KH2PO4,0. 2g .L4MgSO4, and 12g · Γ1尿素，0. 8 1. 5mg · mL—1的谷胱甘肽，余量为水；②提取细胞内蛋白取步骤①获得的破碎细胞，每份100 200mg分别置于离心管中，每管加入0. 5 ^iil 细胞裂解液，混勻，冰上间歇超声破碎20 50s ；加入5 15 μ L的质量比为2 4 1的 DNase I/RNaseA酶混合溶液，混勻，4°C静置反应10 30min ；加入5 15 μ L 80 120mM 的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4°C静置1 池；15000rpm离心25 40min ；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为8mol ^L-1尿素，质量浓度为4%的(3-[(3_胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸)，40mM的Tris，余量为水；③蛋白浓度测定采用Bradford试剂盒，将牛血清蛋白由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，测定步骤②获得的各个蛋白溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；测定各个蛋白溶液蛋白的浓度；④沉淀蛋白分别取包含50 150 μ g蛋白的步骤③获得的各个蛋白溶液，加入4 6倍体积的-20°C -40°C的丙酮，沉淀12 20h ；离心，弃上清，沉淀用_20°C _40°C的体积浓度为70% -85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；_80°C贮存；⑤蛋白还原以及酶解向步骤④所得的各个干燥蛋白中，添加10 40 μ L 40 60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；加入1 4μ L三(2-羧乙基)膦，在50 60°C反应Ih，对各个蛋白进行还原化处理； 然后加入1 2μ L甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10 15min，终止还原反应；向上述溶液中，加浓度为0. 2 0. 3 μ g/ μ L的胰蛋白酶水溶液20 30 μ L，37。C反应 12 18小时，进行蛋白酶解；⑥蛋白标记在每个经步骤⑤酶解的蛋白酶解液中分别加入一管用60 80 μ L乙醇溶解的iTRAQ 标记试剂，室温反应Ih;⑦溶液混合将步骤溶液⑥获得的溶液混合得3-5份混合液，使每个混合液中都包括从培养基A中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基A中发酵1 收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白、从培养基B中发酵Ih收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白和从培养基B中发酵15 h收集淬灭的破碎细胞再经步骤②-⑥后获得的标记蛋白；于_20°C保存；⑧差异表达蛋白鉴定将⑦中得到的混合液，进行Q-Tof质谱鉴定，得到蛋白谱，通过定量得到各混合组样品的差异表达蛋白；(2)主成分分析采用matlab对步骤(1)⑧中得到的数据进行标准化后，进行主成分分析，得到具有不同变化规律的数据类别，获得候选差异蛋白；(3)过程分析将步骤( 获得的候选差异蛋白含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些蛋白变化的规律，进而发现谷胱甘肽在提高氧化葡糖杆菌产2-酮-L-古龙酸过程中的作用。
全文摘要
本发明公开了一种检测谷胱甘肽作用于氧化葡糖杆菌过程中细胞内蛋白质变化的方法，包括如下步骤(1)细胞内蛋白质的测定①细胞收集及淬灭；②提取细胞内蛋白；③蛋白浓度测定；④沉淀蛋白；⑤蛋白还原以及酶解；⑥蛋白标记；⑦溶液混合；⑧差异表达蛋白鉴定；(2)主成分分析；(3)过程分析。利用本发明的方法可以从揭示氧化葡糖杆菌受谷胱甘肽作用后细胞内蛋白变化规律，找到发酵过程中的重要蛋白，这些蛋白含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，对氧化葡糖杆菌进行分子改造提供理论基础。同时也为工业混菌发酵过程的研究提供新的思路和方法。
文档编号C12Q1/02GK102520184SQ201110346058
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者元英进, 张璐, 马倩 申请人:天津大学