一株细菌纤维素高产菌的制作方法
【专利摘要】一株细菌纤维素高产菌，它涉及一株细菌纤维素高产菌株。细菌纤维素高产菌为汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5(Gluconacetobacter?hansenii?HDCo-5)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?NO:M2012234。本发明应用于细菌纤维素生产领域。
【专利说明】一株细菌纤维素高产菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株细菌纤维素高产菌株。
【背景技术】
[0002]细菌纤维素是一种由微生物合成的超微纯纤维素，与植物纤维素具有相同的化学结构，而在某些方面细菌纤维素又区别于植物纤维素，如网状微结构(自由nanoscale微纤维，其宽度小于1nm)，较高的抗张强度，高纯度(不含半纤维素和木质素)，高结晶度，高杨氏模量，高持水性，良好的形态可调控性，以及较高的生物适应性和良好的生物可降解性等特点。
[0003]细菌纤维素发现至今已有一百多年的历史，但由于其生产成本高应用仅局限在一些高附加值产品的制造中，以至于其工业化生产和推广受到一定的局限。近几十年来，随着人们对细菌纤维素生物合成机制的不断深入研究以及发酵技术的进一步改善，使细菌纤维素的工业生产与应用正日益向多元化方向发展。在美国、日本、德国等一些发达国家，细菌纤维素产业已初具规模，商业化的产品已进入食品、造纸、医疗、声学器材、化工等行业，形成了年产值上亿美元的市场，并每年以高比例状态持续增长。目前，对于有关细菌纤维素的应用性研究，在国外每年均有大量申请专利产生，其应用方面几乎涉及了每一工业领域，表现出了广阔的应用前景和潜在的巨大商业价值。而在国内，就现阶段而言我国除在食品领域有相对较多的基础研究外，在其它方面的研究开发涉及较少，总体仍处于起步阶段。对于国内细菌纤维素的研究现状，无论从细菌纤维素工业生产到应用，在数量、规模以及技术含量上与日欧美等国外企业都还存在较大差距。与此同时由于一般分离获得的醋酸菌液体发酵纤维素产量均比较低，其研究和应用受到一定的限制，使实际推广应用难以形成规模化和产业化，因此提高细菌纤维素的产量迫在眉睫。
【发明内容】
[0004]本发明为提高细菌纤维素的产量而提供了一株细菌纤维素高产菌。
[0005]本发明细菌纤维素高产菌为汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacterhansenii HDCo-5)，属于革兰氏阴性菌，严格好氧，接触酶阳性，氧化酶阴性，不液化明胶，不产吲哚和H2S,氧化乙醇到乙酸，乙酸和乳酸氧化到CO2和H2O,不能水解淀粉，最适生长温度28~30°C，不能利用阿拉伯糖为碳源，低产丙酮酸、葡萄糖酸。汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)菌株呈捕球或杆状，以单个或成对呈现，罕见成链，如图4所示，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:M2012234o
[0006]本发明采用硫酸二乙酯和6tlCo-Y对汉氏葡糖醋杆菌进行复合诱变，采用NaBr-NaBrO3培养基进行纤维素高产菌株的筛选，获得了本发明细菌纤维素高产菌株汉氏葡糖醋杆菌 HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5) ?
[0007]汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)在每升基础发酵培养基(基础发酵培养基按质量百分比由5%的葡萄糖、0.5%的酵母膏、0.5%的蛋白胨、0.1 % 的柠檬酸、0.2 % 的 Na2HPO4.12Η20、0.I % 的 Κ2ΗΡ04、0.025 % 的 MgSO4.7Η20和余量的蒸馏水制成，PH值为5.8)中产细菌纤维素干重平均达1.568g，是原始菌株汉氏葡糖醋杆菌 HDM1-3 (Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)产量的 3.918 倍，是仅经过硫酸二乙酯诱变高产突变株Br-3产量的1.83倍。而且经试验验证，汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)具有细菌纤维素高产的稳定遗传性。本发明为将来大规模、产业化的生产细菌纤维素，为降低细菌纤维素的生产成本，为细菌纤维素在各领域的推广应用奠定了物质基础。
[0008]汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3(Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)为汉氏葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter hansenii),属于葡糖醋酸杆菌属(Gluconacetobacter);保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市，武汉大学，保藏日期为2010年12月5日，保藏号为 CCTCC NO:M2010332o
[0009]细菌纤维素高产菌株汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hanseniiHDCo-5)为汉氏葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter hansenii),属于葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter);保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏地址是武汉大学，保藏日期为2012年6月15日，保藏编号为CCTCC N0:M2012234。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1 是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)、汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3 (Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)和突变株Br_3在细菌纤维素发酵过程中D-葡萄糖酸生成量图。
[0011]图2 是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)、汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3 (Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)和突变株Br_3在细菌纤维素发酵过程中丙酮酸的生成量图。
[0012]图3 是汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)、汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3 (Gluconacetobacter hansenii HDM1-3)和突变株Br_3在细菌纤维素发酵过程中柠檬酸的消耗量图。
[0013]图4 是汉氏葡糖醋杆菌 HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)菌株的光学显微镜观察图。
[0014]图5是汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3菌株的光学显微镜观察图。
[0015]图6 是汉氏葡糖醋杆菌 HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)产细菌纤维素膜的SEM图。
[0016]图7是汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3产细菌纤维素膜的SEM图。
[0017]图8 是汉氏葡糖醋杆菌 HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图。
【具体实施方式】
[0018]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0019]【具体实施方式】一:本实施方式获得汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacterhansenii HDCo-5)。
[0020]汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3 (Gluconacetobacter hansenii HDM1-3),简称 M ;由黑龙江大学生命科学学院食品分析验室从糜烂猕猴桃中分离获得并提供进行保藏。
[0021]一、取培养23~24h、一定体积(约3mL)的汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3菌种子培养液置于于离心管中，然后在5000r/min条件下离心5min，弃上清液，加入磷酸缓冲液(pH7.2)洗涤菌体2次，加入适量的磷酸缓冲液制成菌悬液，再将菌悬液置于漩涡振荡器上震荡打散菌体；待菌体分散均匀后，取少量菌液滴在血球计数板板上，在显微镜下计数，并调整汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3菌悬液浓度至17~108cfu/mL ；
[0022]二、硫酸二乙酯化学诱变
[0023]取9mL步骤一调整后的汉氏葡糖醋杆菌HDM1-3菌悬液与lmL、浓度为2%的硫酸二乙酯混合均匀，置于摇床中以120r/min的转速振荡处理45min,再加入0.5mL Na2S2O3终止反应1min ；
[0024]三、菌株初次筛选
[0025]取10yL经过硫酸二乙酯化学诱变的菌悬液涂布于含不同浓度梯度的NaBr-NaBrO3固体筛选平板上，于28 °C暗箱培养3~4天，取长势良好的单菌落，再一次涂在含相同浓度NaBr-NaBrO3的平板上富集培养，用于排除恢复突变株的产生；从2次NaBr-NaBrO3筛选平皿中挑取菌种，接种于液体种子培养基(液体种子培养基按重量百分比由2%的蔗糖、0.3%的酵母膏、0.5%的蛋白胨、0.2%的ΚΗ2Ρ04、0.015%的MgSO4和余量的蒸馏水组成，自然pH，115°C高压灭菌30min)中，充分震荡混匀后置于转速为150r/min的摇床中28°C震荡培养24h，再以7%的接种量从液体种子培养液中接转至基础发酵培养基(基础发酵培养基按重量百分比由5%的葡萄糖、0.5%的酵母膏、0.5%的蛋白胨、0.1 %的柠檬酸、0.2%的Na2HPO4.12H20、0.1%的Κ2ΗΡ04、0.025%的MgSO4和余量的蒸馏水组成，调解pH值至5.8，115°C高压灭菌30min)中，在28°C静止培养7d后测定各突变菌株的细菌纤维素产量；其中，细菌纤维素产量最高的突变株细菌纤维素干重产量为0.857g/L，较M产量提高了 114%，被命名为突变株Br-3 ；
[0026]四、6°Co-Y诱变
[0027]将突变株Br-3制成浓度至17~108cfu/mL的突变株Br_3菌悬液，然后进行60Co- Y诱变，6tlCo-Y辐射剂量为550Gy，剂量率为50Gy/min ；
[0028]五、菌株二次筛选
[0029]取100 μ L经过6ciCo- Y诱变的菌悬液涂布于含不同浓度梯度的NaBr-NaBrO3固体筛选平板上，于28 V暗箱培养3~4天，取长势良好的单菌落，再一次涂在含相同浓度NaBr-NaBrO3的平板上富集培养，用于排除恢复突变株的产生；从2次NaBr-NaBrO3筛选平皿中挑取一环菌种，接种于液体种子培养基(液体种子培养基按重量百分比由2%的蔗糖、0.3%的酵母膏、0.5%的蛋白胨、0.2%的ΚΗ2Ρ04、0.015%的MgSO4和余量的蒸馏水组成，自然pH，115°C高压灭菌30min)中，充分震荡混匀后置于转速为150r/min的摇床中28°C震荡培养24h，再以7%的接种量从液体种子培养液中接转至基础发酵培养基(基础发酵培养基按重量百分比由5%的葡萄糖、0.5%的酵母膏、0.5%的蛋白胨、0.1%的柠檬酸、0.2%的Na2HPO4.12Η20、0.I %的Κ2ΗΡ04、0.025%的MgSO4和余量的蒸馏水组成，调解pH值至5.8，115°C高压灭菌30min)中，在28°C静止培养7d后测定各突变菌株的细菌纤维素产量；其中，细菌纤维素产量最高的突变株每升基础发酵培养基产细菌纤维素干重达1.568g，是M产量的3.918倍，是突变株Br-3产量的1.83倍，然后对该突变株的16s rDNA进行提取、测序、比对和鉴定(如图8),确定该菌株属于葡糖醋酸杆菌属(Gluconacetobacter),为一株汉氏葡糖醋杆菌新菌株，被命名为汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hanseniiHDCo-5)。
[0030]本实施方式中NaBr-NaBrO3固体筛选平板中的筛选培养基按重量百分比由3%的葡萄糖、0.5%的酵母膏、0.5%的蛋白胨、0.1%的柠檬酸、0.2%的Na2HPO4.12H20,0.1%的K2HPO4、0.025 %的MgSO4、2 %的琼脂、NaBr和NaBOr3，以及余量的蒸馏水组成，pH值
5.8，115°C高压灭菌30min ;其中NaBr与NaBOr3的摩尔比为5:1，NaBr的浓度范围为5~25 μ mol/mL0
[0031]汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)经 12 代的传代培养后，细菌纤维素产量(干重)持续稳定在1.568g/L±0.06g/L左右。汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5)传代培养 T 检验结果见表 I 所不，12 代的细菌纤维素平均产量sig值〈0.01，表明突变菌株已具有稳定遗传性。
[0032]表1
[0033]
【权利要求】
1.一株细菌纤维素高产菌，其特征在于细菌纤维素高产菌为汉氏葡糖醋杆菌HDCo-5 (Gluconacetobacter hansenii HDCo-5),保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC N0:M201223 o
【文档编号】C12R1/01GK104164380SQ201410165908
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】雷虹, 田华, 田京京, 李元敬, 张基亮, 韩德权, 平文祥 申请人:黑龙江大学