包含在口香糖上或口香糖内的细菌的检测和定量方法
【专利摘要】本发明提供了提取包含在口香糖上或口香糖内的微生物并对所述微生物数目进行定量的方法。
【专利说明】
包含在口香糖上或口香糖内的细菌的检测和定量方法
技术领域
[0001 ]本发明提供了提取包含在口香糖上或口香糖内的微生物并对所述微生物的数目进行定量的方法。
【背景技术】
[0002]首次使用口香糖的描述可以追溯到古希腊，在那里人们使用来自于乳香木黄连的树胶解渴或清新口气。直至I 9世纪晚期，第一块口香糖才成功上市，当时人心果树(Sapodilla)的橡胶状树汁形成了口香糖的基础。在20世纪晚期，口香糖不仅被视为生活方式的象征，而且已报道了对认知表现、心情、警觉和食欲控制的影响。此外，口香糖已更多地向口腔护理和功能性食品(“营养品”)发展，因为它提供了可容易地应用的药物递送介质，对口腔健康具有潜在益处。高达每人每年2.5kg的高消费率使它成为十亿美元的工业。
[0003]—般来说，口香糖由合成的弹性体如聚乙酸乙烯酯或聚异丁烯的水不溶性混合物构成，所述混合物通常被称为胶基。对胶基材料的重要要求是它们在口腔中不溶解，并且可以被长时间咀嚼而不经历组成变化。在所有可商购的口香糖中，胶基被增补有建构剂、软化剂和调味剂，同时目前糖经常用人造甜味剂例如山梨糖醇、木糖醇或甘露糖醇代替。
[0004]已描述，木糖醇和其他人造甜味剂的包含减少了牙齿上口腔生物膜的形式。口腔生物膜是全世界最广泛传播的传染病、即龋齿和牙周疾病的病因。龋齿由牙釉质的天然存在的去矿化和再矿化之间的失衡引起。当由于糖被牙齿上口腔生物膜的选定成员发酵而造成口腔生物膜的PH下降到低于5.5时，发生去矿化。大多数人造糖不被或几乎不被口腔细菌发酵，因此不降低pH。此外，口香糖引起增加的咀嚼，其刺激唾液产生，因此提高了口腔中再矿化所需的钙和磷酸盐的浓度。已向商品化口香糖添加氟化物，以防止釉质去矿化并刺激再矿化。把咀嚼口香糖视为每日口腔卫生程序的补充是非常有吸引力的，特别是因为大多数人多年来不能维持预防疾病所需的口腔生物膜控制水平。这导致了向口香糖掺入抗微生物剂如氯己定和草药提取物，并且口香糖事实上已被证实成功地阻止口腔生物膜的重新生长。尽管已知阻嚼口香糖帮助移除齿间碎肩(Kakodkar等，Dental Research Journal 7:64-69,2011)并且已向口香糖添加去污剂如多磷酸盐以提高它们的清洁能力，但不清楚咀嚼口香糖是否实际上从口腔移除细菌。特别是，通过口香糖偏好性移除引起疾病的生物体如产酸的变形链球菌(Streptococcus mutans)或被视为牙釉质的最初定植者的物种，将使口香糖成为每日口腔卫生程序的有价值的补充。
[0005]人类口腔含有可变且大量的菌群，胃肠系统和呼吸系统的许多疾病可以表现在口腔中。还存在许多特异性针对口腔的疾病。除了细菌生物体之外，口腔微生物可以包括真菌、原生动物和病毒物种，并且许多这些微生物附着到牙齿、龈沟、舌和颊粘膜。每个位点具有允许细菌建立其驻留的独特方式。每个位点具有允许所述生物体建立其驻留的独特方式。许多这些微生物可以附着到它们在口腔中时接触到的聚合物并被捕获在所述聚合物中，这些聚合物除了如上所述的口香糖之外还包括牙齿和牙周装置和组合物。
[0006]因此，对于检测、鉴定和定量附着到口腔中的聚合物的微生物、例如包含在使用后的口香糖上或口香糖内的细菌的新方法的开发，存在着需求。
[0007]发明概述
[0008]已知口香糖有助于维护口腔健康;然而，不清楚口香糖是否能够实际上从口腔移除细菌和其他微生物。本发明提供了一种用于对在使用(例如体内咀嚼、手指揉捏(fingerchewing)或机器人或人工模拟的咀嚼)后包含在口香糖上和口香糖内的微生物进行检测和定量的方法。本文中提供的研究描述了对咀嚼后包含在口香糖上和口香糖内的微生物的数目进行定量和定性的方法。
[0009]本发明提供了检测和定量包含在口香糖上或口香糖内的微生物的数目的方法。术语“包含在……的”是指附着或粘附于所述口香糖的微生物，包括在咀嚼过或手指揉捏过的口香糖内或被捕获在其皱褶中的微生物。
[0010]在本发明的一种情况下，本发明提供了检测包含在口香糖上或口香糖内的微生物的方法，所述方法包括:a)在从所述口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉积在悬液中的条件下对所述口香糖进行超声处理，b)在促进集落形成的条件下将至少一部分所述悬液与固体支持物相接触，其中集落在所述固体支持物上的形成表明包含在所述口香糖上或口香糖内的微生物的存在。在这种方法中，可以在超声处理之前将所述口香糖与哺乳动物的口腔进行接触，例如所述哺乳动物咀嚼所述口香糖，或者将所述微生物附着到哺乳动物口腔外部的口香糖，例如通过如实施例1中所描述的手指揉捏或通过机械或机器人咀嚼模拟器。“固体支持物”是微生物例如细菌、真菌、原生动物或病毒可以在其中生长的基质，例如包含琼脂或另一种惰性固化剂例如明胶的培养基。
[0011 ]超声处理是指施加声能例如超声以搅动样品中的粒子的行动，例如对口香糖进行超声处理以移除附着于它的微生物例如细菌。某些超声处理器利用直接接触样品的探头。基于水浴的超声处理器具有位于水槽下方间接地搅动样品的超声波发生元件。所述超声处理必须在标准化尺寸下进行，例如对使用模具成型成特定形状的口香糖进行超声处理。所述模具可以是具有标准化尺寸的任何形状，并且可以是仅仅略微粘附或不粘附口香糖的任何材料，例如聚四氟乙烯(TEFLON)。
[0012]所述检测包含在口香糖上或口香糖内的微生物的方法还可以包括对包含在咀嚼过的口香糖上或口香糖内的微生物进行定量的步骤，其中集落的数目指示了包含在所述口香糖上和口香糖内的微生物的数量。所述定量可以包括产生标准曲线以确定包含在所述口香糖上或口香糖内的微生物的数量。对口香糖进行超声处理和产生标准曲线的组合，允许使用所述口香糖表面上的微生物数目来外推包含在所述口香糖上或口香糖内的微生物的总数。
[0013]在本发明的另一种情况下，本发明提供了检测哺乳动物口腔中微生物的存在的方法，所述方法包括:a)在从与哺乳动物口腔发生接触的口香糖移除所述微生物并使微生物沉积在悬液中的条件下，对所述口香糖进行超声处理，b)在促进集落形成的条件下将至少一部分所述悬液与固体支持物相接触，其中集落在所述固体支持物上的形成表明在所述哺乳动物的口腔中存在微生物。所述超声处理可以在标准化尺寸下进行，例如对使用模具成型成特定形状的口香糖进行超声处理。
[0014]所述检测哺乳动物口腔中微生物的存在的方法还可以包括对包含在所述哺乳动物口腔内的微生物进行定量的步骤，其中集落的数目指示了所述哺乳动物口腔内的微生物的数量。所述定量可以包括产生标准曲线以确定所述哺乳动物口腔内的微生物的数量。
[0015]在本发明的另一种情况下，本发明提供了对包含在口香糖上或口香糖内的微生物进行定量的方法，所述方法包括:a)在从所述口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉积在悬液中的条件下对所述口香糖进行超声处理，b)在促进集落形成的条件下将至少一部分所述悬液与固体支持物相接触，以及c)对在所述固体支持物上形成的集落进行定量，其中所述集落的数目指示了包含在所述口香糖上和口香糖内的微生物的数量。所述对附着到口香糖的微生物进行定量的方法还可以包括产生标准曲线以确定附着到所述口香糖的微生物的数量的步骤。所述超声处理可以在标准化尺寸下进行，例如对使用模具成型成特定形状的口香糖进行超声处理。
[0016]任何上述方法还可以包括鉴定所述微生物的步骤。这些微生物包括细菌、病毒、真菌和原生动物。例如，通过本发明的方法检测和定量的细菌包括口腔的病原性或共生性细菌，例如变形链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀卩卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中间P卜啉单胞菌(Porphyromonas intermedia)、福赛斯拟杆菌(Bacteroides forsythus)、福赛斯坦纳菌(TanneraeI la forsythia)、直肠弯曲杆菌(Campylobacterrectus)、缠结优杆菌(Eubacterium nodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcus micros)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、伴放线放线杆菌(Aggregetibacter actinomycetemcomitans)、齿垢密螺方定体(Treponemadenticola)、嗤蚀艾肯菌(Eikenella corrodens )、牙銀二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、小韦荣球菌(Vei I lone I la parvula)、具核梭杆菌(Fuso bacterium nucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotel Iaintermedia)、唾液乳杆菌(Lactobaci I Ius sal ivarius)、唾液链球菌(Streptococcus sal ivarius)和远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)。
[0017]此外，任何上述本发明的方法还可以包括在哺乳动物对象中诊断微生物感染的步骤，其中将所述口香糖与所述对象的口腔进行接触，并且其中包含在所述口香糖上或口香糖内的微生物的存在指示了所述对象中的微生物感染。
[0018]本发明的另一种情况提供了产生哺乳动物对象口腔的微生物分布情况的方法，所述方法包括:a)将口香糖与所述对象的口腔相接触，b)检测在与所述对象的口腔接触后包含在延展性聚合物上或聚合物内的至少一种微生物的存在和不存在，其中至少一种微生物类型的存在或不存在确定了所述对象口腔的微生物分布情况。当所述延展性聚合物是口香糖时，所述微生物可以被包含在所述口香糖上或包含在咀嚼过或手指揉捏过的口香糖的皱褶内。术语“微生物类型”取决于鉴定方法，是指微生物的单一科、属、种、株、血清型或血清群。该微生物可以是细菌、病毒、真菌或原生动物。所述微生物分布情况可能包含关于至少一种微生物类型、至少两种微生物类型、至少5种微生物类型、至少10种微生物类型、至少20种微生物类型、至少50种微生物类型、至少100种微生物类型或至少500种微生物类型的信息。所述分布情况可能包含仅仅一种微生物类型或多种不同的微生物类型。
[0019]具体来说，本发明提供了“细菌分布情况”，其包含关于至少一种细菌类型、至少两种细菌类型、至少5种细菌类型、至少10种细菌类型、至少20种细菌类型、至少50种细菌类型、至少100种细菌类型或至少500种细菌类型的信息。
[0020]本发明还提供了病毒分布情况，其包含关于至少一种病毒类型、至少两种病毒类型、至少5种病毒类型、至少10种病毒类型、至少20种病毒类型、至少50种病毒类型、至少100种病毒类型和至少500种病毒类型的信息。
[0021]另外，本发明提供了微生物分布情况，其包含关于至少一种真菌类型(真菌分布情况)、至少两种真菌类型、至少5种真菌类型、至少10种真菌类型、至少20种真菌类型、至少50种真菌类型、至少100种真菌类型或至少500种真菌类型的信息。
[0022]另外，本发明提供了微生物分布情况，其包含关于至少一种原生动物类型(原生动物分布情况)、至少两种原生动物类型、至少5种原生动物类型、至少10种原生动物类型、至少20种原生动物类型、至少50种原生动物类型、至少100种原生动物类型或至少500种原生动物类型的信息。
[0023]这些方法还可以任选地包括将所述哺乳动物对象的微生物分布情况与参比微生物分布情况进行比较的步骤，其中所述参比分布情况指示了对口腔的疾病、障碍或病症的增加的易感性，以及对所述微生物分布情况进行评分，以确定所述对象是否对口腔疾病或障碍具有增加的易感性的步骤。此外，这些方法可以任选地包括对包含在所述口香糖上和口香糖内的微生物进行定量的步骤。
[0024]术语“微生物分布情况”是指至少一种类型的微生物的存在或不存在，所述微生物至少被部分鉴定或表征，以便可以监测任何特定样品中所述微生物的存在或不存在。术语“微生物分布情况”包括细菌分布情况、病毒分布情况、原生动物分布情况和真菌分布情况及其组合。术语“参比微生物分布情况”是指为已知对照或标准样品产生的微生物分布情况，例如已知对口腔疾病、障碍或病症具有提高的易感性的对象的参比分布情况。例如，所述微生物分布情况可能包含一种或多种类型的细菌、一种或多种类型的真菌、一种或多种类型的原生动物或一种或多种类型的病毒。此外，所述微生物分布情况可能包含微生物的组合，例如一种或多种类型的细菌、病毒、真菌和/或原生动物。
[0025]当参比分布情况中的一种或多种微生物存在于对象的微生物分布情况中时，所述对象的微生物分布情况与所述参比细菌分布情况相关。为了确定对象微生物分布情况是否与参比微生物分布情况相关，对所述分布情况进行评分以将所述对象微生物分布情况与所述参比分布情况进行比较。
[0026]术语“细菌分布情况”是指至少一种类型的细菌的存在或不存在，所述细菌至少被部分鉴定或表征，以便可以监测任何特定样品中所述细菌的存在或不存在。术语“参比细菌分布情况”是指为已知对照或标准样品产生的细菌分布情况，例如已知对口腔疾病、障碍或病症具有提高的易感性的对象的参比分布情况。
[0027]当参比分布情况中的一种或多种细菌存在于对象的细菌分布情况中时，所述对象的细菌分布情况与所述参比细菌分布情况相关。为了确定对象细菌分布情况是否与参比细菌分布情况相关，对所述分布情况进行评分以将所述对象微生物分布情况与所述参比分布情况进行比较。
[0028]产生细菌分布情况的方法可能检测一种或多种类型的细菌。例如，被检测以产生细菌分布情况下的细菌包括变形链球菌(S t r e P t ο c ο c c u s mutans)、口腔链球菌(Streptococcus ora I i s )、内氏放线菌(Ac t inomy ce s nae s I und i i )、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀P卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中间P卜啉单胞菌(Porphyromonas intermedia)、福赛斯拟杆菌(Bacteroides forsythus)、福赛斯坦纳菌(Tannerael la forsythia)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus )、缠结优杆菌(Eubacterium nodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcus micros)、中间链球菌(Streptococcus intermedius )、伴放线放线杆菌(Aggregetibacteractinomycetemcomitans)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、乳杆菌(Lactobacillus)、嗤蚀艾肯菌(Eikenella corrodens )、牙銀二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、小韦荣球菌(Ve i Ilonel la parvula)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)和远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)等。
[0029]此外，本发明的任何微生物分布情况可用于确定对象对发生疾病、病症或障碍的易感性，所述疾病、病症或障碍例如慢性牙周炎、急性成人牙周炎、牙龈炎例如急性坏死溃疡性牙龈炎、奋森氏咽峡炎(战壕口炎)、龋齿、疱疹病毒感染、原发性疱疹性龈口炎或口腔疱疹(唇疱疹和口疮)、生殖器疱疹、水痘-带状疱疹病毒感染例如水痘或带状疱疹、流感、普通感冒、性病、单核细胞增多症、柯萨奇病毒感染例如手足口病、疱疹性咽峡炎、急性淋巴结性咽炎、流行性腮腺炎、麻疹、风疹(德国麻疹)、非洲伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、口腔毛状白斑、幼儿急疹、卡波斯肉瘤、念珠菌病、急性假膜型念珠菌口炎(鹅口疮)、急性萎缩性(红斑型)念珠菌病、慢性增生性念珠菌病、慢性萎缩性(红斑型)念珠菌病、曲霉病、隐球菌病、组织胞浆菌病、芽生菌病、副球孢子菌病和接合菌病(毛霉菌病)。
[0030]另一方面，本发明提供了用于执行任何前面本文中描述的方法的试剂盒。具体来说，本发明提供了用于对包含在咀嚼过的口香糖上或口香糖内的微生物进行检测或定量或用于产生哺乳动物对象中的细菌分布情况的试剂盒。
【附图说明】
[0031]图1提供了用于实施例1中描述的手指揉捏过的口香糖的校准曲线。所述曲线描绘了在手指揉捏后收回的细菌的量，被表示成随着手指揉捏进的细菌的起始量的变化。
[0032]图2提供了被捕获在口香糖中的细菌数目随时间的变化，所述细菌数目用使用校准曲线确定的集落形成单位(CFU;对数单位)表示。详细描述
[0033]本发明提供了使用超声处理从咀嚼过的口香糖移除微生物，以检测和定量包含在所述口香糖上或捕获在口香糖内的微生物例如细菌的方法。术语“包含在……的”是指附着于或粘附于所述口香糖的微生物，包括在咀嚼过或手指揉捏过的口香糖内或捕获在所述口香糖的皱褶中的微生物。具体来说，本发明提供了检测和定量包含在咀嚼过的口香糖上和所述口香糖内的细菌的方法，所述方法使用超声处理从所述口香糖移除所述细菌，并在促进集落生长的条件下将所述细菌沉积在固体支持物上，其中细菌集落在所述固体支持物上的形成表明包含在所述口香糖上或口香糖内的细菌的存在。形成的集落数目允许产生如实施例I中所述的标准校准曲线。这种方法不依赖于细菌类型或试验的口香糖类型，始终如一地确定包含在口香糖上和口香糖内的细菌数目。由于超声处理只能释放附着于口香糖表面的细菌，因此收回的细菌数目比咀嚼进入的细菌数目低大约I个对数单位。
[0034]校准曲线的使用允许计算包含在口香糖上或包含在口香糖内的细菌数目。具体来说，对口香糖进行超声处理和产生标准曲线的组合允许使用口香糖表面上的微生物数目来外推包含在口香糖上和口香糖内的微生物的总数。产生校准曲线的一种方法是对口香糖进行超声处理，其中所述口香糖具有标准化尺寸，例如使用模具造型成特定形状的口香糖。这种模具为给定重量的口香糖提供固定的表面积，使得附着于口香糖表面的微生物的数目将充当计算口香糖体积内的微生物数目的手段。
[0035]所述模具可以是具有标准化尺寸的任何形状，例如所述模具是尺寸为15x15x4mm的长方形或尺寸为12mm3的立方体。所述模具可以是任何材料，例如也被称为TEFLON或DYNEON的聚四氟乙烯(PTFE)，也被称为KYNAR、HYLAR和SOLEF的聚偏氟乙烯(PVDF)，也被称为DELRIN、CELCON、DURAC0N和H0STAF0RM的聚甲醛(POM )，也被称为TEFZEL的乙烯四氟乙烯(ETFE)，也被称为TORLON的聚酰胺-酰亚胺，全氟烷氧基(PFA)或氟化的乙烯丙烯(FEP)。
[0036]校准方法的一致性是令人吃惊的，并且不论包含在口香糖上或口香糖内的细菌类型如何都允许准确的试验。例如，实施例1中描述的实验使用体外手指揉捏方法。本发明还设想了使用人工或机器人咀嚼模拟器执行本发明，它们重现在咀嚼期间执行的下颂运动。手指揉捏实验表明收回的细菌比实际上咀嚼进去的细菌少约I个对数单位。尽管回收率低，但其说明了在手指揉捏过程中损失的细菌数目，绝大多数仍被捕获在口香糖嚼团中。校准曲线说明了这些损失，并使被捕获的细菌量的估算更加准确。此外，本发明的方法仅仅对可培养的活微生物进行计数。回收率的一致性非常高，例如对于广范围的浓度一致地观察到细菌从口香糖的10%回收。在本文描述的实验中，杆状的内氏放线菌(A.naeslundii)表现出比球状菌株更高的损失，这可能可以归因于粘附性质的差异，因为内氏放线菌(A.naeslundii)是已知对表面具有强粘附性的细菌。当口香糖接触哺乳动物的口腔时，微生物例如细菌粘附于口香糖。因此，本发明的方法可用于检测哺乳动物口腔中微生物的存在。口腔中某些微生物例如细菌的存在的知识，可用于诊断口腔的感染或其他疾病或障碍。此外，口腔中某些微生物例如某些细菌的存在，可以允许确定哺乳动物发生口腔的传染疾病或障碍的风险或易感性。
[0037]口香糖
[0038]口香糖通常由不溶于水的胶基、水溶性部分和调味剂构成。在咀嚼期间，经过一段时间，所述水溶性部分随着一部分口香糖的调味剂消散。所述胶基部分在整个咀嚼过程中保留在口中。
[0039]所述不溶性胶基通常包含弹性体、树脂、脂肪和油、软化剂和无机填充剂。所述胶基可能包括或者也可能不包括蜡。所述不溶性胶基可以占口香糖重量的约5%至约95%，更通常地，所述胶基占所述口香糖的10 %至约50 %，并且在某些优选实施方式中，占所述口香糖重量的约25%至约35 %。
[0040]例如，本发明的口香糖胶基含有约20 %至约60重量%的合成弹性体、约O %至约30重量%的天然弹性体、约5 %至约55重量%的弹性体增塑剂、约4 %至约35重量%的填充剂、约5%至约35重量％的软化剂和任选的少量(约I重量％或更少)混杂成分例如着色剂、抗氧化剂等。
[0041]合成弹性体可以包括但不限于凝胶渗透层析(GPC)重均分子量为约10，000至约95，000的聚异丁烯、异丁烯-异戊二烯共聚物(丁基弹性体)、苯乙烯-丁二烯、苯乙烯-丁二烯比率为约1:3至约3:1的共聚物、GPC重均分子量为约2,000至约90,000的聚乙酸乙烯酯、聚异戊二烯、聚乙烯、月桂酸乙烯酯含量为共聚物的约5%至约50重量％的乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯共聚物，及其组合。
[0042]聚异丁烯的优选范围为50,000至80，000GPC重均分子量，苯乙烯-丁二烯的优选范围为1:1至1:3范围的苯乙烯-丁二烯，聚乙酸乙烯酯的优选范围为10，000至65，00068(:重均分子量，更高分子量的聚乙酸乙烯酯通常用于泡泡糖胶基中，乙酸乙烯酯-月桂酸乙烯酯的优选范围为10-45%的月桂酸乙烯酯含量。
[0043]天然弹性体可以包括天然橡胶例如烟熏过的或液体乳胶和银菊胶，以及天然树胶例如节路顿胶、lechi casp1、perillo、索马胶、二齿铁线子胶、巧克力铁线子胶、nispero、rosindinha、糖胶树胶、马来乳胶(gutta hang kang)及其组合。优选的合成弹性体和天然弹性体浓度随着在其中使用所述胶基的口香糖是粘附型还是常规型、是泡泡糖还是普通口香糖而变，正如下面讨论的。优选的天然弹性体包括节路顿胶、糖胶树胶、索马胶和二齿铁线子胶。
[0044]弹性体增塑剂可以包括但不限于天然的松香酯如部分加氢松香的甘油酯、聚合松香的甘油酯、部分二聚松香的甘油酯、松香的甘油酯、部分加氢松香的季戊四醇酯、松香的甲酯和部分氢化的甲酯、松香的季戊四醇酯，合成物质例如源自于蒎烯、β_蒎烯和/或d-柠檬烯的萜烯树脂，以及上述物质的任何适合的组合。优选的弹性体增塑剂也将随着具体应用和使用的弹性体类型而变。
[0045]填充剂/调质剂可以包括碳酸镁和碳酸钙、碎石灰、硅酸盐类型例如硅酸镁和硅酸铝、粘土、氧化铝、滑石、钛氧化物、磷酸单钙、二钙和三钙、纤维素聚合物如木材及其组合。
[0046]软化剂/乳化剂可以包括动物脂、氢化动物脂、氢化和部分氢化的植物油、可可脂、单硬脂酸甘油酯、三乙酸甘油酯、卵磷脂、甘油单酯、二酯和三酯、乙酰化的甘油单酯、脂肪酸(例如硬脂酸、棕榈酸、油酸、油酸、亚油酸)及其组合。着色剂和增白剂可以包括ro&c类型的染料和色淀、水果和蔬菜提取物、二氧化钛及其组合。胶基可以包括或者也可以不包括蜡。
[0047]除了水不溶性胶基部分之外，典型的口香糖组合物包括水溶性增量部分和一种或多种调味剂。所述水溶性部分可以包括增量甜味剂、高强度甜味剂、调味剂、软化剂、乳化剂、着色剂、酸化剂、填充剂、抗氧化剂和提供所需属性的其他组分。
[0048]向口香糖添加软化剂以便优化口香糖的咀嚼性能和口感。也被称为增塑剂和塑化剂的软化剂一般占所述口香糖的约0.5%至约15重量％之间。软化剂可以包括甘油、卵磷脂及其组合。甜味剂水性溶液例如含有山梨糖醇、氢化淀粉水解物、玉米糖浆及其组合的水性溶液，也可以在口香糖中用作软化剂和粘合剂。
[0049]增量甜味剂包括糖和无糖组分两者。增量甜味剂通常占所述口香糖的约5%至约95重量％，更通常为所述口香糖的约20%至约80重量％，更通常为约30%至约60重量％。糖类甜味剂通常包括口香糖技术领域中公知的含糖组分，包括但不限于单独或组合的蔗糖、右旋糖、麦芽糖、糊精、干的转化糖、果糖、左旋糖、半乳糖、玉米浆固形物等。无糖甜味剂包括但不限于糖醇例如单独或组合的山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、氢化淀粉水解物、麦芽糖醇等。
[0050]高强度甜味剂也可以单独或与上述甜味剂组合使用。优选的甜味剂包括但不限于单独或组合的三氯蔗糖、阿斯巴甜、安赛蜜的盐、阿力甜、糖精及其盐、环拉酸及其盐、甘草酸(glycerrhizinate)、二氢查尔酮、奇异果甜蛋白、罗汉果、应乐果甜蛋白、甜叶菊及其糖苷等。为了提供持续时间更长的甜味和香味感觉，可能希望囊封或以其他方式控制至少一部分人造甜味剂的释放。诸如湿法成粒、蜡法成粒、喷雾干燥、喷雾激冷、流化床包衣、凝聚和纤维延伸的技术，可用于实现所需的释放特性。
[0051]糖和/或无糖甜味剂的组合可用于口香糖中。此外，软化剂也可能提供额外的甜味，例如使用糖或糖醇的水性溶液。
[0052]本发明提供了检测包含在在活生物体中可延展的聚合物上或所述聚合物内的微生物的检测方法。此外，本发明提供了确定来自于活生物体的唾液样品的微生物分布情况的方法。唾液样品的微生物分布情况可用于确定所述生物体对发生龋齿或牙周疾病的易感性或风险，不论所述微生物目前是否正引起感染。此外，本发明的方法可用于质量控制方法，以确定聚合物对微生物的附着或捕获是易感还是有抗性。
[0053]微生物
[0054]本发明提供了检测、鉴定和定量包含在口香糖上或口香糖内的微生物的方法。术语“微生物类型”取决于鉴定方法，是指特定微生物的单一科、属、种、株、血清型或血清群。
[0055]“微生物”是指微观生物体，其可以是单细胞或多细胞生物体，并且对宿主生物体来说可以是病原性或共生的。本发明提供了检测和定量包含在在活生物体中可延展的聚合物上和所述聚合物内的微生物的方法，并且这些微生物包括细菌、病毒、真菌和原生动物。
[0056]例如，本发明提供了检测、鉴定和定量包含在口香糖上或口香糖内的细菌的方法。术语“细菌类型”取决于鉴定方法，是指细菌的单一科、属、种、株、血清型或血清群。
[0057]所述细菌可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，并且可以是厌氧或好氧细菌。所述细菌可以是球菌(球形)或杆菌(杆状)。本发明特别设想了检测口腔细菌例如共生性口腔细菌和病原性口腔细菌的方法，所述细菌例如链球菌(strep toco cci)、乳杆菌(Iactobacilli )、葡萄球菌(staphylococci)、棒状杆菌(corynebacteria)、放线菌(actinomcyes sp.)、梭杆菌(fusobacterium sp.)和各种不同的厌氧菌特别是拟杆菌(bacteroides)。示例性的口腔细菌包括变形链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、唾液链球菌(Streptococcus sal i varius)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii )、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀卩卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中间P卜啉单胞菌(Porphyromonas intermedia)、福赛斯拟杆菌(Bacteroides forsythus)、坦纳菌(Tanneraella)。
[0058]本发明还提供了检测、鉴定和定量附着于口香糖的病毒的方法。术语“病毒类型”取决于鉴定方法，是指病毒的单一科、属、种、株、血清型或血清群。
[0059]所述病毒可以是疱疹病毒科的成员例如人疱疹病毒(HHV)，包括HHV-1 (也被称为单纯性疱疹病毒(HSV)-1)、HHV-2(HSV-2)、HHV-3(也被称为水痘-带状疱疹病毒)、HHV-4(Epstein-Barr病毒)、HHV_5(细胞肥大病毒)、HHV-6、HHV_7和HHV-8。
[0060]所述病毒可以是小RNA病毒科(肠病毒属)的成员，例如脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组、柯萨奇病毒B组、埃可病毒。具体来说，所述病毒可能引起手足口病例如柯萨奇病毒八16^5)7^10、82和85，引起疱疹性咽峡炎的病毒例如柯萨奇病毒41-6^8^10和422，以及肠病毒(Enterovirus)71(EV_71) ο
[0061]所述病毒可以是乳多空病毒科的成员，例如人乳头瘤病毒家族(HPV)，包括HPV-16、HPV-18、HPV-33和HPV-35。所述病毒可以是副粘病毒科(腮腺炎病毒属)的成员，例如流行性腮腺炎病毒、新城疫病毒、人副流感病毒2、4a和4b型。所述病毒可以是副粘病毒科(麻疹病毒属)的成员。此外，所述病毒可以是披膜病毒科(风疹病毒属)的成员。所述病毒也可以是犬口腔乳头瘤病毒、猫杯状病毒和猫疱疹病毒。
[0062]所述病毒也可以是流感病毒例如人流感病毒A例如HlNl和H3N3、人流感病毒B和人流感病毒C。所述病毒可以是引起普通感冒的病毒例如鼻病毒。
[0063]某些疱疹病毒(单纯性疱疹和水痘-带状疱疹病毒，水痘和带状疱疹的病因)是牙龈炎的已知病因。其他疱疹病毒(细胞肥大病毒和Epstein-Barr)也可能在某些类型的牙周疾病、包括侵袭性和严重慢性牙周疾病的发生或发展中发挥作用。所有疱疹病毒经历活动期，随后是潜伏期，并可能重新激活。这些病毒可能以不同方式引起牙周疾病，包括释放出组织破坏性细胞因子、牙周细菌的过度生长、抑制免疫因子和启动导致细胞死亡的其他疾病过程。
[0064]本发明还提供了检测、鉴定和定量附着于口香糖的真菌的方法。术语“真菌类型”取决于鉴定方法，是指真菌的单一科、属、种、株、血清型或血清群。
[0065]本发明的方法可以检测真菌例如假丝酵母如白假丝酵母(Candida albicans)、曲霉(Aspergillus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcusgattii)、荚膜组织胞楽菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis )、巴西副球抱子菌(Paracoccid1ides brasiI iensis)、粗球抱子菌(Coccid1de simmites)和接合菌类(Zygomycota)。
[0066]本发明提供了检测、鉴定和定量附着于口香糖的原生动物的方法。术语“原生动物类型”取决于鉴定方法，是指原生动物的单一科、属、种、株、血清型或血清群。
[0067]本发明的方法可以检测原生动物例如齿銀内阿米巴(Entamoeba gingival is)和口腔毛滴虫(Trichomonas tenax) ο
[0068]本发明设想了检测引起口腔疾病和障碍或与口腔疾病和障碍相关的微生物，所述口腔疾病和障碍例如牙周疾病(牙龈组织的炎症或感染)例如慢性牙周炎和急性成人牙周炎、牙龈炎例如急性坏死溃疡性牙龈炎、奋森氏咽峡炎、龋齿、疱疹病毒感染、原发性疱疹性龈口炎或口腔疱疹(唇疱疹和口疮)、生殖器疱疹、水痘-带状疱疹病毒感染例如水痘或带状疱疹、流感、普通感冒、性病、单核细胞增多症、柯萨奇病毒感染例如手足口病、疱疹性咽峡炎、急性淋巴结性咽炎、流行性腮腺炎、麻疹、风疹(德国麻疹)、非洲伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、口腔毛状白斑、幼儿急疹、卡波斯肉瘤、念珠菌病、急性假膜型念珠菌口炎(鹅口疮)、急性萎缩性(红斑型)念珠菌病、慢性增生性念珠菌病和慢性萎缩性(红斑型)念珠菌病、曲霉病、隐球菌病、组织胞浆菌病(也被称为岩洞病、达林氏病、俄亥俄山谷病、网状内皮组织增殖、3?6111111?^、肺病和0&￥紅’8病)、芽生菌病(也被称为北美芽生菌病、芽生菌性皮炎和吉耳克里斯特氏病)、副球孢子菌病(也被称为巴西芽生菌病、南美芽生菌病、Lutz-Splendore-de Almeida病和副球孢子菌肉芽肿)、毛霉菌病(毛霉菌感染后)、藻菌病(藻菌感染后)和蛙粪霉病(蛙粪霉感染后)和接合菌病(毛霉菌病)。本发明还提供了由包含在口香糖上或口香糖内的微生物的存在引起或与其相关的任何病症、疾病或障碍的诊断方法。
[0069]微生物集落
[0070]在本发明的一种实施方式中，所述方法包括将微生物例如细菌、病毒、原生动物或真菌的悬液沉积在固体支持物例如包含琼脂或另一种惰性固化剂例如明胶的培养基上。固化程度也可以改变，其中优选僵硬的琼脂以抑制“群涌(swarming)”，半固体或“稀松”的琼脂被用于观察其他特征。在使用前，这些培养基优选是无菌的。
[0071]所述固体支持物可以是包含固体培养基的斜面培养皿、稳定培养皿或皮氏培养皿。所述固体培养基具有的物理结构允许细菌以在物理上提供信息或有用的方式生长例如生长成集落或条纹。术语“集落”是指生长在固体培养基上或固体培养基中的细胞或生物体的堆或团。本发明设想了所述固体培养基可以包含色度指示剂，是选择性培养基或鉴别培养基。
[0072]在本发明中使用的营养培养基是适合于细菌生长、维持、储存、分化、分离和/或鉴定的任何液体或固体制备物。这些培养基包括用于起始培养(或传代培养)、用于富集或用于各种不同生物体的诊断(鉴定)试验的培养基。这些试验是可以从给定生物体在特定培养基中或培养基上生长的特性推演出它的身份的试验。
[0073]选择性培养基是指被设计用于抑制某些微生物的生长并在同时允许其他微生物生长的培养基。例如，MacConkey琼脂针对革兰氏阳性细菌进行选择，曙红-亚甲基蓝琼脂针对革兰氏阳性细菌进行选择，并且苯乙醇琼脂针对革兰氏阴性细菌进行选择。鉴别培养基允许超过一种目标微生物生长，但具有形态上可辨别的集落。例如，甘露糖醇盐类琼脂(甘露糖醇发酵=黄色)，血琼脂(各种不同类型的溶血)，MacConkey琼脂(乳糖发酵=黄色)和曙红-亚甲基蓝琼脂(各种不同类型的差异化)。
[0074]对于厌氧细菌来说，培养需要在培养基表面上方不含氧气，并且培养基不含溶解氧。即使在这些条件下，一些厌氧菌也可能不生长，除非培养基已被预先还原，即平衡在特定氧化还原电位处或更低。因此，还原剂，例如含有巯基的还原剂(例如H2S、半胱氨酸、巯基乙醇酸盐)也可以被包含在培养基组成中。通常可获得的适合用于厌氧菌的选择性生长的培养基的实例描述在本发明中，包括但不限于脑心浸液、布鲁氏菌培养基、CDC厌氧菌培养基、Nutrient、Schaedler、巯基乙醇酸盐培养基或胰酪胨大豆培养基。这些培养基具有肉汤或琼脂两种形式。
[0075]此外，可以在厌氧罐、厌氧室或厌氧袋中将培养基制造成厌氧的。厌氧罐是用于在不存在氧的情况下或总的来说在非大气的气态条件下对材料(例如接种的培养基)进行温育的容器。通常已知的这些厌氧罐使用“布鲁尔厌氧罐”、“Gaspak”、“McIntosh和FiIde’s厌氧Si”等的名称。
[0076]将所述培养基用从口香糖移除的细菌的悬液样品接种。在接种培养基或施加到固体支持物之前，可以将所述悬液稀释。在某些实施方式中，所述样品可以被连续稀释，并将连续稀释液用于接种多个培养基，以便获得原始样品中细菌的更精确计数。
[0077]在本发明的另一个实施方式中，所述方法包括生长从所述口香糖移除的细菌，并且可以用从所述口香糖移除的细菌的稀释的悬液接种肉汤培养基。肉汤培养基是指缺少固化基质的培养基。将接种的培养基在允许细菌生长的条件下温育。所述肉汤培养基可能允许检测培养基的类型。例如，所述培养基包含色度指示剂、选择培养基或分化的细菌。
[0078]在本发明方法的某些实施方式中，可以计数样品中存在的微生物的数目。例如，人们可以通过选择允许集落形成的培养基形式来计数样品中的细菌数目。在接种培养基并在允许细菌集落形成的条件下温育后，可以对集落进行计数。可以通过对由细菌产生的磷酸酶与指示剂的反应产生的可检测信号进行计数，来计数集落。在使用磷酸酶底物指示剂5-溴-6-氯-3-B引噪基磷酸酯或6-氯-3-B引噪基磷酸酯的实施方式中，所述可检测信号可以包括红色至红紫色集落。因此，在某些实施方式中，微生物的计数包括在磷酸酯条件下只计数特定颜色的集落例如红色至红紫色集落。适合的可检测信号包括但不限于化学发光信号、荧光信号或电导性的变化。在某些实施方式中，可检测信号的检测可以手动实现，而在其他实施方式中，可检测信号的检测可能需要本领域普通技术人员已知的特殊检测仪器。用于计数特定样品中的微生物的方法可能至少部分依赖于在本发明的方法中使用的可检测信号的类型。
[0079]除了对从口香糖移除的微生物进行定量之外，本发明的方法还可用于鉴定所述从口香糖移除的微生物。所述鉴定可以根据基于形态和代谢特征的分类原则。可以分析集落形态以鉴定从所述口香糖移除的细菌的类型。术语“集落形态”是指集落的视觉特征。外观有差异的集落通常是不同的细菌科、属、种、株、血清型或血清群。集落形态在集落形状、边缘、颜色、表面特点、高度、透光性或色素沉着等的基础上进行评估。
[0080]本领域中已知许多不同试验可以辨别微生物。用于鉴定已知细菌的特定基因或基因区段的分子生物学技术包括PCR、Northern印迹法、常规和脉冲场Southern印迹法、变性梯度凝胶电泳、微阵列、狭线印迹法或斑点印迹法，其使用特异性针对特定科、属、种、株、血清型或血清群的多核苷酸序列。
[0081]例如，确定细菌基因组内16SrRNA和其他区域的序列，可用于鉴定细菌类型。分析化学技术例如确定脂肪酸分布情况、糖类分布情况和泛醌分布情况、分泌的代谢产物例如挥发性醇类和短链脂肪酸的表征，也可用于鉴定细菌的类型。
[0082]在本发明的另一个实施方式中，所述方法包括将病毒的悬液沉积在成片的细胞单层上，所述细胞单层附着在如上所述的固体支持物内，例如包含琼脂、羧甲基纤维素或另一种惰性固化剂例如明胶的培养基。病毒的集落也被称为“病毒噬斑”。当病毒感染固定的单层内的细胞时，形成病毒噬斑。所述病毒裂解所述细胞，感染将蔓延到其他细胞。被感染的细胞产生可以使用显微镜直观观察到的噬斑。用于确定病毒量的测定法在本领域中是公知的，例如利用免疫荧光、比色测量、蛋白质和血凝的测定法，参见例如Kau f man&Kab elitz,Methods of Microb1logy Vol.32,Immunology of Infect1n,Academic Press,2002。
[0083]除了对从口香糖移除的病毒进行定量之外，本发明的方法可用于鉴定所述从口香糖移除的病毒。所述鉴定可以基于用于鉴定已知病毒的特定基因或基因区段的分子生物学技术，包括PCR、Northern印迹法、常规和脉冲场Southern印迹法、变性梯度凝胶电泳、微阵列、狭线印迹法或斑点印迹法，其使用特异性针对特定科、属、种、株、血清型或血清群的多核苷酸序列。显微术也可用于鉴定所述病毒的形态特征，例如观察所述病毒的尺寸、形状或其他显著形态特点。
[0084]试剂盒
[0085]本发明还提供了执行本发明的方法的试剂盒。具体来说，本发明提供了试剂盒，其包含用于检测和/或定量按照本发明的任一方法从口香糖移除的细菌的组分。
[0086]在考虑下面的说明性实施例后，将会理解本发明的其他特点和优点。
实施例
[0087]实施例1
[0088]粘附于手指揉捏的口香糖的细菌的定量
[0089]进行了体外手指揉捏研究以定量粘附于口香糖或口香糖内的细菌。在所述实验中使用两种可商购的留兰香口香糖片:
[0090]口香糖A:商品化留兰香口香糖1(1.5g片装)。以重量计，含量的降序排列的组成:山梨糖醇，胶基，甘油。天然和人造调味剂；少于2%的组分:氢化淀粉水解物，阿斯巴甜，甘露糖醇，安赛蜜K，大豆卵磷脂，木糖醇，胡萝卜素，I号蓝色色淀和丁基化羟基甲苯。
[0091]口香糖B:商品化留兰香口香糖2(1.5g片装)。以重量计，含量的降序排列的组成:山梨糖醇，胶基，甘油，甘露糖醇，木糖醇。天然和人造调味剂;少于2%的组分:安赛蜜K，阿斯巴甜，丁基化羟基甲苯，I号蓝色色淀，大豆卵磷脂和5号黄色色淀。所有口香糖片具有1.5g的标准重量。
[0092]三种不同细菌菌株被用于本研究，口腔链球菌(S.0ralis)J22，变形链球菌(S.mutans) ATCC 25175和内氏放线菌(A.naeslundii )T14V_J1。口腔链球菌(S.0ral is)和内氏放线菌(A.naes lundi i )被认为在体内是牙齿表面的最初定植者，而变形链球菌(S.mutans)是離齿的病因。链球菌在Todd Hewitt肉汤中在37°C下好氧生长，放线菌在脑心浸液中厌氧生长。首先将来自于冷冻储用液的细菌在适合的琼脂平板上生长24小时，随后接种5ml适合的培养基24小时。在新鲜培养基中以1:10稀释制备主培养物16小时。将主培养物超声处理以悬浮细菌聚集体。使用Biirker Tiirk计数室测定细菌浓度，并将浓度调整到每ml 104、105、107 和 19 个细菌。
[0093]对于每种菌株来说，通过将1.5g 口香糖与200μ1细菌悬液一起添加到无菌乳胶手套(无粉末乳胶检查手套，VWR internat1nal ,Radnor，USA)的手指中，将细菌用手指揉捏到口香糖片中。接下来，在30°C水浴中将细菌用手指揉捏到口香糖中5分钟。在手指揉捏后，将口香糖从手指中取出，在无菌水中蘸一次，并置于特氟龙模具(15x 15x Imm)中，使用一副无菌镊子产生可重现的口香糖表面积(± 15x I 5x 4mm)。随后，通过如Syed等(Appl.Microb1logy 24:638-644)中所述在装填有5ml 滤器除菌(Mi I lipor e，Mi 11 ex GS
0.22μηι)的还原型运输流体(RTF)的无菌聚苯乙稀杯中，在水浴超声仪(ELMA TranssonicTP690，Elma GmbH&Co，德国)中超声处理60秒，从口香糖移除细菌。最后，将得到的悬液连续稀释，并铺板在Todd Hewitt肉汤(THB)琼脂或血琼脂板(n0.2血琼脂基料，40g/L，氯高铁血红素5mg/L，甲萘醌lmg/L，绵羊血50ml/L)上。集落形成单位(CFU):在37°C48小时后，对集落形成单位的数目进行计数，并将其转变成捕获在单一口香糖片中的细菌数目。实验进行一式三份。
[0094]为了说明由于粘附于手套表面的内表面而造成的可能的细菌损失，将手套的手指内部翻出，在1ml滤器除菌的RTF中超声处理60秒，并且如上所述将连续稀释液铺在琼脂上，随后确定可能损失的CFU数目。同样地，分析所述手指揉捏的口香糖在其中蘸过(参见上述)的水的细菌损失。在手指揉捏期间，由于粘附于手套表面，损失约0.05对数单位的球菌(口腔链球菌(S.0ralis)和变形链球菌(S.mutans))。粘附于手套表面的内氏放线菌(A.naeslundii)的数目略微更高。由于将手指揉捏的口香糖片蘸在水中引起的细菌损失的量平均为0.004对数单位。在手指揉捏期间的损失与涉及的口香糖无关，然而随着浓度上升而略微降低。
[0095]因此，由于不同的细菌数目被手指揉捏到口香糖样品中，因此可以使用为不同细菌菌株从每种口香糖收回的细菌数目针对手指揉捏的口香糖中捕获的实际细菌数目制作校准曲线。所述校准曲线允许计算附着于手指揉捏过的或咀嚼过的的口香糖或捕获在其中的细菌的量，并且反映出附着于口香糖和口香糖内的微生物的总量。
[0096]为了说明这些损失，在从口香糖收回的细菌数目与手指揉捏进的细菌数目之间获得线性关系(图1)，其不依赖于涉及的细菌菌株或口香糖类型。由于超声处理只能从外表面释放出捕获在口香糖中的细菌，因此收回的细菌数目粗略地比揉捏进的细菌数目低1.5对数单位。
[0097]这项研究进一步证实了本发明的方法可以检测和定量包含在口香糖上和口香糖内的口腔细菌。
[0098]实施例2
[0099]粘附于体内咀嚼的口香糖的细菌的定量
[0100]进行了一项体内研究以证实口香糖可以从口腔移除细菌。健康的人类志愿者提供了参与本研究的书面知情同意书。所述研究的包含判据是每位志愿者健康状况良好，并且他们的恒牙具有至少16种天然元素。排除判据是在研究前的一个月中使用抗生素或漱口水。此外，志愿者在研究期间不使用抗生素、漱口水和其他口香糖类型。所有实验进行一式两份。
[0101]接下来，要求志愿者咀嚼两种不同的口香糖类型不同量的时间，最长10分钟，并使用标准化尺寸下咀嚼过的口香糖片的超声处理，根据CFU来确定咀嚼到所述口香糖中的细菌数目。细菌数目的确定，在咀嚼后不久产生附着的细菌的初始峰。随着咀嚼时间增加直至10分钟，细菌附着减少。
[0102]对于本领域技术人员来说，在考虑了目前优选的实施方式后，预期可以在本发明的实践中做出大量改良和改变。因此，应该被置于本发明的范围之上的唯一限制是在权利要求书中出现的限制。
【主权项】
1.一种检测包含在口香糖上或口香糖内的微生物的方法，所述方法包括: a)在从所述口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉积在悬液中的条件下对所述口香糖进行超声处理， b)在促进集落形成的条件下将至少一部分所述悬液与固体支持物相接触，其中集落在所述固体支持物上的形成表明在所述口香糖上或口香糖内存在微生物。2.权利要求1的方法，其中所述超声处理在标准化尺寸下进行。3.权利要求1或2的方法，其还包括对包含在所述口香糖上和口香糖内的所述微生物进行定量的步骤，其中集落的数目指示包含在所述口香糖上和口香糖内的微生物的总量。4.权利要求3的方法，其中所述定量包括产生标准曲线以确定包含在所述口香糖上和口香糖内的微生物的数量。5.一种检测哺乳动物口腔中微生物的存在的方法，所述方法包括: a)在从与哺乳动物口腔发生接触的口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉积在悬液中的条件下，对所述口香糖进行超声处理， b)在促进集落形成的条件下将至少一部分所述悬液与固体支持物相接触，其中集落在所述固体支持物上的形成表明在所述哺乳动物的口腔中存在微生物。6.权利要求5的方法，其中所述超声处理在标准化尺寸下进行。7.权利要求5或6的方法，其还包括对所述哺乳动物口腔内的所述微生物进行定量的步骤，其中集落的数目指示所述哺乳动物口腔内的微生物的数量。8.权利要求5至7任一项的方法，其中所述定量包括产生标准曲线以确定所述哺乳动物口腔内的微生物的数量。9.一种对包含在口香糖上和口香糖内的微生物进行定量的方法，所述方法包括: a)在从所述口香糖移除所述微生物并使所述微生物沉积在悬液中的条件下对所述口香糖进行超声处理， b)在促进集落形成的条件下将至少一部分所述悬液与固体支持物相接触，以及 c)对在所述固体支持物上形成的集落进行定量，其中所述集落的数目指示包含在所述口香糖上和口香糖内的微生物的总量。10.权利要求9的方法，其中所述超声处理在标准化尺寸下进行。11.权利要求9或10的方法，其还包括产生标准曲线以确定包含在所述口香糖上和口香糖内的微生物的数量的步骤。12.权利要求1-11任一项的方法，其还包括鉴定所述微生物的步骤。13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述微生物是细菌、病毒、真菌或原生动物。14.权利要求13的方法，其中所述细菌是变形链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii )、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀 P 卜啉单胞菌(Porphyromonas gingival is)、中间P卜啉单胞菌(Porphyromonas intermedia)、福赛斯拟杆菌(Bacteroides forsythus)、福赛斯坦纳菌(Tanneraella forsythia)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus )、缠结优杆菌(Eubacterium nodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcus micros)、中间链球菌(Streptococcus intermedius )、伴放线放线杆菌(Aggregetibacteractinomycetemcomitans)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、乳杆菌(Lactobac i I Ius )、嗤蚀艾肯菌(Eikenella corrodens )、牙銀二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、小韦荣球菌(Vei I lone I la par vula)、具核梭杆菌(Fuso bacterium nucleatum)、中间普雷沃菌(Prevotella intermedia)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、唾液链球菌(Streptococcus sal ivarius)和远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)。15.权利要求1-14任一项的方法，其还包括在哺乳动物对象中诊断感染的步骤，其中将所述口香糖与所述对象的口腔进行接触，并且其中包含在所述口香糖上或口香糖内的微生物的存在指示所述对象中的感染。16.—种在哺乳动物对象的口腔中诊断感染的体外方法，所述方法包括按照权利要求1-14任一项的方法检测包含在口香糖上或口香糖内的微生物，其中将所述口香糖与所述对象的口腔进行接触，并且其中所述口腔内所述微生物的存在指示所述对象中的细菌感染。17.—种确定哺乳动物对象发生口腔内感染的易感性的体外方法，所述方法包括按照权利要求1-14任一项的方法检测微生物，其中将所述口香糖与所述哺乳动物的口腔进行接触，并且其中所述口腔内所述微生物的存在指示所述对象中对感染的增加的易感性。18.一种产生哺乳动物对象口腔的微生物分布情况的方法，所述方法包括: a)将口香糖与所述对象的口腔相接触，以及 b)检测在与所述对象的口腔接触后包含在所述口香糖上或口香糖内的至少一种微生物类型的存在和不存在， 其中至少一种微生物类型的存在或不存在确定了所述对象口腔的微生物分布情况。19.权利要求18的方法，其中所述方法还包括下列步骤: c)将所述哺乳动物对象的微生物分布情况与参比微生物分布情况进行比较，其中该参比分布情况指示对口腔疾病或障碍的增加的易感性，以及 d)对所述微生物分布情况进行评分，以确定所述对象是否对口腔疾病或障碍具有增加的易感性。20.权利要求18或19的方法，其还包括对包含在所述口香糖上或口香糖内的微生物进行定量的步骤。21.权利要求20的方法，其还包括产生标准曲线以定量所述微生物。22.权利要求18-21任一项的方法，其中所述微生物是细菌、病毒、真菌或原生动物。23.权利要求22的方法，其中所述细菌是变形链球菌(Streptococcusmutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、内氏放线菌(Actinomyces naeslundii )、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、牙銀P卜啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、中间P卜啉单胞菌(Porphyromonas intermedia)、福赛斯拟杆菌(Bacteroides forsythus)、福赛斯坦纳菌(Tannerael la forsythia)、直肠弯曲杆菌(Campylobacter rectus )、缠结优杆菌(Eubacterium nodatum)、微小消化链球菌(Peptostreptococcus micros)、中间链球菌(Streptococcus intermedius )、伴放线放线杆菌(Aggregetibacteractinomycetemcomitans)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、乳杆菌(Lactobacillus)、嗤蚀艾肯菌(Eikenella corrodens )、牙銀二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga gingivalis)、格氏链球菌(Streptococcus gordonii)、小韦荣球菌(Vei Ilonel la parvula)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)和远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)024.—种试剂盒，其用于执行权利要求1-23任一项的方法。
【文档编号】C12Q1/04GK105899671SQ201580004251
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月9日
【发明人】阿马兰特·梅特拉, 斯特凡·韦塞尔, 亨尼·C·范德密, 亨克·J·比舍
【申请人】Wm.雷格利Jr.公司