葡糖基甜菊组合物的制作方法

葡糖基甜菊组合物的制作方法
【专利摘要】从甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)的甜菊醇糖苷制得葡糖基甜菊组合物。使用淀粉作为葡萄糖残基的来源，通过环糊精葡聚糖转移酶进行葡糖基化。将葡糖基甜菊组合物纯化至>总甜菊醇糖苷的95％含量。组合物可以用作食品、饮料、化妆品和药品中的甜味增强剂、风味剂、风味增强剂和甜味剂。
【专利说明】葡糖基甜菊组合物
[0001]发明背景 发明领域
[0002] 本发明涉及用于从甜菊(Stevia rebaudiana Bertoni)植物的提取物生产高度纯 化的食品成分的方法，及其在各种食品和饮料中的用途。
[0003] 相关领域的描述
[0004] 由于认识到许多疾病与食用高糖食品和饮料相关，现在糖替代品正受到日益剧增 的关注。然而，由于安全性的问题，许多人造甜味剂，如甜精、环己基氨基磺酸钠和糖精在一 些国家被禁止或限制。因此，天然来源的无热量甜味剂正变得越来越流行。甜味草甜菊 (Stevia rebaudiana Bertoni)产生多种双砲糖苷，其特征在于优于许多其他高效甜味剂 那些的高强度甜味和感官特性。
[0005] 上述甜味糖苷，具有共同的糖苷配基，甜菊醇，并且区别在于C13和C19位置的碳水 化合物残基的数量和类型。甜菊的叶子能够累积多达10-20% (基于干重)甜菊醇糖苷。甜菊 叶子中发现的主要糖苷是莱鲍迪苷A(2-10% )、甜菊苷(2-10% )和莱鲍迪苷C(l-2% )。其他 糖苷，如莱鲍迪苷B、D、E和F，甜菊双糖苷和甜茶苷，以低得多的水平被发现(大约0-0.2%)。
[0006] 两种主要的糖苷-甜菊苷和莱鲍迪苷A得到了广泛研究，并且就其作为商业高强度 甜味剂的合适性进行了表征。碳酸饮料中的稳定性研究证实了它们的热和pH稳定性(Chang S.S.,Cook,J.M.(1983)Stability studies of stevioside and Rebaudioside A in carbonated beverages (甜菊苷和莱鲍迪苷A碳酸饮料中的稳定性研究），J. Agric . Food Chem.31:409-412)〇
[0007] 甜菊醇糖苷彼此的差异不仅在于分子结构，而且还在于其味道特性。通常，发现甜 菊苷比蔗糖甜110-270倍，莱鲍迪苷Α为150至320倍，而莱鲍迪苷C比蔗糖甜40-60倍。杜克苷 A比蔗糖甜30倍。莱鲍迪苷A具有最少的涩味、最少的苦味和最不持久的余味，因此在主要的 甜菊醇糖苷中具有最受欢迎的感官属性（Tanaka 0.(1987) Improvement of taste of natural sweetners(天然甜味剂的味道的改良）·Pure Appl ·Chem.69:675-683;Phillips K.C.(1989)Stevia: steps in developing a new sweetener(甜菊：研发新甜味剂中的步 骤）·见：Grenby Τ·Η·编辑，Developments in sweeteners(甜味剂研发），vol.3.Elsevier Applied Science，伦敦，1-43)。
[0008] 使用水或有机溶剂从甜菊植物提取和纯化甜味糖苷的方法描述于例如美国专利 No.4,361,697;4,082,858;4,892,938;5,972,120;5,962,678;7,838,044和7,862,845中。
[0009] 然而，即使在高度纯化的状态下，甜菊醇糖苷仍然具有不合需要的味道属性，如苦 味、甜的余味、甘草味等。甜菊甜味剂成功商业化的主要障碍之一是这些不合需要的味道属 性。显示出随着甜菊醇糖苷浓度的提高，这些风味特征变得更突出（Prakash I.，DuBois G.E.,Clos J.F.,ffilkens K.L.,Fosdick L·E·(2008(Development of rebiana,a natural,non-caloric sweetener(甜菊糖(rebiana)的研发，一种天然、无热量甜味剂） ?Food Chem.Toxicol·，46，S75_S82.)。
[0010]另一方面，替代制剂中大量的糖带来了如降低的口感、不完整的风味特征等这样 的问题。因此，高强度低热量甜味剂的应用必须提供方法来解决这些问题。
[0011]因此，如果单个组合物不仅能够递送甜味，而且还具有风味增强特性并矫正从食 品和饮料制剂中消除蔗糖相关的不完整口感，毫无疑问与本领域已知的其他高强度甜味剂 相比将是有利的。
[0012] 当新的碳水化合物残基在C13和C19位置连接初始分子时，通过使甜菊醇糖苷接受 分子间转糖基作用来降低或消除这些不合需要的特性中的一些。根据这些位置中的碳水化 合物残基的数量，化合物味道的品质和效力将改变。
[0013] 支链淀粉酶、异麦芽糖酶(Lobov S.V.，Jasai R.，0htani K.，Tanaka O.Yamasaki K· (199 1 )Enzymatic production of sweet stevioside derivatives : transglycosylation by glucosidases(甜味甜菊苷衍生物的酶生产:通过葡糖苷酶的转 糖基作用）.Agric.Biol ·Chem. 55:2959-2965)、β-半乳糖昔酶(Kitahata S.，Ishikawa S.， Mi yata T. , Tanaka 0·( 1989(Production of rubusos ide derivatives by transglycosylation of variousP-galactos idase(通过各种β-半乳糖苷酶的转糖基作 用生产甜茶苷衍生物）.Agric. Biol. Chem. 53:2923-2928)和葡聚糖蔗糖酶(Yamamoto Κ.， Yoshikawa K.,0kada S.(1994)Effective production of glucosyl-stevioside bya-1, 6-transglucosylation of dextran dextranase(通过葡聚糖葡聚糖酶的a-1,6-转糖基作 用有效生产葡糖基-甜菊苷）.Biosci .Biotech.Biochem. 58:1657-1661)已经用作转糖基 酶，而支链淀粉、麦芽糖、乳糖和部分水解的淀粉分别作为糖苷残基的供体。
[0014] 也可以通过嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophilus)(美国专利N0.4， 219,571和7,807,206)产生的环糊精葡聚糖转移酶(CGT酶）的作用来进行甜菊醇糖苷的转 糖基，作为结果，形成具有高达10的聚合度的α-1，4-葡糖基衍生物。
[0015] 已经显示出葡糖基衍生物的味道特征和甜味效力很大程度上取决于其他的葡糖 基衍生物的数量，即，α-1，4_葡糖基链的聚合度。a-ι，4_葡糖基残基数量的增加提高了味道 品质，但同时降低了甜味水平〇 &1^1?1，1987)。用0-转葡糖基的甜菊苷获得由单-或二-〇-1， 4_葡糖基衍生物组成的产物(Tanaka，1987)。
[0016] 然而，在这样的方法中，所得到的产物含有高水平的初始未反应的（未修饰的）糖 苷(通常>20% )，这使其不满足低于15%未反应糖苷的法规要求(α-Glucosyltransferase Treated Stevia(a-葡糖基转移酶处理的甜菊），Japan's Specifications and Standards for Food Additives(日本食品添加剂说明和标准），第VIII版，2009，p. 257)。因此，使用另 外的用于未反应甜菊醇糖苷的色谱分离步骤来降低初始的未反应(未修饰)糖苷的含量。然 而，色谱分离技术通常涉及高成本并且不适于大规模生产。
[0017] 还注意到许多葡糖基甜菊产物含有多达20%的残留糊精，其不具有实质性的功能 特性并且降低了产物中甜菊醇糖苷的含量。
[0018] 因此，需要研发具有最佳α-l，4-葡糖基链长和低的未反应糖苷水平的高纯度产 物，其将递送甜味效力和风味特征的最佳组合。
[0019] 发明概述
[0020] 本发明目的在于克服现有的甜菊甜味剂的缺点。本发明描述了用于从甜菊植物的 提取物生产高纯度食品成分的方法，及其在各种食品和饮料中作为甜味和风味改良剂的用 途。
[0021 ]本发明部分涉及包含甜菊植物的甜菊醇糖苷的葡糖基衍生物的成分。甜菊醇糖苷 选自甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪 苷X、杜克苷A、甜菊双糖苷、甜茶苷，以及甜菊植物中发现的其他甜菊醇糖苷，及其混合物。 [0022]本发明部分涉及用于生产含有甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪 苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷X、杜克苷A、甜菊双糖苷、甜茶苷，以及甜菊植物中发 现的其他甜菊醇糖苷的葡糖基化形式的成分的方法。该方法可以是使用通过嗜热脂肪芽孢 杆菌培养物产生的CGT酶的酶转糖基方法。该方法可以包括通过β-淀粉酶或其他酶的另外 的酶处理的步骤。该方法还可以具有脱色、脱盐和去除低聚麦芽糖的步骤。可以使用活性炭 进行脱色。可以通过离子交换树脂和/或膜滤器来进行脱盐。可以通过大孔聚合树脂来进行 低聚麦芽糖的去除。
[0023] 在本发明中，将PureCirCle(JiangXi)C〇·，Ltd.(中国）商业化的含有甜菊苷(28-30%)、莱鲍迪苷A(50-55%)、莱鲍迪苷C(9-12%)、莱鲍迪苷F(l-3%)和总计至少95%总甜 菊醇糖苷含量的其他糖苷的甜菊提取物用作起始材料。或者，具有不同比例的甜菊醇糖苷 以及高度纯化的甜菊醇糖苷(如莱鲍迪苷A、甜菊苷、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷X、甜茶苷等）的甜 菊提取物可以用作起始材料。
[0024]在存在作为葡萄糖供体的淀粉的情况下，使起始材料接受通过环糊精糖基转移酶 (CGT酶）的作用的酶转糖基作用。作为结果，形成了 α-1，4_葡糖基衍生物，在一些实施方案 中，具有高达20的聚合度。任选地使形成的衍生物接受用β-淀粉酶或其他酶的处理，以产生 具有特定聚合度的α-l，4-葡糖基衍生物。
[0025] 通过Amberlite XAD7HP树脂，从所获得的反应混合物中除去低聚糖，并且随后脱 色、去离子、浓缩和喷雾干燥。
[0026] 将所获得的产物作为甜味剂、甜味增强剂、风味剂和风味改良剂应用于各种食品 和饮料，包括软饮、冰淇林、饼干、面包、果汁、奶制品、烘焙食品和糖食产品中。
[0027] 应当明白之前的概述和之后的详述是示例性和解释性的，并且打算用来提供所要 求的本发明的进一步解释。
[0028] 附图简述
[0029]包括附图来提供本发明进一步的理解。【附图说明】了本发明的实施方案并且与说明 书一起用来解释本发明的实施方案的原理。
[0030] 图1显示了纯化的转葡糖基化甜菊提取物的高性能液相色谱色谱图，没有β-淀粉 酶处理，含有长链α-l，4-葡糖基-衍生物，具有多达九个α-l，4-葡糖基残基；
[0031] 图2显示了 β-淀粉酶处理后纯化的转葡糖基化甜菊提取物的高性能液相色谱色谱 图，具有甜菊苷和莱鲍迪苷Α的短链(含有四个或更少的α-l，4_葡糖基残基)衍生物；
[0032]图3显示了含有甜菊醇糖苷的单-和二-α-l，4_葡糖基-衍生物以及高水平的未反 应的甜菊醇糖苷的淀粉酶处理产物的高性能液相色谱(HPLC)色谱图；
[0033]图4显示了含有甜菊醇糖苷的单-和二-α-l，4_葡糖基-衍生物以及低水平的未反 应的甜菊醇糖苷的淀粉酶处理产物的高性能液相色谱(HPLC)色谱图。
[0034] 发明详述
[0035] 从下文中给出的详述，本发明的优势将变得更清楚。然而，应当理解详述和特定的 实施例尽管表示本发明的优选实施方案，但只是通过说明的方式给出，因为本领域技术人 员从这个详述将清楚本发明的精神和范围内的各种改变和变化。
[0036] 将PureCircle(JiangXi)Co.，Ltd.(中国）商业化的含有甜菊苷(28-30%)、莱鲍迪 苷A(50-55% )、莱鲍迪苷C(9-12% )、莱鲍迪苷F(l-3% )和总计至少95%总甜菊醇糖苷含量 的其他糖苷(下文总称为"甜菊醇糖苷"）的甜菊提取物用作起始材料。或者，具有不同比例 的甜菊醇糖苷以及高度纯化的甜菊醇糖苷（如莱鲍迪苷A、甜菊苷、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷X、 甜茶苷等)的甜菊提取物可以用作起始材料。
[0037]在某些实施方案中，甜菊醇糖苷可以被选自罗汉果提取物、Sira itia grosvenorii提取物、罗汉果苷(mogroside)、罗汉果苷IIE、罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉 果苷V、罗汉果苷￥1、11-氧-罗汉果苷￥、赛门苷（81&111611〇81(16)1、光果木鳖阜苷 (grosmomoside)I，以及Siraitia grosvenorii植物中发现的其他萌芦素(mogrol)或氧-萌 芦素糖苷及其混合物的化合物部分或完全替代。
[0038] 在配备有Zorbax_NH2(4 · 6 X 250mm)柱的Agilent Technologiesl200系列（USA)液 相色谱仪上进行原料和产物的HPLC分析。移动相是从80:20，v/v(0-2min)至50:50，v/v(2-70min)的乙腈-水梯度。将设定在210nm的二极管阵列检测仪用作检测仪。
[0039] 通过嗜热脂肪芽抱杆菌（Bacillus stearothermophilus)St_88(PureCircle Sdn Bhd Collection of Industrial Microorganisms-马来西亚)产生的环麦芽糖糊精葡聚糖 转移酶(CGT酶;EC 2.4.1.19)来完成转葡糖基化。然而，任何其他CGT或具有分子间转葡糖 基化活性的酶也可以使用。酶可以是无细胞培养液、浓缩液体无细胞培养液、喷雾干燥或冷 冻干燥的无细胞培养液或高纯度蛋白的形式。可以使用游离或固定的酶制剂。
[0040] 根据Hale W.S.，Rawlins L.C. (1951)Amylase of Bacillus macerans(浸麻芽抱 杆菌的淀粉酶）.Cerea 1 Chem. 28，49-58中所述的程序测定CGI1酶制剂的活性。
[0041] 不同来源的淀粉可以用作葡糖基单体的供体，如，源自小麦、玉米、马铃薯、木薯和 西米的淀粉。
[0042] 在转葡糖基化反应之前，使淀粉接受部分水解(液化）。部分水解淀粉的葡萄糖当 量可以在约10-25，优选约12-16范围中。任何能够淀粉水解的酶可以用于液化，如α-淀粉 酶、淀粉酶等。在一个实施方案中，优选CGI 1酶和α-淀粉酶混合物作为液化酶。
[0043]以千诺(KiΙο Νονο)α-淀粉酶单位(KNU)来表示α-淀粉酶活性。一KNU是在标准条 件下(pH7.1; 37°C)每小时糊化5.26g淀粉干物质的α-淀粉酶的量。
[0044] 液化混合物含有每一个单位的CGT酶约0.001-0.2KNU，优选约0.05-0.1KNU的α-淀 粉酶。
[0045] 液化中使用α-淀粉酶可以在进一步的活性炭过滤中获得较高通量。当将CGT酶用 作唯一液化酶时，过滤速率大约为l〇_15L/hr/lm 2过滤面积。在液化酶混合物(包含α-淀粉 酶和CGI1酶）的情况下，过滤速率快两倍-大约20-30L/hr/lm 2过滤面积。
[0046] 液化混合物中的淀粉与CGT酶的比例为每一克淀粉约0.1-0.5单位，优选每克约 0.2-0.4 单位。
[0047] 液化混合物中的淀粉浓度为约15-40% (wt/wt)，优选约20-30%。
[0048] 在约0.5-5小时，例如，约0.5至2小时，和优选约1-2小时过程中，在约70-90°C，或 75-80°C下进行液化。
[0049]液化后，使反应混合物接受低pH条件下的α-淀粉酶的热灭活。用于灭活的优选pH 范围为约PH2.5至pH3.0,并且优选温度为约95-105°C。热灭活的持续时间为约5-10分钟。 [0050] 灭活后，将反应混合物的pH调节至约pH5.5-6.5,并且将甜菊醇糖苷加入混合物中 并溶解。优选的甜菊醇糖苷与淀粉的比例(每lkg淀粉的甜菊醇糖苷的kg)为约0.5-1.5,优 选约 0.8-1.2。
[00511添加第二部分的CGT酶制备物并且在约5-125Γ，如65°C的温度下进行转糖基反应 约1至168小时，如24-48小时。第二部分的CGT酶的量为每克固体约0.2-4单位的CGT酶，优选 每克固体约0. 5-1.2单位。
[0052]添加第二部分的CGT酶制备物后，另外的步骤可以包括任选地灭活反应混合物中 的酶;任选将反应混合物脱色;和任选地将反应混合物浓缩并干燥，以获得葡糖基甜菊组合 物。在某些实施方案中，这个阶段的葡糖基甜菊组合物包含具有二十或更少α-I，4_葡糖基 残基的甜菊醇糖苷。
[0053]转葡糖基化反应完成后，可以使用进一步的一个或多个酶处理和额外的步骤，以 获得组合物中所需的聚合度和未反应的糖苷。
[0054]进一步的酶处理可以包括添加淀粉酶、β_淀粉酶、麦芽糖酶、葡糖淀粉酶、呋喃果 糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖酶、转葡糖苷酶、葡糖基转移酶、果糖基转移酶、半 乳糖基转移酶、乳糖酶、半乳糖苷酶、纤维素酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、 Maltogenase?、Fungamyi?、Novamyl?、Optimalt?,或其混合物，连同用 于所用的各自一种或多种酶的一种或多种底物一起。反应混合物可以在范围为5-125Γ的 温度下，孵育范围为〇. 〇〇〇 1至168小时的时间段。
[0055] 附加步骤可以包括通过热处理灭活反应混合物中的酶；任选地将反应混合物脱 色;任选地通过将脱色的反应混合物与大孔吸附树脂接触来除去非-二萜化合物并随后用 醇或含水醇洗脱吸附的二萜糖苷，以获得含糖苷洗脱液;任选地用离子交换树脂将含糖苷 洗脱液脱盐;任选地从洗脱液中除去醇，获得含水洗脱液;任选地将含水洗脱液浓缩并干 燥，以获得干燥的葡糖基甜菊组合物，和任选地将干燥的葡糖基甜菊组合物悬浮于含水醇 中，从悬浮液中分离晶体并干燥，以获得所需的葡糖基甜菊组合物。
[0056] 根据多种因素，这些步骤的任何顺序可以改变。
[0057]在某些实施方案中，完成转糖基反应时，加入每克固体约30-50单位的β-淀粉酶， 并且将反应在约35-55°C，优选约45°C下持续约12-16小时。在这个阶段中，针对样品la和 2a，使用大豆β-淀粉酶，同时将根据实施例2制得的β-淀粉酶用于样品lb和2b。然而，也可以 使用源自包括大麦、细菌、真菌淀粉酶等的任何其他来源的淀粉酶。
[0058] β_淀粉酶活性单位（1AUN)被定义为在以下条件下每分钟释放lOOyg还原糖(通过 右旋糖当量来表示）的活性:将lmL酶溶液与5mLl. 2 %淀粉溶液(pH5.5，M/20醋酸盐缓冲液） 混合并在40 °C下保持20分钟。
[0059] 通过在约95°C下加热约15分钟来灭活酶，以停止反应，并且用活性炭处理溶液，以 获得脱色的反应混合物。活性炭的量为约0.02-0.4克/克固体，优选约0.05-0.2克/克固体。 可以使用其他合适的脱色方法，如使用离子交换树脂，膜滤、使用超滤、纳滤或反向渗透膜， 或本领域已知的其他方法。
[0060]可以任选地除去非二萜化合物，例如，多个按序连接的填充大孔吸附树脂的柱，接 着用水洗涤柱，然后用约10-50% (v/v)乙醇洗涤，分离柱，并且随后用30-100%乙醇单独洗 脱每个柱。
[0061 ] 通过离子交换树脂，如Amberlte FPC23(H+型)和Amberlite FPA51(0H-型），将脱色 的反应混合物脱盐。
[0062]通过真空蒸发器将脱盐的反应混合物进一步浓缩，并通过喷雾干燥器干燥。可以 使用其他合适的浓缩和干燥方法，如膜滤、冷冻干燥或本领域已知的其他方法。
[0063]将干燥的粉末悬浮液含水醇中。粉末与含水醇的比例(wt/vol)为1:1至1: 20,优选 1:3至1:10。含水醇含有0-50%(￥〇1)，优选1-10%水。将悬浮液在30-100°(：，优选50-85°(：下 搅拌1-24小时，优选2-15小时。然后通过过滤分离悬浮的固体。可以使用本领域已知的适用 于从液体分离悬浮固体的任何其他技术，如离心、滗析等。也可以使用本领域已知的任何其 他干燥器。或者，可以将分离的固体溶解于水中，从微量醇中蒸发并喷雾干燥。
[0064] 本发明中使用的醇可以选自烷醇，并且优选选自甲醇、乙醇、η-丙醇、2-丙醇、1-丁 醇和2-丁醇，或其混合物。
[0065] 在某些实施方案中，所得到的产物含有低水平的未修饰糖苷、短链(含有四个或更 少，或两个或更少的α-1，4_葡糖基残基)衍生物和低聚麦芽糖的混合物(样品la和lb)。如本 文中使用的，表述"低水平的未修饰糖苷"或"低水平的未反应糖苷"应当是指低于约20%， 并且优选低于约15%的糖苷水平，基于干基。在一些实施方案中，使用这种方法可以获得约 12%、约10%或甚至更低的未反应糖苷。
[0066] 为了制备具有较高含量的总甜味糖苷(葡糖基化和非葡糖基化糖苷的总和），在脱 盐处理之前，使用Amberlite XAD7HP除去低聚麦芽糖。甜菊醇糖苷及其葡糖基化衍生物吸 附在树脂上，并且随后通过含水醇洗脱。按照以上所述的，随后将所得到的含有葡糖基甜菊 醇糖苷的含水乙醇洗脱液脱色和脱盐，并且在蒸发洗脱溶剂后，通过喷雾干燥将糖苷溶液 粉末化。按照以上所述的，将干燥的粉末悬浮于含水醇中并处理，以除去未修饰的（未反应 的)甜菊醇糖苷(样品2b)。所得到的产物含有低水平的未修饰的糖苷和短链(含有四个或更 少，或两个或更少的α-l，4-葡糖基残基)衍生物(样品2a和2b)。
[0067]通过样品la、lb、2a和2b举例说明的本发明的实施方案不含或基本上不含具有超 过4个或超过2个葡糖基残基的较高葡糖基衍生物。根据本发明，高度纯化的葡糖基甜菊组 合物优选包含大于约25 %重量二-、三-和四葡糖基莱鲍迪苷A，和高于约9 %重量三-盒四葡 糖基甜菊苷。在另一个实施方案中，高度纯化的葡糖基甜菊组合物包含高于约50%重量单-和二葡糖基甜菊醇糖苷。
[0068]使用样品2a的相似方法，除了 β-淀粉酶处理阶段，制备含有未修饰的糖苷和长链 α-1，4_葡糖基-衍生物(具有多达九个α-1，4_葡糖基残基)的产物(样品3)。
[0069]作为对照，使用商业β_淀粉酶处理的含有未修饰的糖苷和短链(含有两个或更少 的α-l，4-葡糖基残基)衍生物的产物(样品4)。
[0070] 样品的组成概括于表la和lb中，其中使用上述方法制得的样品la和2a含有四个或 更少的α-l，4_匍糖基残基，而使用上述方法制得的样品lb和2b含有两个或更少的α-l，4_匍 糖基残基。
[0071] 表la
[0072] 含有4个或更少的α-l，4_葡糖基残基的葡糖基甜菊醇糖苷样品的组成
[0073]
[0074] 使用水溶液，20名小组成员，进行了样品的感官评价。基于全体肯定，选择了最理 想和最不合需要的样品。结果显示于表2a中。
[0075] 表2a
[0076] 水系统中的样品的感官评价
[0078]从表2a的结果清楚，样品la和2a的甜味品质评价为最优的。整体上，与具有长链葡 糖基衍生物(样品3)和两个或更少α-1，4_葡糖基残基短链衍生物(样品4)的样品相比，具有 短链(含有四个或更少α-1，4_葡糖基残基)衍生物的样品（样品la和样品2a)具有更好的味 道特征。
[0079]样品la和2a显示出与对照样品4(150倍）相当的甜味力（与5%蔗糖溶液相比，甜 150-160倍）；然而，它们的风味特征明显优于对照样品。
[0080] 对含有两个或更少α-1，4-葡糖基残基的样品lb和2b进行了相似分析。根据实施例 12制备了样品5。
[0081] 表lb
[0082] 含有2个或更少α-l，4_葡糖基残基的葡糖基甜菊醇糖苷样品的组成
[0083]
[0084] 使用水溶液，20名小组成员，进行了样品的感官评价。基于全体肯定，选择了最理 想和最不合需要的样品。结果显示于表2b中。
[0085] 表2b
[0086] 水系统中的样品的感官评价
[0088] 从表2b的结果清楚，样品lb和2b的甜味品质评价为最优的。整体上，与具有长链葡 糖基衍生物(样品3)以及短链(含有两个或更少α-1，4_葡糖基残基)衍生物和高水平的未反 应糖苷的样品（样品5)相比，具有短链(含有两个或更少α-1，4_葡糖基残基)衍生物和低水 平的未反应糖苷的样品(样品lb和样品2b)具有更好的味道特征。
[0089] 样品lb和2b显示出与对照样品5(160倍)相当的甜味力（与5%蔗糖溶液相比，甜 150-160倍）；然而，它们的风味特征明显优于对照样品5。
[0090] 组合物可以用作各种食品和饮料产品中的甜味增强剂、风味剂、风味增强剂和甜 味剂。食品和饮料产品的非限制性实例包括碳酸软饮料、即饮饮料、能量饮料、等渗饮料、低 热量饮料、无热量饮料、运动饮料、茶、果汁和蔬菜汁、汁液饮料、乳饮料、酸奶饮料、醇饮料、 粉末饮料、烘焙制品、曲奇、饼干、烘焙混合物、谷物、糖食、糖果、太妃糖、口香糖、乳制品、调 味奶、酸奶、调味酸奶、发酵奶、酱油和其他基于大豆的制品、沙拉酱、蛋黄酱、醋、冷冻甜点、 肉制品、鱼-肉制品、瓶装和罐装食品、桌面甜味剂、水果和蔬菜。
[0091] 另外，组合物可以用于药物或药物制剂和化妆品中，包括但不限于牙膏、漱口水、 咳嗽糖浆、咀嚼片、锭剂、维生素制剂等。
[0092] 组合物可以"按原样(as-is)"使用或与其他甜味剂、风味剂和食品成分相结合。
[0093] 甜味剂的非限制性实例包括甜菊醇糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪 苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷X、杜克苷A、甜菊双糖苷、甜茶苷、以及甜 菊植物中发现的其他甜菊醇糖苷、及其混合物、甜菊提取物、罗汉果提取物、罗汉果苷、高果 糖玉米糖浆、玉米糖浆、转化糖、低聚果糖、菊粉、低聚菊粉、偶联糖、低聚麦芽糖、麦芽糖糊 精、玉米糖浆固体、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、阿斯巴甜、糖精、三氯蔗糖、糖醇，及其 组合。
[0094]风味剂的非限制性实例包括柠檬、橙子、果味、香蕉、葡萄、梨子、菠萝、苦杏仁、可 乐、肉桂、糖、棉花糖、香草风味剂。
[0095] 其他食品成分的非限制性实例包括风味剂、酸味剂、有机酸和氨基酸、着色剂、填 充剂、改性淀粉、树胶、组织形成剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂，及 其组合。
[0096] 以下实施例说明了本发明的各种实施方案。应当明白本发明不限于实施例中列出 的材料、比例、条件和程序，其只是说明性的。
[0097] 实施例1
[0098] CGI1酶的制备
[0099]将嗜热脂肪芽孢杆菌St-88的菌株接种于2,000升含有1.0%淀粉、0.25%玉米提 取物、0.5%(NH4)2S〇4和0.2%CaC03(pH 7.0-7.5)的灭菌培养基中，在56°(：下使用持续通风 (2，000L/分钟）和搅拌（150rpm)培养24小时。使用Kerasep 0 · Ιμπι陶瓷膜(Novasep，法国）过 滤所获得的培养液，以分离细胞。将无细胞的透过液在Per sep 1 OkDa超滤器(Ore 1 i s，法国） 上进一步浓度2倍。根据Hale，RawlinS(1951)测定了酶活性。获得了具有约2单位/mL活性的 粗制酶制剂。
[0100] 实施例2
[0101] β-淀粉酶的制备
[0102] 将多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)St-3504的菌株接种于2,000升含有1.0% 淀粉、0.5%蛋白胨、0.5%玉米提取物、0.5%恥(：1、0.02%]\111304和0.1%〇&〇)3(口117.0-7.5) 的灭菌培养基中，在32°C下使用持续通风(2,000L/分钟)和搅拌（150rpm)培养24小时。使用 Kerasep 0. Ιμπι陶瓷膜(Novasep，法国）过滤所获得的培养液，以分离细胞。将10%的葡萄糖 加入无细胞透过液中，将其在Persep 10kDa超滤器(0^1丨8，法国）上进一步浓度，并使用<1 1-4LSC冷冻干燥装置(Christ，德国）干燥，以获得具有20,000AUN/g活性的粉末。β-淀粉酶 活性单位（1AUN)被定义为在以下条件下每分钟释放100yg还原糖(通过右旋糖当量来表示） 的活性:将lmL酶溶液与5mL的1.2 %淀粉溶液(pH 5.5，M/20醋酸盐缓冲液)混合，并在40°C 下保持20min。
[0103] 实施例3
[0104] 短链葡糖基甜菊组合物的制备
[0105] 将100g木薯淀粉悬浮于300mL水（PH6.5)中。加入2KNU的α-淀粉酶（Termamyl Classic，Novozymes，丹麦)和30单位根据实施例1获得的CGT酶，并且在80°C下进行淀粉液 化约一小时，至约15的右旋糖当量。通过盐酸将反应混合物的pH调节至pH 2.8,并且在5分 钟的过程中将混合物在100°C下煮沸，使酶灭活。冷却至65°C后，用氢氧化钠溶液将pH调节 至ρΗ6·0。将通过PureCircle(JiangXi)Co.，Ltd.(中国）产生的含有甜菊苷29.2%，莱鲍迪 苷A 54.3%、莱鲍迪苷C 9.0%、莱鲍迪苷F(l.7%)和总计约96.4%总甜菊醇糖苷含量的其 他糖苷的l〇〇g甜菊提取物加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGI 1酶 加入溶液中，并将混合物在65°C的温度下在持续搅拌下保持24小时。然后将温度降至45°C， 并将8,〇〇〇单位大豆0-淀粉酶(#15〇〇5，似8386〇1611^61&3印.，日本)加入反应混合物中。 将反应再继续12小时。将获得的反应混合物在95 °C下加热15分钟，使酶灭活。加入20克活性 炭，并将混合物加热至75°C，并保持30分钟。将混合物过滤并用水将滤液稀释至5%固体含 量，并通过填充了Amber 1 ite FPC23(H+)和Amber 1 ite FPA51 (0H-)离子交换树脂的柱。将脱 盐的溶液在60°C下真空浓缩，并使用实验室喷雾干燥器干燥成粉末形式。获得了 196克产物 (样品la)。
[0106] 实施例4
[0107] 高度纯化的短链葡糖基甜菊组合物的制备
[0108] 将100g木薯淀粉悬浮于300mL水（PH6.5)中。加入2KNU的α-淀粉酶（Termamyl Classic，Novozymes，丹麦)和30单位根据实施例1获得的CGT酶，并且在80 °C下进行淀粉液 化约一小时，至约15的右旋糖当量。通过盐酸将反应混合物的pH调节至pH 2.8,并且在5分 钟的过程中将混合物在100°C下煮沸，使酶灭活。冷却至65°C后，用氢氧化钠溶液将pH调节 至ρΗ6·0。将通过PureCircle(JiangXi)Co.，Ltd.(中国）产生的含有甜菊苷29.2%，莱鲍迪 苷A 54.3%、莱鲍迪苷C 9.0%、莱鲍迪苷F(l.7%)和总计约96.4%总甜菊醇糖苷含量的其 他糖苷的l〇〇g甜菊提取物加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGI 1酶 加入溶液中，并将混合物在65°C的温度下在持续搅拌下保持24小时。然后将温度降至45°C， 并将8,〇〇〇单位大豆0-淀粉酶(#15〇〇5，似8386〇1611^61&3印.，日本)加入反应混合物中。 将反应再继续12小时。将获得的反应混合物在95 °C下加热15分钟，使酶灭活。加入20克活性 炭，并将混合物加热至75°C，并保持30分钟。将混合物过滤并用水将滤液稀释至5%固体含 量，并通过各自填充了4000mL Amberlite XAD 7HP大孔吸附树脂的柱。用5体积的水和2体 积的20% (v/v)乙醇洗涤柱。用50%乙醇洗脱吸附的糖苷。将获得的洗脱液通过填充了 Amberlte FPC23(H+)和Amberlite FPA51(0!T)离子交换树脂的柱。蒸发乙醇，并将脱盐和脱 色的水溶液在60°C下真空浓缩，然后使用实验室喷雾干燥器干燥成粉末形式。获得了 151克 产物(样品2a)。
[0109] 实施例5
[0110]高度纯化的长链葡糖基甜菊组合物的制备
[0111] 将100g木薯淀粉悬浮于300mL水（PH6.5)中。加入2KNU的α-淀粉酶（Termamyl Classic，Novozymes，丹麦)和30单位根据实施例1获得的CGT酶，并且在80°C下进行淀粉液 化约一小时，至约15的右旋糖当量。通过盐酸将反应混合物的pH调节至pH 2.8,并且在5分 钟的过程中将混合物在100°C下煮沸，使酶灭活。冷却至65°C后，用氢氧化钠溶液将pH调节 至ρΗ6·0。将通过PureCircle(JiangXi)Co.，Ltd.(中国）产生的含有甜菊苷29.2%，莱鲍迪 苷A 54.3%、莱鲍迪苷C 9.0%、莱鲍迪苷F(l.7%)和总计约96.4%总甜菊醇糖苷含量的其 他糖苷的l〇〇g甜菊提取物加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGI 1酶 加入溶液中，并将混合物在65°C的温度下在持续搅拌下保持24小时。将获得的反应混合物 在95 °C下加热15分钟，使酶灭活。加入20克活性炭，并将混合物加热至75 °C，并保持30分钟。 将混合物过滤并用水将滤液稀释至5%固体含量，并通过各自填充了400〇11^411*6111七6 XAD 7HP大孔吸附树脂的柱。用5体积的水和2体积的20 % (v/v)乙醇洗涤柱。用50 %乙醇洗 脱吸附的糖苷。将获得的洗脱液通过填充了Amber 1 i te FPC23 (H+)和Amber 1 i te FPA51 (0H一） 离子交换树脂的柱。蒸发乙醇，并将脱盐和脱色的水溶液在60°C下真空浓缩，然后使用实验 室喷雾干燥器干燥成粉末形式。获得了 165克产物(样品3)。
[0112] 实施例6 [0113]低热量橙汁饮料
[0114] 将橙子浓缩物（35%)、柠檬酸(0.35%)、抗坏血酸(0.05%)、橙红色素(0.01%)、 橙子香精(〇. 20 % )、莱鲍迪苷A(0.003 % )和不同的葡糖基甜菊组合物(0.03 % )混合，在水 中完全溶解(直至100%)并巴氏杀菌。葡糖基甜菊组合物分别根据实施例3、4和5获得的样 品la、2a和3来表不；以及样品4是商业β-淀粉酶处理的广物（只含有甜菊醇糖苷的单-和二-α-Μ-葡糖基-衍生物）。
[0115] 样品的感官评价概括于表3中。数据表明通过使用高纯度短链葡糖基甜菊组合物 (含有四个或更少的α-1，4_葡糖基残基)衍生物(样品la和2a)可以获得最佳结果。特别地， 用样品la和2a制得的饮料呈现出圆润和完整的风味特征和口感。
[0116] 表3
[0117] 橙汁饮料样品的评价
[0118]
[0119] 相同的方法可以用于从其他水果制备汁液和汁液饮料，如苹果、柠檬、杏、樱桃、菠 萝、芒果等。
[0120] 实施例7
[0121] 低热量碳酸饮料
[0122] 制备了根据以下配方的碳酸饮料。
[0124] 由20名小组成员评价了感官特性。结果概括于表4中。
[0125] 表4
[0126] 低热量碳酸饮料样品的评价
[0127]
[0128] 以上结果表明使用样品la和2a制得的饮料具有最佳感官特征。
[0129] 实施例8 [0130] 减肥饼干
[0131] 将面粉(50.0%)、人造黄油（30.0%)、果糖（10.0%)、麦芽糖醇（8.0%)、全脂奶 (1.0%)、盐(0.2%)、发酵粉(0.15%)、香草(0.1%)和不同的葡糖基甜菊组合物(0.03%) 在面团混合机中充分捏合。将获得的面团模制并在200Γ烤箱中烘焙15分钟。葡糖基甜菊组 合物分别根据实施例3、4和5获得的样品la、2a和3来表示；以及样品4是商业β-淀粉酶处理 的产物（只含有甜菊醇糖苷的单-和二-α-l，4-葡糖基-衍生物）。
[0132] 通过20名小组成员评价了感官特性。在通过高纯度短链葡糖基甜菊组合物(含有 四个或更少的α-1，4_葡糖基残基)衍生物(样品la和2a)制得的样品中获得了最佳结果。小 组成员标注了使用样品la和2a制得的饼干中圆润和完整的风味特征和口感。
[0133] 实施例9
[0134] 酸奶
[0135] 将不同的葡糖基甜菊组合物(0.03%)和蔗糖(4%)溶解于低脂奶中。葡糖基甜菊 组合物分别根据实施例3、4和5获得的样品la、2a和3来表示；以及样品4是商业β-淀粉酶处 理的产物（只含有甜菊醇糖苷的单-和二-α_1，4-葡糖基-衍生物）。在82°C下巴氏杀菌20分 钟后，将奶冷却至37°C。加入发酵培养物(3% )，并且将混合物在37°C下孵育6小时，然后在5 °C下孵育12小时。
[0136] 通过20名小组成评价了感官特性。在通过高纯度短链葡糖基甜菊组合物(含有四 个或更少的α-1，4_葡糖基残基)衍生物(样品la和2a)制得的样品中获得了最佳结果。小组 成员标注了使用样品la和2a制得的样品中圆润和完整的风味特征和口感。
[0137] 实施例10
[0138] 短链葡糖基甜菊组合物的制备
[0139] 将100g木薯淀粉悬浮于300mL水（pH6.5)中。加入2KNU的α-淀粉酶（Termamyl Classic，Novozymes，丹麦)和30单位根据实施例1获得的CGT酶，并且在80°C下进行淀粉液 化约一小时，至约15的右旋糖当量。通过盐酸将反应混合物的pH调节至pH 2.8,并且在5分 钟的过程中将混合物在100°C下煮沸，使酶灭活。冷却至65°C后，用氢氧化钠溶液将pH调节 至ρΗ6·0。将通过PureCircle(JiangXi)Co.，Ltd.(中国）产生的含有甜菊苷29.2%，莱鲍迪 苷A 54.3%、莱鲍迪苷C 9.0%、莱鲍迪苷F(l.7%)和总计约96.4%总甜菊醇糖苷含量的其 他糖苷的l〇〇g甜菊提取物加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGI 1酶 加入溶液中，并将混合物在65°C的温度下在持续搅拌下保持24小时。然后将温度降至45°C， 并将8，000单位根据实施例2获得的β-淀粉酶加入反应混合物中。将反应再继续12小时。将 获得的反应混合物在95°C下加热15分钟，使酶灭活。加入20克活性炭，并将混合物加热至75 °C，并保持30分钟。将混合物过滤并用水将滤液稀释至5 %固体含量，并通过填充了 Amberlite FPC23(H+)和Amberlite FPA51(0H-)离子交换树脂的柱。将脱盐的溶液在60°C下 真空浓缩，并使用实验室喷雾干燥器干燥成粉末形式。将干燥的粉末悬浮于5体积的95 %含 水乙醇中。将悬浮液在12小时过程中在80°C下搅拌。然后通过过滤分离悬浮的固体。将获得 的固体在5小时过程中在90°C下真空干燥。获得了 170克产物(样品lb)。
[0140] 实施例11
[0141]高度纯化的短链葡糖基甜菊组合物的制备
[0142] 将100g木薯淀粉悬浮于300mL水（pH6.5)中。加入2KNU的α-淀粉酶（Termamyl Classic，Novozymes，丹麦)和30单位根据实施例1获得的CGT酶，并且在80 °C下进行淀粉液 化约一小时，至约15的右旋糖当量。通过盐酸将反应混合物的pH调节至pH 2.8,并且在5分 钟的过程中将混合物在100°C下煮沸，使酶灭活。冷却至65°C后，用氢氧化钠溶液将pH调节 至ρΗ6·0。将通过PureCircle(JiangXi)Co.，Ltd.(中国）产生的含有甜菊苷29.2%，莱鲍迪 苷A 54.3%、莱鲍迪苷C 9.0%、莱鲍迪苷F(l.7%)和总计约96.4%总甜菊醇糖苷含量的其 他糖苷的l〇〇g甜菊提取物加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGI 1酶 加入溶液中，并将混合物在65°C的温度下在持续搅拌下保持24小时。然后将温度降至45°C， 并将8，000单位根据实施例2获得的β-淀粉酶加入反应混合物中。将反应再继续12小时。将 获得的反应混合物在95°C下加热15分钟，使酶灭活。加入20克活性炭，并将混合物加热至75 °C，并保持30分钟。将混合物过滤并用水将滤液稀释至5%固体含量，并通过各自填充了 4000mL Amberlite XAD 7HP大孔吸附树脂的柱。用5体积的水和2体积的20%(v/v)乙醇洗 涤柱。用50 %乙醇洗脱吸附的糖苷。将获得的洗脱液通过填充了Amber 1 i te FPC23 (H+)和 Amberlite FPA51(0!〇离子交换树脂的柱。蒸发乙醇，并将脱盐和脱色的水溶液在60°C下 真空浓缩，然后使用实验室喷雾干燥器干燥成粉末形式。将干燥的粉末悬浮于5体积的95 % 含水乙醇中。将悬浮液在12小时过程中在80°C下搅拌。然后通过过滤分离悬浮的固体。将获 得的固体在5小时过程中在90°C下真空干燥。获得了 121克产物(样品2b)。
[0143] 实施例12
[0144] 高度纯化的短链葡糖基甜菊组合物的制备
[0145] 将100g木薯淀粉悬浮于300mL水（ρΗ6·5)中。加入2KNU的α-淀粉酶（Termamyl Classic，Novozymes，丹麦)和30单位根据实施例1获得的CGT酶，并且在80 °C下进行淀粉液 化约一小时，至约15的右旋糖当量。通过盐酸将反应混合物的pH调节至pH 2.8,并且在5分 钟的过程中将混合物在100°C下煮沸，使酶灭活。冷却至65°C后，用氢氧化钠溶液将pH调节 至ρΗ6·0。将通过PureCircle(JiangXi)Co.，Ltd.(中国）产生的含有甜菊苷29.2%，莱鲍迪 苷A 54.3%、莱鲍迪苷C 9.0%、莱鲍迪苷F(l.7%)和总计约96.4%总甜菊醇糖苷含量的其 他糖苷的l〇〇g甜菊提取物加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGI 1酶 加入溶液中，并将混合物在65°C的温度下在持续搅拌下保持24小时。然后将温度降至45°C， 并将8，000单位根据实施例2获得的β-淀粉酶加入反应混合物中。将反应再继续12小时。将 获得的反应混合物在95°C下加热15分钟，使酶灭活。加入20克活性炭，并将混合物加热至75 °C，并保持30分钟。将混合物过滤并用水将滤液稀释至5%固体含量，并通过各自填充了 4000mL Amberlite XAD 7HP大孔吸附树脂的柱。用5体积的水和2体积的20%(v/v)乙醇洗 涤柱。用50 %乙醇洗脱吸附的糖苷。将获得的洗脱液通过填充了Amber 1 i te FPC23 (H+)和 Amberlite FPA51(0!〇离子交换树脂的柱。蒸发乙醇，并将脱盐和脱色的水溶液在60°C下 真空浓缩，然后使用实验室喷雾干燥器干燥成粉末形式。获得了 154克产物(样品5)。
[0146] 实施例13
[0147] 长链葡糖基甜菊组合物的制备
[0148] 将100g木薯淀粉悬浮于300mL水（ρΗ6·5)中。加入2KNU的α-淀粉酶（Termamyl Classic，Novozymes，丹麦)和30单位根据实施例1获得的CGT酶，并且在80°C下进行淀粉液 化约一小时，至约15的右旋糖当量。通过盐酸将反应混合物的pH调节至pH 2.8,并且在5分 钟的过程中将混合物在100°C下煮沸，使酶灭活。冷却至65°C后，用氢氧化钠溶液将pH调节 至ρΗ6·0。将通过PureCircle(JiangXi)Co.，Ltd.(中国）产生的含有甜菊苷29.2%，莱鲍迪 苷A 54.3%、莱鲍迪苷C 9.0%、莱鲍迪苷F(l.7%)和总计约96.4%总甜菊醇糖苷含量的其 他糖苷的l〇〇g甜菊提取物加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGI 1酶 加入溶液中，并将混合物在65°C的温度下在持续搅拌下保持24小时。将获得的反应混合物 在95 °C下加热15分钟，使酶灭活。加入20克活性炭，并将混合物加热至75 °C，并保持30分钟。 将混合物过滤并将滤液在60 °C下真空浓缩，然后使用实验室喷雾干燥器干燥成粉末形式。 获得了 197克产物(样品6)。
[0149] 实施例14
[0150] 低热量橙汁饮料
[0151] 将橙子浓缩物（35%)、柠檬酸(0.35%)、抗坏血酸(0.05%)、橙红色素(0.01%)、 橙子香精(〇. 20 % )、莱鲍迪苷A(0.003 % )和不同的葡糖基甜菊组合物(0.03 % )混合，在水 中完全溶解(直至100%)并巴氏杀菌。葡糖基甜菊组合物分别根据实施例1〇、11、5、12和13 获得的样品lb、2b、3、5和6来表示。
[0152] 样品的感官评价概括于表5中。数据表明通过使用高纯度短链葡糖基甜菊组合物 (含有两个或更少的α-1，4_葡糖基残基和低的未反应甜菊醇糖苷）（样品lb和2b)可以获得 最佳结果。特别地，用样品lb和2b制得的饮料呈现出圆润和完整的风味特征和口感。
[0153] 表5
[0154] 橙汁饮料样品的评价
[0155]
[0156] 相同的方法可以用于从其他水果制备汁液和汁液饮料，如苹果、柠檬、杏、樱桃、菠 萝、芒果等。
[0157] 实施例15
[0158] 低热量碳酸饮料
[0159] 制备了根据以下配方的碳酸饮料。
[0161] 由20名小组成员评价了感官特性。结果概括于表6中。
[0162] 表6
[0163] 低热量碳酸饮料样品的评价
[0164]
[0165] 以上结果表明使用样品lb和2b制得的饮料具有最佳感官特征。
[0166] 实施例16
[0167] 减肥饼干
[0168] 将面粉(50.0%)、人造黄油（30.0%)、果糖（10.0%)、麦芽糖醇（8.0%)、全脂奶 (1.0%)、盐(0.2%)、发酵粉(0.15%)、香草(0.1%)和不同的葡糖基甜菊组合物(0.03%) 在面团混合机中充分捏合。将获得的面团模制并在200Γ烤箱中烘焙15分钟。葡糖基甜菊组 合物分别根据实施例10、11、5和12获得的样品lb、2b、3和5来表示。
[0169] 通过20名小组成员评价了感官特性。在通过高纯度短链葡糖基甜菊组合物(含有 两个或更少的α-1，4_葡糖基残基)衍生物(样品lb和2b)制得的样品中获得了最佳结果。小 组成员标注了使用样品lb和2b制得的饼干中圆润和完整的风味特征和口感。
[0170] 实施例17
[0171] 酸奶
[0172] 将不同的葡糖基甜菊组合物(0.03%)和蔗糖(4%)溶解于低脂奶中。葡糖基甜菊 组合物分别根据实施例1〇、11、5和12获得的样品lb、2b、3和5来表示。在82°C下巴氏杀菌20 分钟后，将奶冷却至37 °C。加入发酵培养物(3 % )，并且将混合物在37 °C下孵育6小时，然后 在5°C下孵育12小时。
[0173] 通过20名小组成评价了感官特性。在通过高纯度短链葡糖基甜菊组合物(含有两 个或更少的α-1，4_葡糖基残基)衍生物(样品lb和2b)制得的样品中获得了最佳结果。小组 成员标注了使用样品lb和2b制得的样品中圆润和完整的风味特征和口感。
[0174] 比较实施例1
[0175] 高度纯化的短链葡糖基甜菊组合物的制备
[0176] 将100g木薯淀粉悬浮于300mL水（pH6.5)中。加入2KNU的α-淀粉酶（Termamyl Classic，Novozymes，丹麦)和30单位根据上述程序获得的CGT酶，并且在80°C下进行淀粉液 化约一小时，至约15的右旋糖当量。
[0177] 冷却至65 °C后，用氢氧化钠溶液将pH调节至pH6.0。将通过PureCircle (JiangXi) Co.，Ltd.(中国）产生的含有甜菊苷29.2%，莱鲍迪苷A 54.3%、莱鲍迪苷C 9.0%、莱鲍迪 苷F(l. 7%)和总计约96.4%总甜菊醇糖苷含量的其他糖苷的100g甜菊提取物加入液化淀 粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGT酶加入溶液中，并将混合物在65°C的温 度下在持续搅拌下保持24小时。
[0178] 然后将温度降至45°C，并将8,000单位大豆β-淀粉酶（#1500S，Nagase Chemtex Corp.，日本)加入反应混合物中。将反应再继续12小时。将获得的反应混合物在95°C下加热 15分钟，使酶灭活。加入20克活性炭，并将混合物加热至75 °C，并保持30分钟。将混合物过滤 并用水将滤液稀释至5%固体含量，并通过填充了4!1^6^^6??023(!〇和411^64^6 FPA51(0H-)离子交换树脂的柱，然后通过各自填充了4000mL Amberlite XAD 7HP大孔吸附 树脂的柱。用5体积的水和2体积的20% (v/v)乙醇洗涤大孔树脂柱。用50%乙醇洗脱吸附的 糖苷。将获得的洗脱液的乙醇蒸发，并在60 °C下真空浓缩，然后使用实验室喷雾干燥器干燥 成粉末形式。获得了 114克产物(样品7)。
[0179]使用HPLC分析了样品7组成，并使用20名受过训练的小组成员，使用水溶液连同其 他样品(样品la、2a、3和4)进行了感官评价。
[0180] 葡糖基甜菊醇糖苷样品的组成
[0181]
[0182] 水系统中的样品的感官评价
[0183]
[0184] 比较实施例2
[0185] 高度纯化的短链葡糖基甜菊组合物的制备
[0186] 将100g木薯淀粉悬浮于300mL水（ρΗ6·5)中。加入2KNU的α-淀粉酶（Termamyl Classic，Novozymes，丹麦)和30单位根据上述程序获得的CGT酶，并且在80°C下进行淀粉液 化约一小时，至约15的右旋糖当量。冷却至65 °C后，用氢氧化钠溶液将pH调节至pH6.0。将通 过PureCircle(JiangXi )Co.，Ltd.(中国）产生的含有甜菊苷29.2%，莱鲍迪苷A 54.3%、莱 鲍迪苷C 9.0%、莱鲍迪苷F(1.7% )和总计约96.4%总甜菊醇糖苷含量的其他糖苷的100g 甜菊提取物加入液化淀粉中并搅拌直至获得均匀的溶液。将200单位的CGT酶加入溶液中， 并将混合物在65°C的温度下在持续搅拌下保持24小时。然后将温度降至45°C，并将8，000单 位根据上述程序获得的淀粉酶加入反应混合物中。将反应再继续12小时。将获得的反应 混合物在95°C下加热15分钟，使酶灭活。加入20克活性炭，并将混合物加热至75 °C，并保持 30分钟。将混合物过滤并用水将滤液稀释至5%固体含量，并通过填充了Amber 1 ite FPC23 (H+)和Amberlite FPA51 (OH-)离子交换树脂的柱，然后通过各自填充了4000mL Amberlite XAD 7HP大孔吸附树脂的柱。用5体积的水和2体积的20 % (v/v)乙醇洗涤大孔树脂柱。用 50 %乙醇洗脱吸附的糖苷。将获得的洗脱液的乙醇蒸发，并在60 °C下真空浓缩，然后使用实 验室喷雾干燥器干燥成粉末形式。将干燥的粉末悬浮于5体积的95%含水乙醇中。将悬浮液 在12小时过程中在80°C下搅拌。然后通过过滤分离悬浮的固体。将获得的固体在5小时过程 中在90°C下真空干燥。获得了 67克产物(样品8)。
[0187] 使用HPLC分析了样品8组成，并使用20名受过训练的小组成员，使用水溶液连同其 他样品(样品lb、2b、3和5)进行了感官评价。
[0188] 葡糖基甜菊醇糖苷样品的组成
[0189]
[0190]水系统中的样品的感官评价
[0191]
[0192] 应当明白之前的描述和本文中显示的特定实施方案仅仅是本发明最佳方式及其 原理的说明，并且本领域技术人员可以容易地进行改变和增加，而不脱离本发明的精神和 范围，因此应当明白本发明只受所附权利要求范围的限制。
【主权项】
1. 用于生产葡糖基甜菊组合物的方法，包括下列步骤： 将淀粉加入到水中以形成淀粉悬浮液； 将α-淀粉酶和CGT酶的混合物加入到淀粉悬浮液中并在约75-80°C下孵育约0.5至2小 时，生成液化淀粉悬浮液； 通过低pH热处理将α-淀粉酶灭活； 将甜菊醇糖苷加入到液化淀粉悬浮液中，生成反应混合物;和 将第二批CGT酶加入到反应混合物中并在约5-125°C下孵育约1至168小时。2. 根据权利要求1的方法，进一步包括下列步骤： 加入选自淀粉酶、淀粉酶、麦芽糖酶、葡糖淀粉酶、呋喃果糖苷酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖 酶、β-葡聚糖酶、转葡糖苷酶、葡糖基转移酶、果糖基转移酶、半乳糖基转移酶、乳糖酶、半乳糖 苷酶、纤维素酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、Ma ltogen.ase_?、Fungamy 1?、 Novamy 1?、Opt iffla11?:,或其混合物的一种或几种酶;和 将反应混合物在约5-125°C下孵育约0.0001-168小时； 其中葡糖基甜菊组合物包含具有二十个或更少的α-1，4-葡糖基残基的甜菊醇糖苷衍 生物。3. 根据权利要求2的方法，其中改变步骤的顺序。4. 根据权利要求1的方法，其中α-淀粉酶和CGT酶的混合物含有每一单位CGT酶约0. Οδ-Ο. IKNU 的 α-淀粉酶。5. 根据权利要求1的方法，其中添加的甜菊醇糖苷的重量约等于淀粉的重量。6. 根据权利要求1的方法，其中添加的甜菊醇糖苷选自甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、 莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷Ε、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷X、杜克苷Α、甜菊双糖苷、甜茶苷， 以及甜菊植物中发现的其他甜菊醇糖苷，及其混合物。7. 根据权利要求1的方法，其中添加的甜菊醇糖苷被选自罗汉果提取物、Siraitia grosvenorii提取物、罗汉果苷(mogroside)、罗汉果苷ΙΙΕ、罗汉果苷III、罗汉果苷IV、罗汉 果苷V、罗汉果苷￥1、11-氧-罗汉果苷￥、赛门苷（81&111611〇81(16)1、光果木鳖阜苷 (grosmomoside)I，以及Siraitia grosvenorii植物中发现的其他萌芦素(mogrol)或氧-萌 芦素糖苷及其混合物的化合物部分或完全替代。8. 根据权利要求1的方法，其中CGT酶通过嗜热脂肪芽孢杆菌（Baci Ilus stearothermophi Ius)的培养物来产生。9. 根据权利要求1的方法，其中第二批CGT酶具有每克固体约0.2-4单位的CGT酶。10. 根据权利要求1的方法，其中第二批CGT酶具有每克固体约0.5-1.2单位的CGT酶。11. 根据权利要求2的方法，其中从选自大豆、大麦、真菌和细菌的来源生产β-淀粉酶。12. 根据权利要求2的方法，其中以每克总固体约30-50单位来添加 β-淀粉酶，并且处理 在约40-60 °C的温度下进行，持续约3-16小时的时间段。13. 根据权利要求2的方法，其中酶处理后，甜菊醇糖苷的葡糖基化衍生物具有四个或 更少的α-葡糖基残基。14. 根据权利要求2的方法，其中酶处理后，甜菊醇糖苷的葡糖基化衍生物具有两个或 更少的α-葡糖基残基。15. 根据权利要求2的方法，其中酶处理后，甜菊醇糖苷的葡糖基化衍生物只具有一个 α_葡糖基残基。16. 根据权利要求2的方法，进一步包括将酶的底物加入到反应混合物中的步骤。17. 权利要求2的方法，进一步包括在孵育反应混合物后通过热处理灭活反应混合物中 的酶。18. 权利要求2的方法，进一步包括将反应混合物脱色的步骤。19. 权利要求2的方法，进一步包括通过将脱色的反应混合物与大孔吸附树脂接触来除 去非-二萜化合物并随后用醇或含水醇洗脱吸附的二萜糖苷，以获得含糖苷洗脱液的步骤。20. 权利要求19的方法，进一步包括用离子交换树脂将含糖苷洗脱液脱盐的步骤。21. 权利要求20的方法，进一步包括从洗脱液中除去醇，获得含水洗脱液的步骤。22. 权利要求21的方法，进一步包括将含水洗脱液浓缩并干燥以获得干燥的葡糖基甜 菊组合物的步骤。23. 权利要求22的方法，进一步包括将干燥的葡糖基甜菊组合物悬浮于含水醇中，从悬 浮液中分离晶体并将它们干燥以获得葡糖基甜菊组合物的步骤。24. 权利要求18的方法，其中使用活性炭进行脱色。25. 根据权利要求18的方法，其中使用离子交换树脂或膜进行脱色，所述膜选自超滤、 纳滤和反向渗透膜。26. 权利要求19的方法，其中用多个按序连接的填充有大孔吸附树脂的柱，接着用水洗 涤柱，然后用约10-50% (v/v)乙醇洗涤，分离柱，并且随后用30-100%乙醇单独洗脱每个柱 来进行除去非二萜化合物。27. 根据权利要求20的方法，其中将洗脱液通过填充有离子交换树脂的柱或膜来进行 脱盐，所述膜选自超滤、纳滤和反向渗透膜。28. 根据权利要求2的方法，其中葡糖基甜菊组合物具有至少约95 %总甜菊醇糖苷，基 于干基。29. 包含通过权利要求1的方法制得的葡糖基甜菊组合物和另外的甜味剂的组合物，所 述另外的甜味剂选自：甜菊提取物、甜菊醇糖苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷 C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷Ε、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷X、杜克苷Α、甜菊双糖苷、甜茶苷、甜菊植物 中发现的其他甜菊醇糖苷及其混合物、罗汉果提取物、罗汉果苷、高果糖玉米糖浆、玉米糖 浆、转化糖、低聚果糖、菊粉、低聚菊粉、偶联糖、低聚麦芽糖、麦芽糖糊精、玉米糖浆固体、葡 萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、阿斯巴甜、糖精、三氯蔗糖、糖醇，及其组合。30. 包含通过权利要求1的方法制得的葡糖基甜菊组合物和另外的芳香剂的风味组合 物，所述另外的芳香剂选自但不限于:柠檬、橙子、果味、香蕉、葡萄、梨子、菠萝、芒果、苦杏 仁、可乐、肉桂、糖、棉花糖、香草，及其组合。31. 包含通过权利要求1的方法制得的葡糖基甜菊组合物和另外的食品成分的食品成 分，所述另外的食品成分选自：酸味剂、有机酸和氨基酸、着色剂、填充剂、改性淀粉、树胶、 组织形成剂、防腐剂、抗氧化剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、胶凝剂，及其组合。32. 包含通过权利要求1的方法制得的葡糖基甜菊组合物的食品、饮料、化妆品或药品。33. 权利要求1的方法，进一步包括将反应混合物中的酶灭活的步骤。34. 权利要求1的方法，进一步包括将反应混合物脱色的步骤。
【文档编号】C12P19/14GK105899670SQ201480061594
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年9月26日
【发明人】A·马科斯雅恩
【申请人】谱赛科美国股份有限公司