一种利用嗜松青霉转化甜菊糖制备杜尔可苷a的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种制备杜尔可苷A(DA)的新方法，特别是用嗜松青霉发酵产生的菌 或酶转化RC为DA的方法。属于天然产物的生物转化领域。
【背景技术】
[0002] 甜菊糖苷是从甜菊叶中提取的高倍天然甜味剂，因其安全、低热等特点，被誉为 "最佳天然甜味剂"、"第三糖源"。中国是目前世界上最大的甜菊糖生产国和出口国。甜 菊糖苷不仅广泛应用于食品行业，在医药行业也倍受青睐。甜菊糖苷的生物活性广泛，主 要有降血压、调节血糖、抗菌抗炎等活性（朱焕铃，刘景彬，谢印芝.甜菊糖苷的性质 及在食品中的应用[J] ?食品研究与开发，2011，11:189-192 ;Sidd Purkayastha, George Pugh Jr. , Barry Lynch, Ashley Roberts, David Kwok d,Stanley M. Tarka Jr. In vitro metabolism of rebaudioside B，D，and Munder anaerobic conditions:Comparison with rebaudioside A[J]. Regulatory Toxicology and Pharmacology，2014, 68:259 - 268.) 〇
[0003] 甜菊糖苷的通用结构式为：
[0004]
[0005] 表1甜菊糖苷主要成分与结构
[0006]
[C
[0008] 表2甜菊叶中不同糖苷的含量、甜度比较
[0009]
[0010] 从甜叶菊中提取得到甜菊糖含多种成分：甜菊苷、莱鲍迪苷（Rebaudi〇side)A、B、 C、D、E、F、甜茶苷及杜尔可苷A(Dulc〇Side A，简称DA)。由表1中各甜菊糖苷的结构可 见，莱鲍迪苷C的C13位的0-1，2糖苷键选择性水解断裂可以产生杜尔可苷A。而从表 2(陈秋实.甜菊苷的研究概况[J].中国药师，2007, 10(6) :598-599 ;杨远志，庞明利， 杨海军.天然甜味剂甜菊糖中国市场应用处于导入期[N].中国食品报，2009-11-24)中 数据可见：甜叶菊中甜菊苷占总苷量的46-48%，莱鲍迪苷A占总苷量的20-30%，莱鲍迪 苷C占总苷量的4-7%。杜尔可苷A、甜茶苷，莱鲍迪苷B、D、E在甜叶菊中含量稀少，难以 直接从甜叶菊中获得大量的这些成分。这些稀有糖苷由于原料中含量少、提取成本高等方 面的限制，是量少而价高的产品。研究表明甜茶苷、甜菊双糖苷等是备受关注的有着潜在 药用价值的品种（陈育如，姜中玉，刘虎.一种由甜菊糖苷制备甜茶苷的方法[P]:中 国，ZL200910035921. 0. 2010-5-5 ;陈育如，刘虎，姜中玉等?一种生物转化甜菊糖中甜菊 苷为甜菊双糖苷的方法[P]:中国，CN201010170786. 3. 2010-10-13)。
[0011] 甜菊糖的苷元甜菊醇分子具有对映贝壳杉烯型四环二萜骨架结构，具有独特的 生理活性（Li J，Zhang D Y, ffu X M. Synthesis and biological evaluation of novel exomethylene cyclopentanone tetracyclic diterpenoids as antitumor agents[J]. Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 2011,21 (1) :130_132;汪吴林，石浩.异斯特 维醇衍生物的应用研究进展[J].浙江化工，2014, 10:7-11)。杜尔可苷A水解掉去除鼠李 糖基后，其产物是甜茶苷。甜茶苷具有降脂、降血糖、止咳、镇静、抗过敏、抗疲劳、增强免疫 力等功能（谢莹，陈全斌，罗达伟等.高纯度甜茶苷抗疲劳及免疫调节功能研究[J].时 珍国医国药，2010, 21 (6) : 1421-1422)。作为稀有甜菊糖苷类，因受原料供应的限制，目前 杜尔可苷 A 的研究极少（Masaru Kobayashi，Shuji Horikawa，Isolde H.Degrandi，Junko Ueno, Hiroshi Mitsuhashi. Dulcosides A and B, new diterpene glycosides from Stevia rebaudiana. Phytochemistry, 1977, 16(9):1045-1048) 〇
[0012] 本课题组在甜菊糖的分离纯化和生物转化方面进行了系列研究（陈育 如，玄燕，赵乙萱等.巴氏微杆菌XJ及应用该菌制备甜菊醇的方法[P]:中 国，ZL201110159563. 1.2011-10-19;陈育如，姜中玉，玄燕，张玉千，夏文静?黄杆菌 胞内酶提取和快速转化甜菊糖为甜茶苷的方法[P]:中国，ZL201010569609. 2. 2011-5-18 ; 陈育如，刘虎，姜中玉等.一种生物转化甜菊糖中甜菊苷为甜菊双糖苷的方法[P]:中 国，CN201010170786. 3. 2010-10-13;陈育如，姜中玉，刘虎?一种由甜菊糖苷制备甜茶 苷的方法[P]:中国，ZL200910035921. 0. 2010-5-5)，本发明是在前期工作基础上的深入研 究。
[0013] 嗜松青霉应用广泛，本发明用的典型菌株（CGMCC No. 63664)筛选方法见文 献（孙欢，纤维素热解产物及甜叶菊的微生物转化研究[D]，南京师范大学硕士论文， 2014)，嗜松青霉可用于转化内醚糖（陈育如，孙欢，赵乙萱，刘军利，卫民.一株嗜 松青霉及其应用[P]:中国，ZL201210467779. 9.2013-2-13.)，、产木聚糖酶（Hongying Cai,Pengjun Shi, Yingguo Bai, Huoqing Huang, Tiezheng Yuan, Pei long Yang, Huiying Luo,Kun Meng,Bin Yao. A novel thermoacidophi1ic family lOxylanase from Penici11ium pinophilum Cl [J].Process Biochemistry:2011, 46, 2341 - 2346.), 产 0 _ 甘露糖苷酉每(Hongying Cai, Pengjun Shi, Huiying Luo, Yingguo Bai, Huoqing Huang,Pei long Yang,Bin Yao.Acidic 0 -mannanase from Penicillium pinophilum Cl:Cloning, characterization and assessment of its potential for animal feed application[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering:2011, 112(6), 551 - 557.) 及产 0-1,4 葡萄糖苷酶（Ah-Reum Joo,Marimuthu Jeya，Kyoung_Mi Lee，Kyoung_Min Lee, Hee-Jung Moon, Yeong-Suk Kim, Jung-Kul Lee. Production and characterization of 0-1,4-glucosidase from a strain of Penicillium pinophilum[J]. Process Biochemistry:2010,45,851 - 858.)等。另外，嗜松青霉还可用于促进石植生长及营养吸 收(Ashis Maity, R. K. Pal, Ram Chandra, N. V. Singh. Penicillium pinophilum-A novel microorganism for nutrient management in pomegranate(Punica granatum L.)[J]. Scientia Horticulturae:2014, 169, 111 - 117);防治线虫，促进番前等易感线虫的植物生 长（谭可菲，段玉玺，陈立杰，王媛媛，陈增齐.根结线虫生防菌SneF8发酵代谢产物稳 定性研究[J].江苏农业科学，2009, 03:121-123.)、降解磷源促进马尾松的生长（乔欢，吴 小芹，王早.一株嗜松青霉JP-NJ4的解磷特性[J].微生物学通报，2014, 09:1741-1748)。 利用嗜松青霉也可产油和产黄酮类物质（叶思特，郭丽琼，刘晓蓉，陈晓阳，林俊芳.产 油微生物的筛选[J].华南农业大学学报，2012, 03:384-387;刘紫英.产黄酮成分的绶草 内生真菌的鉴定[J].菌物学报，2011，01:133-137)。因此，嗜松青霉是一种多功能的菌株。
[0014] 本课题组曾用高产葡萄糖苷酶的棘孢曲霉转化RC，结果表明其将RC不是转化 为DA而是成为甜菊醇（马迎迎，陈育如，张伟娜，孙欢等.棘孢曲霉转化甜菊糖为甜菊 醇及纯化莱鲍迪苷A[J].微生物学报，2014, 01:62-68.)。本发明发现，嗜松青霉对RC转化 DA有特异性，可实现DA的高转化量制备。
【发明内容】
[0015] 为了解决现有DA制备的不足，本发明旨在提供一种利用液体或固体培养得到的 嗜松青霉（Penicillium pinophilum)的菌液或酶液特异性转化莱鲍迪苷C生成杜尔可苷 A(DA)。本发明有助于DA产量的大量生产，为DA的开发与应用提供保障。转化DA的原料 莱鲍迪苷C具有一定的后苦味（王德骥.再论甜菊糖苷的甜度、甜味和苦涩后味的成因机 理[J].食品工业科技，2010, 05:417-420)，用其制备DA等其他稀有糖苷可使RC物料得到 充分利用。
[0016] 本发明公开了嗜松青霉（Penicilliumpinophilum)在制备杜尔可苷A中的应用。
[0017] 本发明所述