一种提高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种竹材资源转化利用的技术领域，具体地说，是涉及一种可有效提 高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的综合处理方法。
【背景技术】
[0002] 由于人类社会对化石能源的依赖程度不断增大以及我国逐步限制以粮食为原料 来生产生物能源(如生物乙醇)，利用木质纤维原料生产生物燃料(特别是燃料乙醇）已成为 我国最重要的研究领域之一。纤维素燃料乙醇的生产过程主要包括预处理、酶水解、发酵、 蒸馏等四个主要的单元操作，其中高效地将木质纤维原料中纤维素水解为可发酵糖（即酶 水解）是其中最为关键环节。然而，天然进化过程使木质纤维原料结构非常致密，半纤维素 和木质素显著阻碍了纤维素酶对纤维素的水解。为了克服这种阻碍作用，预处理已成为纤 维素燃料乙醇生产过程中必不可少的工艺。
[0003] 对于常见的木质纤维原料，如桉木、杨木、马尾松等，已开发出多种预处理方法(如 酸法、碱法、蒸汽爆破、酸/碱催化的有机溶剂(如乙醇法）等）均可显著提高木质纤维原料 中纤维素低浓(如2%)酶水解的转化率。然而，生产成本过高仍然是阻碍纤维素燃料乙醇工 业化进程的最大障碍。其中，最为直接的便是乙醇的蒸馏成本，其约占整个木质生物乙醇投 资成本的30%。而致使乙醇蒸馏成本过高的直接原因便是经发酵产生的乙醇浓度无法达到 经济性蒸馏目标（4%，v/v)，其蒸馏所需的能耗过高。很显然，如果采用高底物浓度并能进 行有效酶水解，提高发酵液中供微生物发酵的可发酵糖浓度，经发酵提高最终发酵液中乙 醇浓度就可从根本上解决上述发酵液中乙醇蒸馏能耗过高的问题。然而，现有的实践表明， 在相同底物和除底物浓度外相同的酶水解条件下，酶水解转化率随木质纤维原料底物浓度 的增加而不断下降。因此，高浓酶水解效率低下已成为木质纤维原料转化为乙醇过程中亟 待解决的技术瓶颈问题。
[0004] 经研究发现，残留在预处理所得固体基质中非纤维组分(半纤维素和木素）对纤维 素酶可产生明显的无效吸附。当酶水解底物浓度较低时(如2%，w/w)，固液体系中存在大量 自由水，纤维素酶较易脱附于非纤维素组分，进而再次作用于底物中的纤维素，最终提高酶 水解的效率；然而，当酶水解底物浓度较高时(如18%以上，w/w)，固液体系中自由水较少， 体系黏度较大，非纤维素组分的浓度（w/w)显著增大，无效吸附的纤维素酶难以脱附于非纤 维素组分，单位时间内可作用于底物中纤维素的酶分子数量显著减少，导致高浓酶水解效 率下降，过程生产成本依然较高。由此可见，导致纤维素燃料乙醇生产效率低下、造成最终 生产成本过高的主要原因之一仍然是低效率的预处理方法或工艺。开发出一种可清洁高效 分离半纤维素和木素的预处理方法或工艺将是解决上述技术瓶颈问题的根本途径，其对我 国纤维素燃料乙醇早日实现工业化也将具有重要意义。
[0005] 目前，已开发的典型预处理方法主要有热水、稀酸、稀碱、蒸汽爆破、酸性亚硫酸 盐、酸催化的有机溶剂、离子液体等。但对于实现三大组分高效清洁分离以及提高木质纤维 原料中纤维素高浓酶水解效率而言，这些预处理方法均或多或少地存在一定的缺陷。酸法 预处理(如热水、稀酸和酸性亚硫酸盐）可使半纤维素显著溶出，但木素大量残留于固体基 质中，其可使大量的纤维素酶发生无效吸附，固体基质中纤维素高浓酶解效率难以提高。稀 碱预处理则可部分溶出木素，但半纤维素也显著阻碍固体基质中纤维素对酶的可及性。蒸 汽爆破预处理虽然可显著破坏木质纤维原料细胞壁的组织结构，但非纤维素组分大量残留 于固体基质中。尽管离子液体预处理可同步高效地溶出木素和半纤维素，最终固体基质中 纤维素高浓酶解效率也得以明显提高，但离子液体价格昂贵，且其大量残留于固体基质中， 如不得以洗脱，其将显著抑制纤维素酶和发酵微生物的作用效率，但洗净需消耗大量的水。 酸催化的有机溶剂可实现类似于离子液体预处理作用，且溶剂易于洗涤和回收，但为使半 纤维素和木素达到理想的溶出量，其需要提高酸催化剂的浓度或预处理温度，这使得纤维 素发生明显的降解，即便固体基质中纤维素高浓酶水解转化率得以提高，最终葡萄糖回收 率仍然较低，酶解液中可发酵葡萄糖浓度也较低。由此可见，现有预处理方法均难以同时达 至IJ"非纤维素组分溶出率高、纤维素降解率低、固体基质中纤维素高浓酶解效率高"等多重 要求。
[0006] 因此，部分中国专利采用预处理后酶解添加表面活性剂或者两步预处理的方法来 实现提尚固体基质中纤维素尚浓酶水解的目标： (1) 一种木质纤维素酸碱親合预处理方法，公开(公告）号：CN 102153763 A ; (2) -种木质纤维素糖化水解制备还原糖的方法，公开(公告）号：CN 103184258 A; (3) -种蔗渣生物质组分高效分离的组合预处理方法，公开(公告）号：CN 102180994 A； (4) 一种木质纤维素生物质的综合利用方法，公开(公告）号：CN 103045697 A ; (5) -种木质纤维类生物质高效酶水解的方法，公开(公告）号：CN 102174594 A; (6) -种提高同步糖化发酵木质纤维素乙醇得率的方法，公开(公告）号：CN 103290067 A ； (7) -种秸杆类木质纤维素高效糖化半酶解同步发酵产乙醇的方法，公开(公告）号：CN 101899478 A ； (8) 高固体含量木质纤维素原料生产乙醇的生物反应器，公开(公告）号：CN 102154381 A； 专利文献（1)~ (4)是耦合酸法和碱法两步预处理后进行酶水解的专利。专利文献 (1)第一步预处理是低温酸法预处理(包括有机酸和无机酸)，第二步是采用低温碱法预处 理(包括氨水和NaOH等);专利文献（2)第一步预处理是碱氧预处理（由NaOH和H202溶液组 成)，第二步是采用稀酸预处理(主要是无机酸）；专利文献（3)是由稀酸浸渍的蒸汽爆破和 醇碱预处理组成。当纤维素酶用量在5~60FPU/g纤维素时，尽管专利文献（1)~(3)固体 基质中纤维素酶水解转化率达80%以上，但底物浓度均低于10% (w/w)，这与本发明所侧重 于高底物浓度酶水解（18%以上，w/w)有本质区别。专利文献（4)是由无机酸和稀碱预处理 组成的两步预处理，当酶水解底物浓度提高至15%时，纤维素酶水解转化率低于80%，且耦 合酸碱两步预处理所产生预处理废液难以处理。专利文献（5)采用一步高温液态水预处理， 当底物浓度为30%时，尽管固体基质中纤维素酶水解转化率接近90%，但是预处理所用原料 需粉碎至40~60目尺寸，对于木质生物质而言，原料机械粉碎至该尺寸需消耗较高的能耗； 此外，酶解过程还需添加0. 075~0. 2ml/g固体基质的Tween 80表面活性剂，这将使后续乙 醇蒸馏后的废液难以处理。专利文献（6 )和（7 )是采用一步蒸汽或稀碱预处理后同步或半 同步糖化和发酵产乙醇，专利文献（8)是开发高固体含量木质纤维素原料生产乙醇的生物 反应器，这与本发明有本质区别。尽管木质纤维原料预处理提高纤维素酶水解的发明还有 较多，但其所采用的预处理或酶水解方法与本发明存在较大区别，在此不再一一赘述。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有预处理方法应用于竹材纤维素高浓酶水解的缺陷，提 供一种可有效提高竹材纤维素高浓酶水解产可发酵糖效率的综合处理方法。
[0008] 为实现本发明的目的，采用的技术方案是：所述的一种提高竹材纤维素高浓酶水 解产可发酵糖效率的方法，包括如下步骤： (1) 选取2~3年生竹材，经削片成竹片，如：三维尺寸为20 X 15 X 4mm的竹片，将其作为 原料进行后续预处理； (2) 第一步高沸点醇预处理，其技术条件为：将步骤（1)制得的竹片原料放入密封后可 耐高压的不锈钢小罐内，再往小罐的罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油 浴反应器中的固定支架上，盖上油浴反应器的盖子后进行预处理，预处理温度200~210°C， 温度优选控制误差为±2°C，预处理时间35~45min，上述预处理所需的溶液为高沸点醇预 处理液，所述高沸点醇预处理液由高沸点醇和去离子水组成，其中高沸点醇在高沸点醇预 处理液中的体积比以ml: ml计为大于8%小于等于15% ;高沸点醇预处理液和竹片原料质 量的比值以ml: g计为5~7,油浴反应器支架的转动速度为3~5rpm，预处理完成后，立即将 油浴反应器中的小罐取出，用自来水冷却至室温，然后将小罐内的固液混合物在60目的尼 龙网袋中过滤，固体和液体分离后得预处理液和固体基质； (3) 固体基质的分散处理，其技术条件为：将步骤（2)所得的固体基质在植物粉碎机中 进行处理，以降低固体基质中纤维束的尺寸，每次取步骤（2)获得的固体基质20g，装入捣 碎罐中，在8000~12000 r/min的剪切搅拌速度下处理20~30s，处理完成后，获得较分散的、 纤维状的固体基质； (4) 第二步醇/水预处理，将步骤（3)制得的含纤维状的固体基质再次装入密封后可耐 高压的不锈钢小罐内，再往小罐的罐体中加入预处理所需的溶液，将小罐密封后置于油浴 反应器中进行预处理，其技术条件为：预处理温度160~170°C，温度优选控制误差为±2°C， 预处理时间60~90min，醇/水预处理液由高沸点或低沸点醇和去离子水组成，其中高沸点 或低沸点醇在醇/水预处理液中的体积比以ml: ml计为大于等于50%小于等于70%，醇/ 水预处理液和固体基质绝干质量的比值以ml: g计为8~15,预处理完成后，立即将油浴反 应器中的小罐取出，用自来水冷却，然后将小罐内的固液混合物在垫有双层滤纸的布氏漏 斗上过滤，将固体和液体分离，得经第二步预处理的固体基质； (5) 第二步无酸催化醇/水预处理所得固体基质的超声处理，其技术条件为：将步骤 (4)预处理后获得的固体基质装入带有钻孔橡皮塞的三角瓶，往三角瓶中加入新鲜的醇/ 水混合溶液，其中醇在新配置的醇/水预处理液中的体积比以ml: ml计为大于等于50%小 于等于70%，新配置的醇/水预处理液和绝干固体基质质量的比值以ml: g计为8~15,再将 此三角瓶放入一个大烧杯中，往烧杯内和血清瓶外的区域加入冰水混合物，然后将超声探 头通过钻孔橡皮塞放入到三角瓶中的液体液面2/3以下的位置处，开始进行超声处理，其 技术条件为：超声处理的功率为500~700W，超声处理时间30~60min，超声处理完成后，立即 将三角瓶取出，然后在垫有双层滤纸的布氏漏斗上过滤，将固体和液体分离，得经超声处理 的固体基质； (6) 超声处理所得固体基质的洗涤，其技术条件为：将步骤（5)所得的固体基质置于一 个大烧杯中，用去离子水对固体基质进行洗涤，所述去离子水与固体基质以体积和质量的 比值ml: g计为6~10,磁力搅拌速度为300~600r/min，洗涤时间为30~60min，洗涤温度为 室温，重复洗涤1次后，在垫有双层滤纸的布氏漏斗上将固体基质和洗涤液进行分离，得经 洗涤处理的固体基质； (7) 洗涤后固体基质的高浓酶水解，其技术条件为：将步骤（6)制得的固体基质加入 到水热釜的聚四氟乙烯内衬中，将此内衬装入水热釜内，拧紧水热釜的盖子，然后将密封的 水热釜安装到空气浴均质反应器的支架上，关上均质反应器的门后开始进行固体基质的高 浓酶水解，其技术条件为：固体基质作为底物的质量比浓度为18%~25%，所述％