纤维二糖水解酶的变体的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月12日提交的美国临时专利申请号USSN61/736, 315的优 先权权益，并且以引用的方式全文并入本文中。
技术领域
[0003] 本公开总体上涉及糖苷水解酶变体，特别是纤维二糖水解酶（CBH)的变体。还描 述了编码CBH变体的核酸、包含CBH变体的组合物、产生CBH变体的方法以及使用所述变体 的方法。
[0004] 政府权利
[0005] 本发明是在由美国能源部授予的基金号DE-FC36-08G018078下、在政府支持下进 行的。政府具有本发明的某些权利。
[0006] 发明背景
[0007] 纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最丰富的植物材料。它们能被许多会产 生能够将聚合物底物水解成单体糖的胞外酶的微生物（包括细菌、酵母和真菌）降解并且 用作能源（Aro等人，2001)。由于对非可再生资源途径的限制，所以纤维素成为主要可再生 能源的潜能是巨大的（Krishna等人，2001)。通过生物过程对纤维素的有效利用是克服食 品、饲料和燃料短缺的一种途径（Ohmiya等人，1997)。
[0008] 纤维素酶是水解纤维素（0-1，4-葡聚糖或0D-糖苷键）导致形成葡萄糖、纤 维二糖、纤维低聚糖等的酶。传统上将纤维素酶分成三个主要类型：内切葡聚糖酶（EC 3. 2. 1. 4) ( "EG")、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶（EC3. 2. 1. 91) ( "CBH"）和0 -葡萄糖 苷酶（[0]-D-葡萄糖苷葡糖水解酶；EC3. 2. 1.21) ("BG")。（Knowles等人，1987 ;Shulein， 1988)。内切葡聚糖酶主要作用在纤维素纤维的非晶部分，而纤维二糖水解酶还能够降解结 晶纤维素（Nevalainen和Penttila，1995)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存 在是结晶纤维素有效溶解所必需的（Suurnakki等人，2000)。葡萄糖苷酶起到从纤维二 糖、纤维低聚糖和其他葡萄糖苷释放D-葡萄糖单位的作用（Freer，1993)。
[0009] 已知纤维素酶由大量细菌、酵母和真菌产生。某些真菌会产生能够降解结晶形式 的纤维素的整个纤维素酶体系，使得纤维素酶容易通过发酵大量产生。由于许多酵母诸如 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)缺少水解纤维素的能力，因此丝状真菌起特殊作 用。（参见例如Aro等人，2001;Aubert等人，1988;Wood等人，1988 ;和Coughlan等人）。
[0010]CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类可进一步扩展以包括每个分类内的多个组分。 例如，已从包括里氏木霉（Trichodermareesei)的多个真菌来源分离了多种CBH、EG和BG， 里氏木霉含有2种CBH的已知基因，g卩，CBHI和CBHII、至少8种EG的已知基因，g卩，EG 1、￡6 11、￡6 111、￡61￥、￡6￥、￡6￥1、￡6￥11和￡6￥111以及至少5种86的已知基因，即，861、 BG2、BG3、BG4 和BG5。
[0011] 为了将结晶纤维素有效地转化成葡萄糖，需要包含来自CBH、EG和BG每个分类 的组分的整个纤维素酶体系，而分离的组分在水解结晶纤维素方面不太有效（Filho等人， 1996)。已观察到来自不同分类的纤维素酶组分之间的协同关系。具体地讲，EG型纤维素 酶和CBH型纤维素酶协同地相互作用以有效地降解纤维素。（参见例如Wood，1985)。
[0012] 在本领域中已知的是，纤维素酶可用于处理纺织品，用于增强洗涤剂组合物的清 洁能力，用作软化剂，用于改善棉织物的触感和外观等（Kumar等人，1997)。
[0013] 已描述了具有改善的清洁性能（美国专利No. 4, 435, 307 ;英国申请No. 2, 095, 275 和2, 094, 826)并且用于处理织物以改善纺织品的触感和外观的含有纤维素酶的洗涤剂组 合物（美国专利No. 5, 648, 263、5, 691，178 和 5, 776, 757 ;英国申请No. 1，358, 599 ;静岡県 立纺织品工业研宄所报告（TheShizuokaPrefecturalHammamatsuTextileIndustrial ResearchInstituteReport)，第 24 卷，第 54-61 页，1986)。
[0014] 在本领域中进一步已知的是，纤维素酶可用于将纤维素原料转化成乙醇。这一过 程具有许多优点，包括否则将丢弃（例如焚烧或土地填埋原料）的大量原料的易于可利用 性。已考虑将主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的其他材料，例如木材、草本作物和农 业或城市废物用作乙醇产生的原料。
[0015] 本领域中有利地是提供纤维二糖水解酶（CBH)变体，其具有改善的用于将纤维素 材料转化成单糖、二糖和多糖的特性。变体CBH的改进的特性包括但不限于：改变的温度依 赖性活性概况、热稳定性、pH活性、pH稳定性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。
【发明内容】
[0016] 本公开描述了具有纤维素酶活性的分离的变体纤维二糖水解酶（CBH)、编码此类 CBH酶的核酸、含有CBH酶编码多核苷酸的宿主细胞（例如表达CBH酶的宿主细胞）、含有CBH酶的组合物以及其产生和使用方法。
[0017] 因此，本发明的方面提供亲本CBH酶的变体，其中所述变体具有纤维素酶活性、与 SEQIDN0:3具有至少80%序列同一性，并且具有至少一种优于亲本CBH酶的改善的特性， 所述特性选自：(a)表达（蛋白含量确定）、（b)PASC水解测定、（c)EG2存在下的PASC水 解测定、（d)热孵育后PASC水解测定、（e)全水解产物PCS(whPCS)测定、（f)稀氨玉米芯 (daCC)测定以及（g)稀氨玉米杆（daCS)测定。
[0018] 在某些实施例中，CBH变体具有至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种 优于亲本CBH的、选自以上列表的改善的特性。
[0019] 在某些实施例中，CBH变体具有一种或多种属于如本文所定义的组A的高度可组 合的置换（参见以下实例部分）。
[0020] 在某些实施例中，CBH变体具有一种或多种属于如本文所定义的组B的高度可组 合的置换，其中变体可进一步具有一种或多种属于组A的氨基酸置换。
[0021] 在某些实施例中，CBH变体具有一种或多种属于如本文所定义的组C的高度可组 合的置换，其中变体可进一步具有一种或多种属于组A或组B的氨基酸置换。
[0022] 在某些实施例中，CBH变体在至少一个位点处具有如本文所定义（参见以下实例 部分和表4)有效性得分为4的氨基酸置换。
[0023] 在某些实施例中，CBH变体在至少一个位点处具有有效性得分为3的氨基酸置换， 其中变体可在某一位点处进一步具有有效性得分为4的至少一个另外的置换。
[0024] 在某些实施例中，CBH变体在至少一个位点处具有有效性得分为2的氨基酸置换， 其中变体可在某一位点处进一步具有有效性得分为3或4的至少一个另外的置换。
[0025] 在某些实施例中，CBH变体在至少一个位点处具有有效性得分为1的氨基酸置换， 其中变体可在某一位点处进一步具有有效性得分为2或3或4的至少一个另外的置换。
[0026] 在某些实施例中，CBH变体具有如本文所定义（参见以下实例部分和表4)变体适 宜性得分为+++++的至少一个氨基酸置换。
[0027] 在某些实施例中，CBH变体具有变体适宜性得分为++++的至少一个氨基酸置换， 其中变体可进一步具有变体适宜性得分为+++++的至少一个另外的置换。
[0028] 在某些实施例中，CBH变体具有变体适宜性得分为+++的至少一个氨基酸置换，其 中变体可进一步具有变体适宜性得分为++++或+++++的至少一个另外的置换。
[0029] 在某些实施例中，CBH变体具有变体适宜性得分为++的至少一个氨基酸置换，其 中变体可进一步具有变体适宜性得分为+++或++++或+++++的至少一个另外的置换。
[0030] 在某些实施例中，CBH变体具有变体适宜性得分为+的至少一个氨基酸置换，其中 变体可进一步具有变体适宜性得分为++或+++或++++或+++++的至少一个另外的置换。
[0031] 在某些实施例中，CBH变体具有至少一个氨基酸置换，所述置换属于如下表1所阐 述的具体有效性得分/变体适宜性得分类别A至T中的至少一个。
[0032] 表1 :CTH夺体类别
【主权项】
1. 一种分离的亲本纤维二糖水解酶（CBH)变体，其中所述变体具有纤维素酶活性、与 SEQ ID N0:3具有至少80%序列同一性，并且具有至少一种优于所述亲本CBH酶的改善的 特性，所述特性选自：(a)表达（蛋白质含量确定）、（b)PASC水解测定、（c)EG2存在下的 PASC水解测定、（d)热孵育后PASC水解测定、（e)全水解产物PCS (whPCS)测定、（f)稀氨 玉米芯（daCC)测定以及（g)稀氨玉米杆（daCS)测定。
2. 根据权利要求1所述的分离的变体，其中所述变体在某一位置处包含至少一个选 自以下各项组成的组的氨基酸置换：A414、G22、R394、T417、P227、T255、V403、F280、E337、 P258、T332、T296、N49、Y493、S196、G430、T246、Y247、N307、T356、Y466、S357、Q27、S387、 L318、T389、Y303、Y370、K287、T285、N350、D249、F338、S113、Y492、S398、T226、Y371、A316、 K346、G340、S342、D368、M374、D179、E236、Y474、G391、F418、F311、R251、T281、V104、L326、 A224以及E385,其中各氨基酸置换的位置对应于SEQ ID NO: 3。
3. 根据权利要求2所述的分离的变体，其中所述至少一个氨基酸置换选自表4。
4. 根据权利要求2或3所述的分离的变体，其中所述至少一个氨基酸置换选自以下各 项组成的组： 位置A414处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：F、N、L、M、W、R、G、K、I、H、Q、D、 C以及T ; 位置G22处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：D、E、H、P、T、F、C、A、W、L、Y、I、Q、 M、K以及S ;位置R394处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：E、P、Y、F、W、Q、L、N、T、 M、C、A、I、S、G、R、D 以及 V ; 位置T417处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：W、L、I、F、E、D、K、R、H、A、T、V、 Y、S以及Q ; 位置P227处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：1、W、M、V、E、T、L、A以及C ; 位置T255处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：E、F、L、S、W、P、D、I、N、Q、C、R、 V以及K; 位置V403处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：T、Y、N、E、D、M、I、K、R以及V ; 位置F280处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：1、H、D、N、V、W、E、F以及S ; 位置E337处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：C、V、G、Q、R、I、M、S以及W ; 位置P258处的选自以下各项组成的组的氨基酸置换：R、I、K、G、M、H、N、S、L、Q