专利名称：运动发酵单胞菌果聚糖蔗糖酶基因突变的工程菌及其构建和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种运动发酵单胞菌果聚糖蔗糖酶基因突变的工程菌；本发明还涉及此工程菌的构建方法以及其在发酵生产乙醇中的用途。
背景技术：
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是迄今为止所发现的唯一一株通过脱氧酮糖酸(Entner-Doudoroff，E-D)途径利用葡萄糖、果糖和蔗糖发酵生产乙醇的革兰氏阴性的兼性厌氧细菌。
运动发酵单胞菌有三种蔗糖水解酶胞内蔗糖水解酶SacA(intracellularsucrose-hydrolyzing enzymes)和胞外蔗糖水解酶SacC(extracellularsucrose-hydrolyzing enzymes)及胞外果聚糖蔗糖酶SacB(extracellularlevansucrase)。由于运动发酵单胞菌的细胞膜上没有蔗糖转运酶系，所以胞内蔗糖水解酶SacA在蔗糖水解和发酵中实际上不发挥作用。SacC能够水解蔗糖生成单糖(葡萄糖和果糖)，生成的单糖继而通过E-D代谢途径生成乙醇。
SacB不仅具有蔗糖水解活性，同时又具有果聚糖形成活性。即其水解蔗糖的产物是葡萄糖和果聚糖。只有葡萄糖可以进一步通过E-D代谢途径生成乙醇。因此当需要采用蔗糖作为发酵碳源制备乙醇时，由于副产物果聚糖的生成，影响了乙醇的产量。
已知SacB的蔗糖水解活性是运动发酵单胞菌总的蔗糖水解活性的1/3，所以，如果在利用运动发酵单胞菌进行蔗糖水解的过程中控制果聚糖的形成，则可以提高乙醇的收率。这是一个待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是制备一种新型运动发酵单胞菌工程菌，使其在用蔗糖作为底物发酵生产乙醇的过程中减少副产物果聚糖的形成，以提高乙醇的产率。
本发明的技术方案是1.SacB基因改造将四环素抗性基因插入到运动发酵单胞菌的果聚糖蔗糖酶基因(SacB)中，这些基因包括GeneBank L33402、AF081588、AF313764等；2.构建含有经改造的SacB基因的重组质粒将上述插入四环素抗性基因的SacB基因连接到克隆载体上，用内切酶消化，然后插入到自杀性质粒中；3.构建将四环素抗性基因插入到果聚糖蔗糖酶基因的工程菌将得到的重组质粒导入运动发酵单胞菌后，筛选具有四环素抗性的突变菌株。该突变株即为将四环素抗性基因插入到果聚糖蔗糖酶基因中的目标菌株。
所述运动发酵单胞菌包括运动发酵单胞菌XW101，及其它与其亲缘关系相近的运动发酵单胞菌菌株；所述克隆载体包括pGEM-T、pUC19、pBS、pACYC184等载体；所述自杀性质粒包括质粒pSUP202、pPHU281和pSZ21等。
本发明的优点是1.本发明得到的上述运动发酵单胞菌工程菌具有四环素抗性，使果聚糖蔗糖酶基因失活，不能将发酵底物蔗糖转化为副产物果聚糖，从而提高了将底物转化为乙醇的效率。
经测试，使用本发明得到工程菌，在以15％的蔗糖为发酵底物时，在30摄氏度静置培养经过70小时的发酵，可以明显提高蔗糖转化为乙醇(从37.2g/l到44.3g/l)的效率，即乙醇的产量提高了19％。
2.本发明采取同源重组双交换的方法使运动发酵单胞菌的果聚糖蔗糖酶基因突变失活，同时插入标记基因-四环素抗性基因，为突变后目标基因的筛选提供了方便。
具体实施例方式
以下以运动发酵单胞菌XW101为例，详细说明本发明的内容。但本发明的范围并不局限于此。应该说，本领域的技术人员用本发明的思路和方法可在任何运动发酵单胞菌中实现本发明目的。
在以下的实施例中，制备的运动发酵单胞菌工程菌是在野生型菌株的果聚糖蔗糖酶SacB基因(GeneBank L33402)的955bp处插入1950bp四环素抗性基因的目标菌株。利用SacB-F和SacB-R作为引物进行PCR扩增，可获得3.685kb的产物。上述运动发酵单胞菌XW101的果聚糖蔗糖酶基因是通过PCR克隆得到的，在进行扩增运动发酵单胞菌的果聚糖蔗糖酶基因时所用引物序列如SacB-F及SacB-R所示。
实施例1运动发酵单胞菌工程菌的制备A、运动发酵单胞菌的培养及DNA的提取运动发酵单胞菌在培养基RM(葡萄糖20g/l、酵母浸膏10g/l、磷酸二氢钾2g/l、pH6.0)中30摄氏度培养48小时后，采用CTAB法提取总DNA用于以后的遗传操作。
CTAB法提取细菌总DNA1)取单菌落接种于5ml相应的培养基中，在合适的温度下培养。根据细菌的生长率不同培养时间可由几小时到几天不等。
2)取1.0ml菌液于1.5ml离心管中，13,000rpm离心2min，弃上清。
3)沉淀重悬于1.0ml 0.85％NaCl中。
4)室温13,000rpm离心2min，弃上清。
5)沉淀重悬于550μl 1×TE中。
6)加17μl溶菌酶(35mg/ml)，37℃温育30min。
7)加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃温育30min。
8)加30μl 10％SDS，37℃温育30min。
9)加100μl 5M NaCl充分混匀。
10)加80μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴10min。
11)加等体积(0.7～0.8ml)氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻振荡混匀。
12)室温，13,000rpm离心10min。
13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)轻轻振荡混匀。
14)重复第12)步。
15)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)轻轻振荡混匀。
16)重复第12)步。
17)将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入0.6体积异丙醇，混匀后室温静置60min。
18)20℃13,000rpm离心20min。
19)弃上清，加500μl 70％乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)。
20)4℃15,000rpm离心20min。
21)重复洗盐两次。
22)倒置离心管，干燥DNA沉淀10～15min。
DNA沉淀溶于20μl无菌水，-20℃保存备用。
B、运动发酵单胞菌XW101果聚糖蔗糖酶基因的克隆以SacB-F5’-GCATGCGAGATTTATATGGTTGC-3’和SacB-R5’-GTCGACGGAATAGGAAGGGTGTC-3’为引物，扩增运动发酵单胞菌的果聚糖蔗糖酶基因。得到XW101果聚糖蔗糖酶基因的PCR产物，其大小为1735bp，并重组到pGEM-T载体上，该重组质粒命名为pGS，经测序分析后，与已报道的运动发酵单胞菌果聚糖蔗糖酶基因的同源性为98％。
PCR反应体系10×PCR buffer 2μl2.5mMdNTP 2μl50μM SacB-F 0.5μl50M SacB-R 0.5μl模板DNA2μl5U/μlTaq酶0.5μl加无菌水至20μlPCR反应条件1、94℃预变性 5min2、94℃30s53℃ 1min72℃ 2min(25个循环)3、72℃10min连接体系与连接反应2×buffer 5μlpGEM-T 0.5μlPCR产物3.5μlT4连接酶(3U/μl) 1μl4℃过夜连接。
c、将四环素抗性基因插入到所克隆的果聚糖蔗糖酶基因中。
通过分析，发现重组质粒pGS的插入片段中在955bp处有唯一的Nde I酶切位点，经酶切后，将四环素抗性基因插入到该位点，构建成果聚糖蔗糖酶基因中插入有四环素抗性基因的重组质粒pGST限制性内切酶的酶切反应体系与酶切反应10×buffer5μlDNA样品 3μl限制性内切酶 0.5μl加无菌水至20μl37℃过夜酶切D、果聚糖蔗糖酶基因突变菌株的构建用SalI和SphI完全酶切重组质粒pGST后，将得到的含有四环素抗性基因插入片断的果聚糖蔗糖酶基因与经SalI和SphI完全酶切的pSUP202自杀性质粒重组，得重组质粒pSST，在pRK2013帮助下通过三亲接合导入到野生型运动发酵单胞菌XW101中，在含有四环素(20μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的RM培养基上筛选突变菌株。得到工程菌株XW101(pSST)。
E、四环素抗性基因插入位点的验证采用B中的引物，以工程菌株XW101(pSST)的总DNA为模板(反应条件和反应体系如B中所述)，可扩增到大小约为3.685kb的条带，说明四环素抗性基因经过同源重组双交换，已成功的插入到目标基因果聚糖蔗糖酶基因中间。
实施例2工程菌株XW101(pSST)利用蔗糖发酵乙醇1.培养条件1.1培养基成分蔗糖15％、酵母浸膏1％、磷酸二氢钾0.2％、pH6.01.2培养条件30摄氏度静置培养70小时2.乙醇的测定2.1色谱条件2.1.1色谱柱长2m，内径4mm。
2.1.2固定相GDX-102，60-80目2.1.3温度气化室190度，检测器190度，柱温170度。
2.1.4气体流速载气(N2)40ml/min。
2.2进样量5.0ul。
2.3定性以乙醇标准出峰时间定性。乙醇标准应用液和样品测定液各进样5.0ul，分别测定保留时间，样品与标准出峰时间对照而定性。
2.4定量2.4.1样品测定液中乙醇含量测定取样品测定液5.0ul进样，测出乙醇峰高或峰面积，依据工作曲线或回归方程计算测定液中乙醇含量(％)。
3.4.2工作曲线制作取20±0.5度的乙醇标准应用液适量用20±0.5度纯水稀释成乙醇含量(V/V)分别为0.20％、0.40％、0.60％、0.80％、1.00％的标准系列浓度。分别取上述乙醇标准系列浓度5.0ul进样，测得乙醇的峰高或峰面积。以乙醇的含量百分浓度为横坐标、相应的峰高或峰面积为纵坐标，制作工作曲线，或用最小二乘法计算其回归方程。
2.4.3计算样品中乙醇含量乙醇含量(C2H5OH，％，V/V)＝样品测定液中乙醇含量×ff一稀释倍数(1，50或100)。
6.试验结果以15％的蔗糖为发酵底物，在30摄氏度的发酵条件下，经过70小时测定发酵液中乙醇的量，发现突变菌株(44.3g/l)与野生菌XW101(37.2g/l)相比乙醇的产量得到明显提高。
权利要求
1.一种重组质粒，特征是含有插入了四环素抗性基因的运动发酵单胞菌的果聚糖蔗糖酶基因。
2.权利要求2所述的重组质粒，是权利要求1所述的果聚糖蔗糖酶基因与克隆载体连接、被内切酶消化后插入在自杀性质粒中的。
3.权利要求1或2所述的重组质粒，其中运动发酵单胞菌是运动发酵单胞菌XW101。
4.权利要求1或2所述的重组质粒的制备方法，是将权利要求1所述的果聚糖蔗糖酶基因连接到克隆载体上，用内切酶消化，并将其插入到自杀性质粒中。
5.权利要求4所述的重组质粒的制备方法，所述克隆载体包括pGEM-T、pUC19、pBS、pACYC184。
6.权利要求4所述的重组质粒的制备方法、所述自杀性质粒包括质粒pSUP202、pPHU281和pSZ21。
7.一种用于发酵生产乙醇的工程菌，特征是含有权利要求1或2所述的重组质粒。
8.权利要求7所述的工程菌，特征是含有权利要求3所述的重组质粒。
9.权利要求7或8所述的工程菌的构建方法，特征是将权利要求1或2所述的重组质粒导入运动发酵单胞菌后，筛选具有四环素抗性的突变菌株。
10.权利要求7或8所述的工程菌的用途，是用于发酵生产乙醇。
全文摘要
本发明涉及运动发酵单胞菌果聚糖蔗糖酶基因突变的工程菌及其构建和用途。本发明将四环素抗性基因插入到运动发酵单胞菌的果聚糖蔗糖酶基因中，并将得到的重组质粒导入运动发酵单胞菌后，筛选具有四环素抗性的突变菌株即为目标工程菌。本发明得到的上述工程菌具有四环素抗性，使果聚糖蔗糖酶基因失活，不能将发酵底物蔗糖转化为副产物果聚糖，从而提高了将底物转化为乙醇的效率。
文档编号C12N9/24GK1746311SQ20041000954
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月10日 优先权日2004年9月10日
发明者徐玉泉, 李淑英, 林敏 , 陈明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所