专利名称：非小细胞肺癌中miR-96基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种非小细胞肺癌中miRNA基因的应用。
背景技术：
微RNA (microRNA，miRNA )功能调控是当前生命科学的重要前沿。miRNA是一类长度为21-22 nt的非编码RNA分子，其通过转录后基因沉默调控靶基因的活性。对miRNA生物学功能及其调控的靶基因的研究表明，miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗的新途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列(3' -UTR或5' -UTR)存在着一对多的关系。miRNA通常是在细胞核内由RNA聚合酶II转录，初级转录产物为pr1-miRNA,pr1-miRNA被核酸酶RNase III Drosha和其辅助因子Pasha加工成为发卡型前体miRNA (pre-miRNA),pre-miRNA被转运蛋白Exportin 5从细胞核输出到细胞质，之后被Dicer酶复合物剪切成为短的miRNA双链，在解旋酶的帮助下miRNA双链被解离，成熟的miRNA和RNA诱导的沉默复合体(R ISC)结合。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 3' -UTR中的互补序列相结合，随即依据miRNA与其靶基因序列的互补性高低，或是抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。肺癌是导致全球癌症死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人数超过100万，并且每年新增病例120万。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常见的癌症,其中约80%的肺癌是非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC),其5年存活率仅为15%,主要原因是缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段。miRNA通过调控靶基因mRNA的翻译，在肺癌发生、发展及转移发挥重要作用。miRNA可能成为新的肺癌早期诊断和癌症进程相关的标记物，有助于疾病的准确诊断及个性化治疗。这一切设想的实现必须建立在miRNA靶基因功能研究工作的基础上。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种miR-96基因在抑制非小细胞肺癌癌细胞增殖中的应用。本发明的目的之二在于提供一种miR-96基因在促进非小细胞肺癌癌细胞凋亡中的应用。本发明的目的之三在于提供一种miR-96基因在H1299细胞系中下调CREBl表达水平的应用。本发明首先利用Solexa测序技术，利用qRT_PCR技术检测多种非小细胞肺癌系中miR-96的表达量变化，并从中选择一种miR-96表达下调最明显的非小细胞肺癌系，在此细胞系中过表达miR-96以检测其功能。细胞转染所用的转染试剂为Lipo2000(Invitrogen)。为了降低细胞密度、试剂用量及转染等因素造成的孔间差异，保证实验的可靠性和重复性，本实验中每个转染样品设置了 3个复孔。接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。细胞总RNA的提取采用生工生物公司的Trizol试剂。具体提取步骤如下:
丄J直接在培养板中加入Total RNA Extractor裂解细胞,每10 cm2面积加I ml TotalRNA Extractor，用移液器吹打混匀；
②将裂解后样品或匀浆液室温放置5-10min，使得核蛋白与核酸完全分离；
③加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15 sec,室温放置3 min。12, 000 rpm 4 °C离心10
min ；
吸取水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min ；
⑤12,000 rpm 4 °C 离心 10 min,弃上清；
⑥加入Iml 75%乙醇洗漆沉淀，12，000 rpm 4 V离心3 min,弃上清,室温干燥5-10
min ；
⑦加入30-50 1 RNase-free ddH20，充分溶解RNA，将所得到的RNA溶液置于-70 V
保存或用于后续试验。反转录PCR 米用 Takara 公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA SynthesisKit。由于miRNA与mRNA不同,miRNA不具有Poly (A)结构,但本转录试剂盒可以同时对样品中的miRNA以及它的small non-coding RNA进行Poly(A)加尾反应,然后利用UniversalAdaptor Primer将经过加尾的RNA以及mRNA进行反转录反应得到cDNA,并引入UniniRqPCR Primer的结合位点，利用这一位置对样品中任何cDNA进行定量PCR反应。用来检测的仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统，试剂为TaKaRa公司的SYBR Green Mix。这种试剂里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix, SYBR Green dye。U6用来作为内参基因。本实验所用到的引物为:miR-96 引物 Forward:5' - TTTGGCACTAGCACATTTTTGCT-3'，Reverse:为 Un1-miR qPCR primer ；U6 引物为 Forward:5' -CTCGCTTCGGCAGCACA- 3'，Reverse:5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。第二步，利用CCK8技术和流式细胞仪技术，分别检测过表达miR-96后H1299细胞的增殖和凋亡情况的变化。非小细胞肺癌H1299细胞被培养在含有10%胎牛血清的1640培养基中。CO2培养箱中含有5% 0) 2并且湿润，温度为37°C。为了降低细胞密度、试剂用量及转染等因素造成的孔间差异，保证实验的可靠性和重复性，本实验中每个转染样品设置了 3个复孔。接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。转染步骤如下:①转染非小细胞肺癌细胞的前一天，接种适当数量的细胞至培养板中，每孔加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到50%。转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率一准备mimic-lipo2000混合液:a.稀释miRNA mimic:用50 1不含血清培养基Opt1-MEM稀释miRNA mimics,使加入细胞中的终浓度为50 nmol/L,轻轻混勻，室温孵育5 min ；b.稀释lipo2000:用60 1不含血清的Opt1-MEM稀释I 1 lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5 min ；c.将a与b轻轻混勻，室温孵育20 min。注意:稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25 min之内与稀释好的mimics混合。在混合试剂时，不能剧烈吹打或震荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构和miRNA-mimics-lipo2000混合物的形成；③将miRNA-mimics-lipo2000混合液加入含有细
胞及培养液的培养孔中，轻轻混匀；④将培养板置于37°C的CO2培养箱中48 h。培养6 h后，将孔里含有mimics-1 ipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基。本实验采用D0JIND0公司的CCK8 (Cell Counting Kit_8)试剂盒。该试剂盒利用了水溶性四锉盐-WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)_5_ (2，4-二磺基苯)-2H-四锉单钠盐)。它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲瓒染料。它在450 nm吸光度下可直接在96孔板中读出，无需额外处理，由450 nm处吸光度确定的CCK8的量直接与培养物中活细胞的数量成正比。荧光染料碘化丙啶(PI)是一种可对DNA染色的细胞核染色剂，常用于细胞凋亡检测。PI是一种溴化乙锭的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。PI不能穿过活细胞膜，却能穿过破损的细胞膜而对核染色。AnnexinV是一种检测细胞凋亡的试剂，在正常的细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂双层内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。将AnnexinV与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。
第三步，通过Targetscan软件预测miR-96的靶基因，并将其mRNA的:V -UTR连接至pGL-3载体。将miR-96与重组质粒共转入HEK-293T细胞，48 h后检测荧光强度。人胚肾细胞HEK-293T (购自中科院生化细胞所细胞库)被培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。CO2培养箱中含有5% C0 2并且湿润，温度为37°C。通过查找NCBI数据库，查找到CREBl基因的mRNA序列，进而查找到该mRNA的3' -UTR序列。查找TargetScan数据库，发现在该mRNA的:V -UTR序列的1691-1697位点上含有miR-96种子序列的结合位点。设计引物，进行PCR，将该位点包含在内。CREB1-3' -UTR引物Forward:5' - GCTCTAGAGCCACAACCTGAAAGACAAA -3'，Reverse: 5' -CGGAATTCGTCCCACATTCAAATCCTCTC-3'。该引物引入了油a I和I两个酶切位点。PCR的退火温度为55°C，产物长度为619 bpo第四步，在H1299细胞中过表达miR-96，检测CREBl mRNA水平变化。非小细胞肺癌细胞株H1299被培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。CO2培养箱中含有5% C0 2并且湿润，温度为37°C。细胞转染所用的转染试剂为Lipo2000 (Invitrogen)0为了降低细胞密度、试剂用量及转染等因素造成的孔间差异，保证实验的可靠性和重复性，本实验中每个转染样品设置了 3个复孔。接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。之后提取RNAdiJ用 Takara 公司的 Primescript RT Master Mix perfect Real Time 试剂盒进行反转录，再进行qRT-PCR检测。用来检测的仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统，试剂为TaKaRa公司的SYBR Green Mix。这种试剂里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix, SYBR Greendye。18S用来作为内参基因。本实验所用到的引物为:CREBl引物Forward:5 '-CCACTGTAACGGTGCCAACT-3 '，Reverse:5 ' - GCTGCATTGGTCATGGTTAATGT-3 ' ;18S 引物Forward:5' -CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3' , Reverse:5' -TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3'。H1299细胞系中miR-96基因通过与其靶基因CREBl的mRNA的3 ^ -UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶mRNA。结合生化与分子生物学实验，确定了在H1299细胞系中miR-96与CREBl有相互作用，这种相互作用影响了 H1299细胞的增殖、凋亡等生命活动。本实验通过软件预测、构建载体，同时对靶基因的3' -UTR利用试剂盒进行突变，然后在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了 CREBl是miR-96的靶基因，并在H1299细胞中利用qRT-PCR技术，进一步验证了该发现。所公开的为在H1299细胞系中CREBl是miR-96的靶基因的首次报道，该发明在临床上为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。
图1非小细胞肺癌细胞系中miR-96的相对表达含量；
图2过表达miR-96后抑制H1299细胞的增殖；
图3过表达miR-96后促进H1299细胞的凋亡，其中A为转染了阴性对照NC后对细胞凋亡的影响情况；B为转染了 miR-96 mimics后对细胞凋亡的影响情况；
图4为miR-96在不同物种之间的保守结合位点；
图5为miR-96与靶基因CREBl野生型与突变型的结合位点情况；
图6为miR-96与靶基因CREBl野生型与突变型双荧光酶报告分析柱状图。
具体实施方式
下面将结合具体实例进一步阐述本发明。这些实例仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一:根据Solexa测序结果，确定miR-96在非小细胞肺癌细胞系中低表达 本发明所用到的k-ras基因突变小鼠肺癌模型(L703T2)和正常肺癌模型(L1805)由中
科院生化细胞所季宏斌教授课题组提供。将正常小鼠的肺组织和患有非小细胞肺癌的小鼠的肺组织取样，用TRIZOL法裂解组织，加入氯仿，待蛋白与核酸分层，离心之后吸取上清并加入异丙醇沉淀，再次离心后以乙醇洗涤沉淀，晾干，获得总RNA。利用TaKaRa公司的反转录试剂盒构建两种组织的cDNA文库，以oligo dT为引物进行反转录,通过变性反应和反转录2步获得后续实验的cDNA。将样品利用Solexa方法测序(Solexa测序由华大基因公司完成)，进一步研究发现在非小细胞肺癌细胞系中miR-96的表达显著下调(参见图1)。实施例二:miR-96对H1299细胞增殖的影响
将H1299细胞均匀的铺在96孔板中，使用的培养基为1640。24 h后将miR-96的mimics通过lipo2000转染试剂，通过无血清培养液的共孵育后转入H1299细胞中，转染6 h后换掉细胞培养液，放入新鲜的培养液，然后立即加入CCK8试剂，在培养箱里培养2.5 h，再吸出来在酶标板里测，每隔24 h测量一次，检测波长为450 nm。检验发现，转染组与对照组相比较，其吸光度有显著的下降，也即转染了 miR-96的细胞的增殖速度显著低于对照组，说明miR-96具有抑制H1299细胞增殖的作用(参见图2)。
实施例三:miR-96对H1299细胞凋亡的影响
将H1299细胞均匀地铺在6孔板中，24 h后将miR-96的mimics通过lipo2000与无血清培养液1640共孵育后转入H1299细胞中，转染6 h后将细胞培养液换为新鲜培养液。转染 48 h 后，将收集到的细胞用 annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)凋亡检测试剂盒(Sigma-Aldrich，USA)染色细胞。用流式细胞技术检测H1299细胞的凋亡情况。结果表明，转染了 miR-96的H1299细胞凋亡率明显大于对照组(参见图3)。实施例四:双荧光素酶报告基因分析
将CREBl mRNA的3' -UTR (619 bp)连接在pGL_3质粒上，该质粒上含有SV40的启动子，连接上的3' -UTR包含了 miR-96与CREBl的结合位点。用lipo2000转染试剂把miR-96的mimics与构建好的质粒共转入HEK-293T细胞中，并同时转入pRL质粒作为背景信号，在转染6 h后将培养液换为新鲜培养液。转染48 h后,用Promega公司的双突光素酶报告基因分析试剂盒检测PGL和pRL的荧光表达。转染的质粒的终浓度为400 nmol/L,mimics的终浓度为20 nmol/L。结果发现，转染了 miR-96的HEK-293T细胞中双荧光素酶的表达显著低于对照组。之后利用突变试剂盒做了 CREBl 3' -UTR的点突变，用lip2000转染试剂把miR-96的mimics与构建好的点突变质粒共转入HEK-293T细胞中。转染48 h后，用promega公司的双突光素酶报告基因分析试剂盒检测。结果发现,转染了 miR-96的HEK-293T细胞中双荧光素酶的表达与对照组没有什么变化，这些都说明CREBl是miR-96的靶基因(参见图4)。
实施例五:qRT_PCR验证miR_96对H1299细胞内源CREBl基因的抑制作用
将 H1299 细胞均匀地铺在 6 孔板中，24 h 后将 miR-96 mimics,NC,miR-96 inhibitor、ant1-NC通过lipo2000与无血清培养液1640共孵育后转入H1299细胞中，转染6 h后将细胞培养液换为新鲜培养液。转染48 h后，收集细胞，提取RNA，利用Takara公司试剂盒反转录为cDNA，之后进行qRT-PCR检测。结果表明，miR-96对CREBl具有抑制作用(参见图5和图6。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种miR-96基因在抑制非小细胞肺癌癌细胞增殖中的应用。
2.—种miR-96基因在促进非小细胞肺癌癌细胞凋亡中的应用。
3.一种miR-96基因在H1299细 胞系中下调CREBl表达水平的应用。
全文摘要
本发明涉及一种非小细胞肺癌中miRNA基因的应用。H1299细胞系中miR-96的一种靶基因CREB1，miR-96通过与靶基因mRNA的3′-UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶基因的mRNA。本发明确定了在H1299细胞系中miR-96与CREB1有相互作用影响了H1299细胞的增殖、凋亡等生命活动。本发明通过软件预测、构建载体，再在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析，初步验证了CREB1是miR-96的靶基因，接着在H1299细胞中利用过表达miR-96、qRT-PCR的技术，进一步验证了该发现。所公开的为在H1299细胞系中CREB1是miR-96的靶基因的首次报道，该发明在临床上为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK103224983SQ20131005623
公开日2013年7月31日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者金由辛, 侯品品, 申雨晴, 王德韬, 马中良, 韦嘉励 申请人:上海大学