专利名称：人非小细胞肺癌l858r+v834l基因突变原代肿瘤移植瘤模型的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药行业，尤指一种人非小细胞肺癌L858R+V834L基因突变原代肿瘤移植瘤模型在筛选治疗非小细胞肺癌EGRF突变阳性患者的靶向药物中的应用，并为探索表皮生长因子受体(EGFR)突变在非小细胞肺癌发生中的作用提供实验技术平台。
背景技术：
非小细胞肺癌患者EGFR酪氨酸激酶区域基因突变在我国肺癌患者中的发生率约 为30%左右，突变主要发生在外显子19和21，各占突变总数的54. 5%和40. 3%。其中外显子21第858位密码子发生碱基替换(T — G)突变，使得EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸(L)转变为精氨酸(R)，简称L858R突变，第834位密码子发生碱基替换(G — T)突变，该位点的氨基酸由缬氨酸(V)转变为亮氨酸(L)简称V834L突变。虽然目前国际上已有少数两个EGFR L858R突变的细胞株，但目前还未见L858R+V834L双基因突变细胞株。且目前认为虽然肿瘤细胞株实用、可重复、易于操作，但是这些模型的治疗结果与病人的临床结果的一致性欠佳，主要由于只有极少数的原发性肿瘤能形成细胞株，且他们的生长为单层不能反应人类肿瘤的微环境和在体内对治疗产生相同的反应，而且这些在体外生长的肿瘤代表了一组临床预后更差的病人，从而需要其他的更多临床相关非小细胞肺癌NSCLC模型，并将它们应用在临床实验中。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种人非小细胞肺癌L858R+V834L基因突变原代肿瘤移植瘤模型的应用。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种人非小细胞肺癌L858R+V834L基因突变原代肿瘤移植瘤模型，表达L858R+V834L基因突变，且肿瘤能被吉非替尼抑制，该模型在筛选治疗非小细胞肺癌EGRF突变阳性患者的靶向药物中的应用，并为探索EGFR突变在非小细胞肺癌发生中的作用提供实验技术平台。人非小细胞肺癌L858R+V834L基因突变原代肿瘤移植瘤模型的建立实验动验为5组3-4周龄SCID小鼠，每组10只，雌性，体重10 12g，购于中国医学科学院实验动物研究所，在SPF级条件下饲养。从手术室无菌取病人原代肺肿瘤组织转移至含15 mL Hank’s液的无菌离心管中，4°C运至实验室。在实验室超净工作台中用O. OlM PBS缓冲液清洗3次，去除正常组织及坏死肿瘤组织，将瘤体剪成I. O I. 5mm3大小的瘤块，24h内用套管针接种于第一组免疫缺陷小鼠背部皮下，每只小鼠接种ABCD四个点，见图1，每点各接种I. O I. 5_3瘤块两块，在小鼠背部中间两侧左右各剪一小口，用套管针将肿瘤组织送至AB⑶四个点。当免疫缺陷鼠某一点的皮下移植瘤直径大于I I. 5cm时，用戊巴比妥钠过量麻醉处死小鼠，剥离肿瘤，将瘤体剪成I. O I. 5mm3大小的瘤块，再次用套管针接种于第二组免疫缺陷小鼠背部皮下，每只小鼠接种AB两个点，各接种I. O I. 5mm3瘤块两块，如此接种至第四代。每一代均留标本做HE染色、免疫组化、免疫印迹、DNA测序。结果分别如图2、图3、图4和图5所示，从图2HE染色可以看出P1、P2、P3、P4各代均保持PO患者肿瘤的病理特性。图3为L858R突变单克隆抗体免疫组化染色，AEC染色，阳性为红色，从图中可以看出PO、P1、P2、P3、P4各代均表达EGFR L858R突变蛋白。图4为L858R突变单克隆抗体免疫印迹，M为蛋白质分子量标准，β-actin是内参蛋白，从图中可以看出P0、P1、P2、P3、P4各代均表达EGFR L858R突变蛋白，图5为L858R+V834L突变测序，图中左边箭头为V834L突变，右边 箭头为L858R突变，从图中可以看出P0、P1、P2、P3、P4各代均有L858R+V834L突变。如此，通过取病人的小片肿瘤直接移植至免疫缺陷鼠体内建立该原代肿瘤移植瘤模型，该模型均保持非小细胞肺癌、腺癌、EGFR高表达、L858R及V834L双突变的特征，能产生比细胞株和鼠类异体移植更好的代表原始肿瘤异质性的模型，该模型移植瘤能被吉非替尼(Iressa)抑制，可用于筛选治疗非小细胞肺癌EGRF突变阳性患者的靶向药物，为探索EGFR突变在非小细胞肺癌发生中的作用提供实验技术平台。
图I是肺肿瘤组织接种示意图。图2是各代移植瘤HE染色图。图3是各代L858R单克隆抗体免疫组化图。图4是各代L858R免疫印迹图。图5是各代L858R+V834L基因突变测序图。其中图2-图5各图中P0代表患者肿瘤(其所代表的图为PO代图，以此类推)，Pl代表第一代移植瘤，P2代表第二代移植瘤，P3代表第三代移植瘤，P4代表第四代移植瘤。图6是移植瘤Iressa药物试验图，图中HKI为吉非替尼溶剂对照组，Irresa为吉非替尼药物组。
具体实施例方式实验动验为3 4周龄SCID小鼠共12只，雌性，体重10 12g，购于中国医学科学院实验动物研究所，在SPF级条件下饲养。取P3代的新鲜移植瘤，将瘤体剪成I. O I. 5mm3大小的瘤块，用套管针接种于免疫缺陷小鼠背部皮下，每只小鼠接种一个点(ABCD四点中的B点)，每个点接种I. O
I.5mm3瘤块一块，当瘤体直径达到3mm时，把动物分成2组，一组喂吉非替尼，另一组为对照组，喂吉非替尼的溶剂HKI，每周测量瘤体长径、短径两次，喂药两周，两周后处死动物，取瘤体称重，瘤体数据按V = O. 5a2b (V为体积，a为短径，b为长径)作图，见图6。结果表明该移植瘤能很好的被吉非替尼抑制，能作为筛选治疗非小细胞肺癌EGFR突变阳性患者的靶向药物的模型。
权利要求
1.一种人非小细胞肺癌原代肿瘤移植瘤模型，表达L858R+V834L基因突变，且肿瘤能被吉非替尼抑制。
2.如权利要求I所述的人非小细胞肺癌L858R+V834L基因突变原代肿瘤移植瘤模型在筛选治疗非小细胞肺癌EGRF突变阳性患者的靶向药物中的应用。
3.如权利要求I所述的人非小细胞肺癌L858R+V834L基因突变原代肿瘤移植瘤模型为EGFR突变在非小细胞肺癌发生中的作用提供实验技术平台。
全文摘要
一种人非小细胞肺癌L858R+V834L基因突变原代肿瘤移植瘤模型产生的移植瘤能被吉非替尼(Iressa)抑制，本发明的L858R+V834L基因突变原代肿瘤移植瘤模型可用于筛选治疗非小细胞肺癌EGRF突变阳性患者的靶向药物，并为深入探索表皮生长因子受体(EGFR)突变在非小细胞肺癌发生中的作用提供实验技术平台。
文档编号C12Q1/02GK102660507SQ20121013449
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月3日 优先权日2012年5月3日
发明者周新民, 李建明, 胡野荣 申请人:中南大学湘雅二医院