肺癌中的c-met突变的制作方法

专利名称：肺癌中的c-met突变的制作方法
技术领域：
概括而言，本发明涉及分子生物学和生长因子调节的领域。更具体地， 本发明关注可用于诊断和治疗与突变的c-met有关的人肺癌的方法和组合物。
背景
HGF是间质衍生的多效性因子，对许多不同细胞类型具有促有丝分裂、 促运动和促形态发生活性。HGF作用是通过特定的酪氨酸激酶c-met介导 的，而且在多种肿瘤中经常观察到异常的HGF和c-met表达。参见例如 Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews (2002)， 13: 41-59; Danilkovitch-Miagkova & Zbar, J. Clin. Invest. (2002), 109(7): 863-867。在肿瘤 进展和转移中牵涉HGF/c-Met信号途径的调控。参见例如Trusolino & Comoglio, Nature Rev. (2002)， 2: 289-300。
HGF结合Met受体酪氨酸激酶(RTK)的胞外域并调控多种多样的生物 学过程，诸如细胞分散、增殖和存活。HGF-Met信号传导对于正常胚胎发 育而言是至关重要的，尤其是在肌肉祖细胞迁移及肝和神经系统发育中 (Bladt et al., Nature (1995), 376, 768-771; Hamanoue et al.， Faseb J (2000),", 399-406; Maina et al., Cell (1996)， S7， 531-542; Schmidt et al., Nature (1995), 373, 699-702; Uehara et al., Nature (1995), 373, 702-705)。敲除Met和HGF的 小鼠的发育表型非常相似，这说明HGF是Met受体的关联配体(Schmidt et al. 1995，同上；Uehara et al., 1995,同上)。HGF-Met还在肝再生、血管发生和 伤口愈合中发挥作用(Bussolino et al" J Cell Biol (1992)， 779, 629-641;Matsumoto and Nakamura, Exs (1993), <55, 225-249; Nusrat et al.， J Clin Invest
(1994) 93， 2056-2065)。Met受体前体经蛋白水解切割成由二硫键连接的胞外 a亚基和跨膜卩亚基(Tempest et al.， Br J Cancer (1988)， 5<§， 3-7)。卩亚基包含 胞质激酶结构域，而且在C末端包含多底物停靠位点，在此处衔接物(adapter) 蛋白结合并起动信号传导(Bardelli et al., Oncogene (1997), 75， 3103-3111; Nguyen et al" J Biol Chem (1997), 272， 20811-20819; Pelicci et al., Oncogene
(1995) ， 70, 1631-1638; Ponzetto et al., Cell (1994), 77, 261-271; Weidner et al,, Nature (1996), 3S《173-176)。 HGF结合后，Met活化，分别经由Gabl和 Grb2/Sos介导的PI3激酶和Ras/MAPK活化而导致了酪氨酸磷酸化和下游 4言号4专导，它马区动纟田月包运5力牙口i曾歹直(Furge et al., Oncogene (2000)， 5582-5589; Hartmann et al" J Biol Chem (1994),厕，21936-21939; Ponzetto et al., J Biol Chem (1996),"厶14119-14123; Royal and Park, J Biol Chem (1995), 270， 27780-27787)。
据显示，Met可在经致癌原处理的骨肉瘤细胞系中转化(Cooper et al.， Nature (1984)， 29-33; Park et al" Cell (1986),化895-904)。已在多种人癌 症中观察到了 Met的过表达或基因扩增。例如，Met蛋白在结肠直肠癌中 过表达至少5倍，且据报道在肝转移中有基因扩增(Di Renzo et al., Clin Cancer Res (1995), /, 147-154; Liu et al" Oncogene (1992), 7, 181-185)。据报 道，Met蛋白还在口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、乳癌和肺癌中过 表达(Jin et al., Cancer (1997)， 79, 749-760; Morello et al.， J Cell Physiol (2001), 風285-290; Natali et al" Int J Cancer (1996)，眠212-217; Olivero et al" Br J Cancer (1996), 74, 1862-1868; Suzuki et al., Br J Cancer (1996), 7《 1862-1868)。此外，在肝细胞癌、胃癌和结肠直肠癌中观察到mRNA的过 表达(Boix et al.， Hepatology (1994), 79, 88-91; Kuniyasu et al" Int J Cancer (1993)， 55, 72-75; Liu et al.， Oncogene (1992)， 7， 181-185)。
在肾乳头状癌中发现了 Met激酶结构域中的许多突变，它们导致组成 性受体活化(Olivero et al" Int J Cancer (1999), S2， 640-643; Schmidt et al., Nat Genet (1997), 7《68-73; Schmidt et al" Oncogene (1999)， 7S, 2343-2350)。这些 活化突变造成组成性Met酪氨酸磷酸化，并导致MAPK激活、病灶形成和 肺瘤发生(Jeffers et al" ProcNatl Acad Sci U S A (1997), 11445-11450)。此 夕卜，这些突变增强细胞运动和侵入(Giordano et al" Faseb J (2000)， 7《
399-406; Lorenzato et al., Cancer Res (2002), (52, 7025-7030)。转化细胞中的 HGF依赖性Met活化介导运动、分散和迁移的增加，最终导致侵入性肿瘤 生长和转移(Jeffers et al., Mol Cell Biol (1996)， 7(5, 1115-1125; Meiners et al,, Oncogene (1998), 76, 9-20)。
Met已显示出与驱动受体活化、转化和侵入的其它蛋白质相互作用。在 肿瘤细胞中，据报道，Met与a6(34整联蛋白(诸如层粘连蛋白的胞外基质 (ECM)组分的受体)相互作用，以促进HGF依赖性的侵入生长(Trusolino etal.， Cell (2001), 707, 643-654)。此外，Met胞外域已显示出与脑信号蛋白 (semaphorin)家族的成员丛蛋白Bl相互作用，以增强侵入生长(Giordano et al.， Nat Cell Biol (2002),《720-724)。而且，已知牵涉肺瘤发生和转移的 CD44v6据l艮道也与Met和HGF形成复合物并导致Met受体活化 (Orian-Rousseau et al.， Genes Dev (2002)， 76, 3074-3086)。
Met是受体酪氨酸激酶(RTK)亚家族的成员，包括Ron和Sea (Maulik et al,, Cytokine Growth Factor Rev (2002), /3, 41-59)。 Met胞外域的结构预测表 明它与脑信号蛋白和丛蛋白同源。Met的N末端包含约500个氨基酸的Sema 结构域，其在所有脑信号蛋白和丛蛋白中是保守的。脑信号蛋白和丛蛋白 属于一个分泌的和膜结合的蛋白质大家族，首先因其在神经发育中的作用 而^皮记载(Van Vactor and Lorenz, Curr Bio (1999)， 79， R201-204)。不过，近来 将脑信号蛋白的过表达与肿瘤的侵入和转移联系起来了。在丛蛋白、脑信 号蛋白和整联蛋白中发现的富含半胱氨酸PSI结构域(也称为Met相关序 列结构域)邻近Sema结构域，随后是4个IPT重复片段，其是在丛蛋白和 转录因子中发现的免疫球蛋白样区域。近来的研究表明Met Sema结构域足 以使HGF和肝素结合(Gherardi et al.， Proc Natl Acad Sci U S A (2003), 7即仏12039-44)。
如上所述，Met受体酪氨酸激酶由其关联配体HGF活化，而且受体磷 酸化激活下游MAPK、 PI-3激酶和PLC-y途径(7， 2)。激酶结构域内的 Y1234/Y1235磷酸化对于Met激酶活化来说是关键的，而多底物停靠位点 中的Y1349和Y1356对于结合同源体-2 (SH2)、磷酸酪氨酸结合(PTB)、和 Met结合结构域(MBD)蛋白来说是重要的(3-5),用以介导下游信号传导途径 的活化。另一个近膜磷酸化位点Y1003已经很好地表征了其与Cbl E3连接 酶的酪氨酸激酶结合(TKB)结构域的结合(6， 7)。据报道，Cbl的结合驱动
吞蛋白(end叩hilin)介导的受体内吞、泛素化及随后的受体降解(S)。该受体 下调的^/L制以前在也具有相似Cbl结合位点的EGFR家族中有记载(9-77)。
多种肿瘤中据报道有Met和HGF失调。在数种癌中观察到配体驱动的 Met活化。在肺、乳腺癌、和多发性骨髓瘤中观察到升高的血清和肿瘤内HGF (W-")。在多种癌中，诸如在结肠直肠、肺、胃、和肾癌中，据报道有Met 和/或HGF的过表达、Met扩增或突变，而且认为这驱动配体依赖性受体活化 (2， 76)。另外，肝小鼠模型中诱导性Met过表达引起了肝细胞癌，这证明了 受体过表达驱动配体依赖性肿瘤发生(77)。 Met参与癌的最引人注目的证据 据报道是在家族性和散发性肾乳头状癌(RPC)患者中。Met激酶结构域中造 成受体组成性活化的突变在RPC中被鉴定为种系和体细胞突变(/S)。将这些 突变导入转基因小鼠模型造成肿瘤发生和转移(")。
尽管已经详细调查了 Met激酶结构域的作用，但是Met除激酶结构域 外的结构域表征得不好。事实上，尽管涉及多种肿瘤学疾患的病因，但是 HGF/c-met途径是在治疗上难以靶向的途径。在这方面的努力大部分受到以 下事实的阻碍，即单一肿瘤类型有可能包括多基因亚型，而HGF/c-met异 常可能仅构成每一种肿瘤类型的一部分。对于难以治疗、而且遗传学和组 织学变化的癌症，诸如肺癌，该问题是特别棘手的。所以，清楚的是，有 重大需求要获得精确的方法来鉴定最有可能对抑制HGF/c-met途径有响应 的癌。本文提供的发明达到了该需求并提供了其他益处。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，完整纳入本文参考。

发明内容
炮生长因子(HGF)的受体c-met中发现的 多突变事件，其与肺肿瘤发生密切相关。尽管以前认为异常的c-met活性与 多种癌有关，但不知道什么(如果有的话)特定体细胞突变造成了 c-met 信号传导途径的失调。具体而言，不清楚激酶结构域外面的什么(如果有 的话)突变与例如肺肿瘤的人肿瘤的发生有关。本文公开了经常在人肺肿 瘤中找到的c-met胞外和近膜结构域中的多种突变事件。相信这些突变倾向 于和/或直接带来人肺肿瘤发生。事实上，如本文所述，在人肺肿瘤细胞中， 有些突变直接增强c-met蛋白的稳定性并由此增加了它的量。
本文/>开的c-met突变可用于多种环境，例如用于预后、预测、诊断、
和治疗的方法和组合物。在一个方面，本发明4是供了预后方法，其包括确
定来自受试者的肺癌样品是否在编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中 该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变 化。在另一个方面，本发明提供了预后方法，其包括确定来自受试者的肺 癌样品是否在编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该序列在外显子 14和/或其侧翼的内含子中有突变，其中该突变影响外显子剪接。
在另一个方面，本发明提供了在样品中检测肺癌的方法，其包括确定 样品是否在编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变化。在另外一个方面， 本发明提供了在样品中4企测肺癌的方法，其包括确定样品是否在编码人 c-met的核酸序列中包含突变，其中该突变在外显子14和/或其侧翼的内含 子中，其中该突变影响外显子剪接。
在一个方面，本发明提供了区别非癌性的与癌性的肺组织的方法，所 述方法包括确定样品是否包含在编码人c-met的核酸序列中包含突变的肺 组织，其中该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造 成氨基酸变化，其中样品中检测到突变表明存在癌性的肺组织。在一个方 面，本发明提供了区别非癌性的与癌性的肺组织的方法，所述方法包括确 定样品是否包含在编码人c-met的核酸序列中包含突变的肺组织，其中该突 变在外显子14和/或其侧翼的内含子中，其中该突变影响外显子剪接，其中 样品中检测到突变表明存在癌性的肺组织。
在一个方面，本发明提供了鉴定肺癌中c-met突变和/或检测肺癌中突 变的c-met基因的方法，所述方法包括将肺癌样品与能够检测编码人c-met 的核酸序列中突变的试剂接触，其中该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变化。在一个方面，本发明提供了鉴定肺 癌中c-met突变和/或检测肺癌中突变的c-met基因的方法，所述方法包括将 肺癌样品与能够检测编码人c-met的核酸序列中突变的试剂接触，其中该突 变在外显子14和/或其侧翼的内含子中，其中该突变影响外显子剪接。
在一个方面，本发明提供了鉴定能用c-met抑制剂治疗的肺癌和/或预 测肺癌将对用c-met抑制剂进行的治疗有响应的可能性和/或预测/鉴定哪些 经诊断患有肺癌的患者将对用c-met抑制剂进行的治疗有响应的方法，所述方法包括确定来自受试者的肺癌样品是否在编码人c-met的核酸序列中包 含突变，其中该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处 造成氨基酸变化。在一个方面，本发明提供了鉴定能用c-met抑制剂治疗的 肺癌和/或预测肺癌将对用c-met抑制剂进行的治疗有响应的可能性和/或预 测/鉴定哪些经诊断患有肺癌的患者将对用c-met抑制剂进行的治疗有响应 的方法，所述方法包括确定来自受试者的肺癌样品是否在编码人c-met的核 酸序列中包含突变，其中该序列在外显子14和/或其侧翼的内含子中有突 变，其中该突变影响外显子剪接。
在一个方面，本发明提供了确定受试者中的肺癌对用c-met抑制剂进行 的治疗的响应性和/或监测用c-met抑制剂治疗受试者的方法，所述方法包 括确定来自用c-met抑制剂治疗的受试者的肺癌样品是否在编码人c-met的 核酸序列中包含突变，其中该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/ 或E168位处造成氨基酸变化，其中缺少突变的核酸序列表明肺癌对用c-met 抑制剂进行的治疗是响应的。在一个方面，本发明提供了确定受试者中的 肺癌对用c-met抑制剂进行的治疗的响应性和/或监测用c-met抑制剂治疗受 试者的方法，所述方法包括确定来自用c-met抑制剂治疗的受试者的肺癌样 品是否在编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该序列在外显子14和/ 或其侧翼的内含子中有突变，其中该突变影响外显子剪接，其中缺少突变 的核酸序列表明肺癌对用c-met抑制剂进行的治疗是响应的。
在一个方面，本发明提供了监测用c-met抑制剂治疗肺癌的受试者中最 小限度后遗症的方法，所述方法包括确定来自用c-met抑制剂治疗的受试者 的样品是否在编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变化，其中检测到所述 突变表明存在最小限度遗留的肺癌。在一个方面，本发明提供了监测用c-met 抑制剂治疗肺癌的受试者中最小限度后遗症的方法，所述方法包括确定来 自用c-met抑制剂治疗的受试者的肺癌样品是否在编码人c-met的核酸序列 中包含突变，其中该序列在外显子14和/或其侧翼的内含子中有突变，其中 该突变影响外显子剪接，其中检测到所述突变表明存在最小限度遗留的肺 癌。
在另一个方面，本发明提供了扩增编码人c-met的核酸的方法，其中该 核酸包含相对于野生型c-met在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168
位处造成氨基酸变化的突变，所述方法包括用包含图7表S4中所列任何引 物/探针序列的核酸来扩增怀疑或已知包含该核酸的样品。在另 一个方面，
本发明提供了扩增编码人c-met的核酸的方法，其中该核酸在外显子14和/ 或其侧翼的内含子中包含突变，其中该突变影响外显子剪接，所述方法包 括用包含图7表S4中所列任何引物/探针序列的核酸来扩增怀疑或已知包含 该一亥S臾的纟羊品。
在一个方面，本发明提供了在样品中鉴定c-met中特定突变的方法，其 中该突变是相对于野生型c-met在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或 E168位处造成氨基酸变化的突变，所述方法包括将样品与包含图7表S4 中所列任何引物/探针序列的核酸接触。在另外一个方面，本发明提供了在 样品中鉴定c-met中特定突变的方法，其中该突变在外显子14和/或其侧翼 的内含子中，其中该突变影响外显子剪接，所述方法包括将样品与包含图7 表S4中所列任何？ j物/探针序列的核酸接触。
在一个方面，本发明提供了检测肺癌中存在突变的c-met的方法，该方 法包括将怀疑或已知包含突变的c-met的样品与包含图7表S4中所列任何 引物/探针序列的核酸接触。在一个实施方案中，该核酸与能与编码c-met 的核酸杂交的核酸探针杂交，而且其中探针的杂交表明编码c-met的核酸中 缺少突变。在一个实施方案中，探针的杂交表明编码c-met的核酸中存在突 变
在一个方面，本发明提供了检测肺癌中存在突变的c-met的方法，该方 法包括将怀疑或已知包含突变的c-met的样品与本发明的抗原结合剂接触， 其中所述样品与所述抗原结合剂的结合或不结合表明存在或缺少在第 N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处包含突变的c-met多肽。在 一个方面，本发明提供了检测肺癌中存在突变的c-met的方法，该方法包括 将怀疑或已知包含突变的c-met的样品与本发明的抗原结合剂接触，其中其 与试剂的结合或不结合表明存在或缺少包含至少一部分外显子14缺失的 c墨met多肽。
在一个方面，本发明提供了检测肺组织中的癌症病情的方法，所述方 法包括确定来自怀疑患肺癌的受试者的样品是否在编码人c-met的核酸序 列中包含突变，其中该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168 位处造成氨基酸变化，其中检测到所述突变表明在受试者的肺中存在癌症
病情。在一个方面，本发明提供了检测肺组织中的癌症病情的方法，所述
方法包括确定来自怀疑患肺癌的受试者的样品是否在编码人c-met的核酸 序列中包含突变，其中该序列在外显子14和/或其侧翼的内含子中有突变， 其中该突变影响外显子剪接，其中检测到所迷突变表明存在最小限度遗留 的肺癌。
本发明还提供了多种可用于检测和/或诊断肺癌的组合物，其包含本文 所提到的c-met突变。因此，在一个方面，本发明提供了肺癌的生物标志物， 其中该生物标志物包括在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位 处包含造成氨基酸变化的突变的c-met。在一个方面，本发明提供了肺癌的 生物标志物，其中该生物标志物包括在外显子14和/或其侧翼的内含子中包 含突变的c-met，其中该突变影响外显子剪接。本发明的生物标志物可以是 提供关于存在或缺少本发明突变信息的任何形式。例如，在一个实施方案 中，生物标志物是核酸分子。在另一个实施方案中，生物标志物是多肽。 在一个实施方案中，多肽可通过本发明的抗原结合剂来^r测，该试剂结合 包含突变位点的突变的c-met结合位点，其中该突变位点是在第N375、I638、 V13、 V923、 B16和/或E168位处的氨基酸替代，或其中该突变位点是外显 子14的缺失部分。在一个实施方案中，缺失部分包含基本上整个外显子14。
在一个方面，本发明提供了肺癌成像剂，其中该试剂特异性结合包含 突变的c-met,其中该试剂结合在蛋白质第N375、 1638、 V13、 V923、 1316 和/或E168位处包含突变的c-met多肽，或其中该试剂结合在对应于第 N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处氨基酸变化的核酸位置处包 含突变的c-met编码核酸。在一个方面，本发明提供了肺癌成像剂，其中该 试剂特异性结合包含至少一部分外显子14缺失的c-met多肽，或其中该试 剂特异性结合缺少至少一部分编码外显子14的序列的c-met编码核酸。
本发明还提供了能够与c-met编码核酸特异性杂交的多核苷酸，所述 c-met编码核酸在对应于在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位 处氨基酸变化的核酸位置处包含突变。在另一个方面，本发明提供了能够 与c-met编码核酸特异性杂交的多核苷酸，所述c-met编码核酸缺少至少一 部分编码外显子14的序列。
在一个方面，本发明提供了能够特异性结合c-met多肽的抗原结合剂， 所述c-met多肽在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处包含突
变。在另 一个方面，本发明提供了能够特异性结合c-met多肽的抗原结合剂， 所述c-met多肽包含至少一部分外显子14缺失。
在一个方面，本发明提供了分离的和纯化的核酸分子，其包含编码人 c-met的序列的至少一部分，其中所述那至少一部分在对应于c-met氨基酸 第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处变化的核香酸位置处包 含突变。在另一个方面，本发明提供了分离的和纯化的核酸分子，其包含 编码人c-met的基因组序列的至少 一部分，其中所述那至少 一部分在编码外 显子14和/或其侧翼的内含子的序列中包含突变，其中该突变影响外显子剪 接。在一个方面，本发明提供了本发明核酸分子编码的多肽。在一个方面， 本发明提供了重组载体，其包含本发明的核酸分子。在一个方面，本发明 提供了宿主细胞，其包含本发明的重组载体。在一个方面，本发明提供了 生产本发明多肽的方法，所述方法包括培养包含本发明重组载体的宿主细 胞，并分离重组载体表达的多肽。
在一个方面，本发明提供了阵列/基因芯片/基因集合，其包含能够与 c-met编码核酸特异性杂交的多核苦酸，所述c-met编码核酸在对应于第 N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处氨基酸变化的核酸位置处包 含突变。在另一个方面，本发明提供了阵列/基因芯片/基因集合，其包含能 够与c-met编码核酸特异性杂交的多核苷酸，所述c-met编码核酸缺少至少 一部分编码外显子14的序列。
在一个方面，本发明提供了计算机可读取介质，其包含在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处包含突变的人c-met氨基酸多肽序列，和 /或在对应于第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处氨基酸变化 的核酸位置处包含突变的编码人c-met多肽的核酸序列。在另一个方面，本 发明提供了计算机可读取介质，其包括包含至少一部分外显子14缺失的人 c-met氨基酸多肽序列，和/或缺少至少一部分编码外显子14的序列的人 c-met编码核酸。在一个实施方案中，本发明的计算机可读取介质包括储存 一个或多个受试者序列信息的储存介质。在一个实施方案中，该信息是已 知或怀疑患有肺癌的受试者的个人化(personalized)基因组图谱，其中该基因 组图谱包括包含本发明突变的c-met的序列信息。
在一个方面，本发明提供了试剂盒和/或制品，其包括上文提到的本发 明组合物，及说明用该组合物来检测人c-met第N375、 1638、 V13、 V923、
1316和/或E168位处突变的说明书。在一个方面，本发明提供了试剂盒和/ 或制品，其包括本发明的组合物，及说明用该组合物来检测包含外显子14 缺失的人c-met的说明书。
如本文所示，人肺癌细胞的一个亚群由于体细胞突变而显示出缺失人 c-met的至少一部分外显子14，其导致了迄今还未知的具有致瘤活性的功能 性人c-met剪接变体。因此，在一个实施方案中，本发明的影响外显子剪接 的突变是与产生突变的但有功能的c-met蛋白有关的突变，该蛋白质缺少至 少一部分外显子14。"功能性/有功能的"意味着蛋白质能够有至少一种与野 生型人c-met蛋白正常有关的细胞信号传导活性。在一个实施方案中，缺失 的外显子14的部分造成了 Cbl结合和下调活化的c-met受体所必需的 Y1003磷酸化位点丧失。在一个实施方案中，包含至少一部分外显子14缺 失的突变的c-met包含基本上完整的外显子13和外显子15。在一个实施方 案中，包含至少一部分外显子14缺失的突变的c-met包含野生型c-met的 跨膜结构域和/或胞外结构域。在一个实施方案中，包含至少一部分外显子 14缺失的突变的c-met包含胞外配体结合结构域。能够以本文所述的方式
来确定。此类突变的例子包括与剪接机制变化有关的任何(多个)突变， 所述剪接机制通常与人c-met RNA剪接有关。例如，此类突变包括5，或3， 剪接位点、分支点、多聚嘧啶片等中的一个或多个序列改变，诸如

图1A、 图2、和图6表S3中提及的那些。进一步确认存在或产生功能性c-met剪 接变体可利用本领域已知技术来确定，其中一些在下文实施例中有述。
在一个实施方案中，第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位 处的突变分别造成这些替代N375S， I638L, V13L, V923L， I316M,和 E168D。特定的替代还显示于图6的表3中。
本发明的突变可通过本领域已知的任何合适方法来检测，包括但不限 于(a)基于等位基因特异性限制性内切核酸酶切割的限制性片段长度多态性 检测，(b)与包括固定化寡核苷酸或寡核苷酸阵列的等位基因特异性寡核苷 酸探针杂交，(c)等位基因特异性PCR、错配-修复检测(MRD)， (d)结合MutS 蛋白，(e)变性-梯度凝胶电泳(DGGE), (f)单链构象多态性检测，(g)在错配 碱基对处的RNA酶切割，(h)异源双链DNA的化学或酶促裂解，(i)基于等 位基因特异性引物延伸的方法，(i)基因比特分析(GBA)， (k)寡核苷酸连接测
定法(OLA), (l)等位基因特异性连接酶链式反应(LCR), (m)缺口-LCR，和(n) 方文射性、比色和/或焚光DNA测序。
附图简述
图1. Met中导致外显子14剪接的肿瘤特异性内含子突变的鉴定。(A) Met外显子14的示意图，显示了 3个鉴定出的核酸缺失和/或点突变(实线 和/或箭头)相对于剪接位点连接点0艮据RefSeqNM—000245)的位置。H596, 细胞系；pat. 14/pat. 16，患者肿瘤标本。(B)来自包含内含子突变或野生型 Met的标本、涵盖外显子14的RNA转录物的RT-PCR扩增。WT，野生型； U，未剪接的；S,剪接的。(C)来自患者匹配的、正常的肺组织和表达野 生型或突变型Met转录物的标本的原发性肿瘤组织的溶解产物中的Met蛋 白质表达。肌动蛋白免疫印迹用作蛋白质上样对照。总Met转录物水平通 过定量PCR来评估，而且标示了相对表达值(2-ACt)。缩写N，正常肺组织； T，原发性肺肿瘤。(D)Met蛋白的示意图，显示了从原发性肺肿瘤标本(上) 或肺细胞系和异种移植物模型(下)中鉴定出的氨基酸变化的分布。氨基酸缺 失标示为柱形，而替代标示为箭头。根据患者匹配的、非肿瘤性的肺组织 的基因组DNA测序结果，基因变化被确认作体细胞突变(黑柱/箭头)、多态 性(白箭头)、或不确定(灰柱/箭头)。
图2,描述了 Met外显子14侧翼的示例性的内含子突变。Met外显子 14的示意图，显示了相应核酸(NM一000245)缺失和/或点突变(灰亮文本)， 关于内含子/外显子结构。(A)H596,肺癌细胞系。(B)pat. 14,患者14的肺 肿瘤标本。(C)pat. 16,患者16的肺肺瘤标本。作为参照，对于肺瘤H596， 在(A)中标记的+ 1位处有G至T的点突变。对于肿瘤Pat 14,在(B)中有乂人 标记的-27至-6位的序列缺失。对于肿瘤Pat 16，在(C)中有从标记的3195 至+7位的序列缺失。还以有义和反义方向显示了代表性的测序层析图。
图3.在患者14和16非肿瘤性的肺组织中不存在内含子突变。有义(F) 和反义(R)方向的测序层析图高亮显示了患者14 (A)和16 (B)的相应缺失(黑 括号)的位置。黑箭头代表外显子14侧翼的5，或3'剪接点的位置。 图4. 表S1显示了测序的肺和结肠癌标本的概要。 图5. 表S2显示了肺和结肠癌标本中Met和K-ras基因变化的概要。 图6.表S3显示了具有Met基因变化的标本的详细一览表。
图7. 表S4描述了用于测序的PCR引物。
图8.描述了示例性的顺式作用剪接元件，预计其调节人c-met外显子 14的剪接。预计在这些元件内一个或多个位置处的突变对外显子14的野生 型剪接将会有消极影响。
图9. 描述了基于RefS叫.NM一000245的野生型人c-met蛋白质序列。
实施本发明的方式
通用技术
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微 生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的 技术范围内。这些4支术在文献中有充分解释，诸如"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 第二版 (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait纟扁，1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney纟扁，1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al.编，1987，及其周期性的更新)；"PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al.编，1994)。
本发明中所使用的引物、寡核苷酸和多核苷酸可利用本领域已知的标 准技术生成。
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普 通技术人员通常的理解具有相同的含义。以下文献为本领域技术人员提供 了本申请中所使用的许多术语的一般性指导Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第二版,J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)，禾口 March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure,第四版，John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)。
定义
术语"阵列"或"微阵列"在用于本文时指可杂交阵列元素，优选多 核苦酸探针(例如寡核苷酸)在基片上的有序排列。基片可以是固体基片 (诸如玻璃载玻片)或半固体基片(诸如硝酸纤维素膜)。核苷酸序列可以 是DNA、 RNA、或其任意排列。
"靶序列"、"靶核酸"或"靶蛋白质"在用于本文时指感兴趣的多核
芬酸序列，其中怀疑或已知存在需要检测的本发明突变。 一般而言，"模板" 在用于本文时指包含靶核苷酸序列的多核苷酸。在有些情况中，术语"靶 序列"、"模板DNA"、"模板多核苷酸"、"靶核酸"、"靶多核苷酸"、及其变 异可互换使用。
"扩增"在用于本文时一般指生成多拷贝的所需序列的过程。"多拷贝"
指至少2个拷贝。"拷贝"不必指与模板序列有完美的序列互补性或同一性。
例如，拷贝可包括诸如脱氧肌苷的核苷酸类似物、故意引入的序列改变(诸
或在扩增过程中发生的序列错误。
"多核苷酸"或"核酸，，在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合
物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经 过修饰的核普酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合 酶掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如曱基 化核香酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合 物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以 在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记用组分偶联。其它类型的修饰包括 例如"帽"，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸 如例如具有不带电荷连接(例如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺酯 (phosphoamidate)、氨基曱酸酯等)和具有带电荷连接(例如硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯等)的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质(例 如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)的修饰、具有嵌入剂(例 如吖啶、补骨脂素等)的修饰、含有螯合剂(例如金属、放射性金属、硼、 氧化性金属等)的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接(例如a端 基异构核酸(anomeric nucleic acid)等)的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。 另夕卜，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷 酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸 的别的连接，或者可偶联至固相支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺 或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护 基团。多核苦酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物 形式，包括例如2'-氧-曱基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类 似物，a-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如曱基核糖核苷。 可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括
但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S ("硫代酸酯"(thioate))、 P(S)S ("二硫代酸酯，，(dithioate))、 (0)NR2 ("酰胺酯"(amidate) )、 P(O)R、 P(O)OR'、 CO或CH2 ("曱缩醛，，(formacetal))替代，其中R或R'各自独立为H或者取 代或未取代的烷基(l-20个C),任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷 基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。 前述描述适用于本文中提及的所有多核香酸，包括RNA和DNA。
"寡核苷酸"在用于本文时一般指短的多核苷酸， 一般是单链， 一般是合 成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语"寡核苷S臾"与"多核 香酸，，并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷 酸。
"引物"一般是短的单链多核苷酸， 一般具有游离的3'-OH基团，其通过 与靶序列杂交而结合目的样品中潜在存在的靶，然后促进与靶互补的多核 苷酸的聚合。
短语"基因扩增"指通过它在特定细胞或细胞系中形成多个拷贝的基因 或基因片段的过程。所复制的区域(一段扩增的DNA)常常称为"扩增子"。 通常，所生成的信使RNA (mRNA)的量，即基因表达的水平，也按所表达 特定基因生成的拷贝数的比例升高。
术语"突变"在用于本文时指特定蛋白质或核酸(基因，RNA )分别相对 于野生型蛋白质或核酸的氨基酸或核酸序列的差异。突变的蛋白质或核酸 可以由基因的一个等位基因(杂合的)或两个等位基因(纯合的)表达或 者在其中找到，而且它可以是体细胞的或种系的。在本发明中，突变一般 是体细胞的。在一个具体的实施方案中，所述突变是在c-met的激酶结构 域区域(KDR)以外找到的，例如在胞外结构域或近膜结构域中。在另一个 实施方案中，突变是如图6中的表S3、图1A、图2中所示的氨基酸替代、 删除或插入。突变包括序列重排，诸如插入、删除、和点突变(包括单核
苷酸/氨基酸多态性)。
"抑制，，指与参照相比减小或降低活性、功能、和/或量。
术语"3'(端)"一般指同一多核苷酸或寡核苷酸中一个区域或位置的3' 端(下游)的区域或位置。因此，例如，对于外显子的3'剪接位点位于该
外显子5，末端的下游。相似的，对于内含子的3'剪接位点位于该内含子5， 末端的下游。
术语"5'(端)"一般指同一多核苷酸或寡核苷酸中一个区域或位置的5' 端(上游)的区域或位置。因此，例如，对于外显子的5，剪接位点位于该 外显子3，末端的上游。相似的，对于内含子的5'剪接位点位于该内含子3， 末端的上游。
"检测"包括任何^r测手段，包括直接和间接检测。
术语"诊断"在用于本文时指鉴定分子或病理状态、疾病或疾患，诸如 鉴定肺癌。术语"预后"在用于本文时指预测可归因于肺癌的死亡或进展的 可能性，包括例如肿瘤疾病诸如肺癌的复发、转移性扩散、和耐药性。术 语"预测"在用于本文时指患者将对一种药物或一组药物有好的或不好的响 应的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在一个实施 方案中，预测涉及患者在治疗(例如用特定治疗剂的治疗和/或外科手术去 除原发性肿瘤，和/或经某段时间的化疗)后是否存活和/或存活的可能性， 而不复发癌症。本发明的预测方法在临床上可用于^故出治疗决定，为任何 特定患者选择最适宜的治疗形式。本发明的预测方法是有价值的工具，用 于预测患者是否可能对治疗方案有好的响应，诸如给定的治疗方案，包括 例如施用给定的治疗剂或组合、外科手术干预、化疗等，或用于预测患者 在治疗方案后是否可能长期存活。
术语"长期"存活在用于本文时指治疗性处理后存活至少1年、5年、8 年、或10年。
在依照本发明使用时，术语对特定治疗剂或治疗选项"耐受性升高"意 味着对标准剂量的药物或对标准治疗方案的响应降低。
在依照本发明使用时，术语对特定治疗剂或治疗选项"敏感性降低"意 味着对标准剂量的药剂或对标准治疗方案的响应降低，其中降低的响应可 通过增加药剂剂量或治疗密度来弥补(至少部分弥补)。
"患者响应"可利用表明对患者有益处的任何终点来评估，包括但不限 于(l)在某种程度上抑制肿瘤生长，包括减緩和完全的生长阻滞；(2)减少 肿瘤细胞数目；(3)减小肿瘤尺寸；(4)抑制(即降低、减緩或完全阻止)肿 瘤细胞渗入临近的外周器官和/或组织；(5)抑制(即降低、减緩或完全阻 止)转移；(6)增强抗肿瘤的免疫应答，其可以但不必造成肿瘤消退或排
斥；(7)在某种程度上减轻一种或多种与肿瘤有关的症状；(8)延长治疗后存 活的长度；和/或(9)降低治疗后给定时间点的死亡率。
癌症的"病理学"包括所有危及患者康乐的现象。这包括但不限于异 常或不受控制的细胞生长、转移、对临近细胞的正常功能的干扰、以异常 水平释放细胞因子或其它分泌产物、抑制或加重炎症或免疫学应答、瘤形
成、癌变前(premalignancy)、恶性肿瘤、侵入周围或远处的组织或器官(诸 如淋巴结)等。
术语"c-met抑制剂"和"c-met拮抗剂，，在用于本文时指有能力抑制野生 型或突变型c-met的生物学功能的分子。因此，术语"抑制剂"定义在c-met 的生物学作用的语境中。在一个实施方案中，本文中所提到的c-met抑制 剂特异性抑制经由HGF/c-met途径的细胞信号传导。例如，c-met抑制剂可 以与c-met、或与通常结合c-met的分子相互作用(例如结合)。在一个实 施方案中，c-met抑制剂结合c-met的月包外结构i^。在一个实施方案中， c-met抑制剂结合c-met的胞内结构域。在 一 个实施方案中，c-met抑制剂所 抑制的c-met的生物学活性与肿瘤的发生、生长、或扩散有关。c-met抑制 剂可以是任何形式的，只要它能够抑制HGF/c-met活性；抑制剂包括抗体 (例如下文所定义的单克隆抗体)、有机/无机小分子、反义寡核苷酸、适 体、抑制性肽/多肽、抑制性RNA (例如小干扰RNA)、其组合等。
"抗体，，(Ab)和"免疫球蛋白"(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗 体展现出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和一般缺乏 抗原特异性的其它抗体样分子二者。后一类多肽例如由淋巴系统以低水平 生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。
术语"抗体，，和"免疫球蛋白，，以最广义互换使用，包括单克隆抗体(例如 全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价、多价抗体、多特异性抗体(例 如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某 些抗体片段(如本文中更为详细描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源 化的和/或亲和力成熟的。
"抗体片段，，只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存 在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。在 一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合 抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，
保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功
能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实 施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例 如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内 稳定性的Fc序列相连。
术语"单克隆抗体"在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗 体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存 在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与典型的 包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种 单克隆抗体针对抗原上的单 一 决定簇。
单克隆抗体在本文中明确包括"嵌合"抗体，其中重链和/或轻链的一部 分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同 或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的 抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期 望的生物学活性(美国专利No. 4,816,567; Morrison " a/.，尸rac.胸/.爿cad
园81: 6851-6855 (1984》。
术语"高变区"、"HVR"或"HV"在用于本文时指抗体可变域中序列上高 度可变和/或形成结构上定义的环的区域。术语"HVR"或"HV"前面的字母 "HC，，和"LC，，分别指重链和轻链的HVR或HV。通常，抗体包含六个高变区 三个在VH中(Hl、 H2、 H3)，三个在VL中(Ll、 L2、 L3 )。本文中4吏用 且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础 的，而且是最常用的(Kabat ef a/" Segwewces o/尸rate/ws o/ /mww"o/og7'ca/ /wfemst, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。 Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk， 乂 7kfo/.所o/. 196:901-917 (1987》。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的 折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。"接触"高 变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高 变区中每一个的残基。
环Kabat AbM Chothia 接触
U L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36L2 HI
m
H2 H3
L50-L56
L89-L97
H31隱H35B
(Kabat编号)
H31-H35
(Chothia编号)
H50-H65
H95-H102
L50-L56 L89-L97 H26-H35B
H26-H35
H50-H58 H95-H102
L50-L52 L91-L96 H26-H32
H26-H32
H53-H55 H96-H101
L46-L55 L89-L96 H30-H35B
H30-H35
H47-H58 H93-H101
"框架，，或"FR"残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些 残基。
抗体的"可变区"或"可变域"指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。这 些结构域一般是抗体的最易变部分且包含抗原结合位点。
非人(例如鼠)抗体的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球 蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受 体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供 体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋 白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基 替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残 基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。 一般而言，人源化抗体 将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中整个或基本上整 个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人 免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定 区(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones a/., Atow^ 321:522-525 (1986); Riechmann " a/" Ato, 332:323-329 (1988); Presta， C匿 Op. 所o/. l593-5% (l992)。还可参见以下综述及其引用的参考文
献Vaswani and Hamilton,爿朋./i〃ergy， JW/zma cfe /wmw"o/, 1:105-115 (1998); Harris,历oc/ 细.5bc. Jhmyac"' ms 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Cwr. Op.所咖/7. 5:428-433 (1994)。
"人抗体"指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/
种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
"亲和力成熟的"抗体指在抗体的一个或多个CDR/HVR中具有一处或 多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有 所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级 的对耙抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。
Marks " a/.，所o/Tec/z"o/ogy 10:779-783 (1992)记载了通过VH和VL结构域改 组进行的亲和力成熟。以下文献记载了 CDR/HVR和/或框架残基的随机i秀 变Barbas ef a/., Prac.淑.爿cc^. SC.固91:3809-3813 (1994); Schier a/.， Ge恥169:147-155 (1995); Yelton " a/.， 乂 //wmwo/. 155:1994-2004 (1995); Jackson a/., Tmmwwo/. 154(7):3310-9 (1995); Hawkins a/., Tkfo/. Bz'o/, 226:889-896 (1992)。
术语"Fc区"用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，它可以通过用木瓜 蛋白酶消化完整抗体来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。尽 管免疫球蛋白重链Fc区的边界可有所变化，然而人IgG重链Fc区通常定 义为自Cys226位置附近或Pro230位置附近的氨基酸残基至Fc区的羧基末 端的区段。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定域，CH2结构域和CH3 结构域，任选包含CH4结构域。"Fc区链"在本文中指Fc区的两条多肽《连 之一。
术语"细胞毒剂"在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破 坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如At211、 I131、 I125、 Y9Q、 Re186、 Re1S8、 Sm153、 Bi212、 P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素 诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片 段和/或变体。
"化疗剂"指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂 类(alkylating agents)， 诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN 环磷酰胺 (cyclophosphamide); 磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)， 诸如白消安 (busulfan)、 英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan); 氮丙卩定类 (aziridines), 诸如苯佐替派(benzodepa)、 卡波醌(carboquone)、 美妥替派 (meturedepa)和乌瑞替派(uredepa);乙撑亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类 (methylamelamines), 包括六曱蜜胺(altretamine)、 三乙撑蜜胺 (triethylenemelamine)、 三乙4掌石舞酰胺(triethylenephosphoramide)、 三乙4掌石克 讦戈石粦酰胺 (triethylenethiophosphoramide) 和三羟 曱蜜 胺
(trimethylolomelamine); 番篇冲支内西旨类(acetogenins)(尤其是布4立4也辛 (bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone) ) ; 3-9-四氪大麻酚 (tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol), MARINOL );卩-拉帕醌 (lapachone); 4立巾白醇(lapachol); 一火水仙素类(colchicines); 白桦月旨酸 (betulinic acid);喜冲对石威(camptothecin)(包4舌合成类似、物4乇泊一夺康(topotecan) (HYCAMTIN )、 CPT-ll (伊立替康(irinotecan)， CAMPTOSAR )、乙酰 喜树碱、东t菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树石威)；苔藓抑素(bryostatin); callystatin; CC-1065 (包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和 比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸 (podophyllinic acid); 替尼泊香(teniposide); 隐'藻素类(cryptophycins) ( 4争另'J 是隐藻素l和隐藻素8 );多拉司他汀(dolastatin); duocarmycin (包括合成类 似物，KW-2189和CB1-TM1 );艾榴塞洛素(eleutherobin); pancratistatin; sarcodictyin; 海纟帛抑素(spongistatin); 氮齐类(nitrogen mustards), 诸如苯丁 酸氮芥(chlorambucil)、 萘氮芥(chlornaphazine)、 胆磷酰胺 (cholophosphamide)、站,莫司汀(estramustine)、 异环石粦酰胺(ifosfamide)、只又 氯乙基曱胺(mechlorethamine)、 盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、 美法仑(melphalan)、 新氮芥(novembichin)、 苯芥月旦甾醇 (phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、 曲石舞胺(trofosfamide)、尿嘧口定 氮芥(uracil mustard); 亚硝脲类(nitrosoureas), 诸如卡莫司汀(carmustine)、 氯脲菌素(chlorozotocin)、 福莫司汀(fotemustine)、 洛莫司汀(lomustine)、 尼 莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素类，诸如烯二炔类抗生 素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素yll和加利 车霉素coll (参见例如Agnew, C/zem. 33:183-186 (1994));蒽环
类抗生素(dynemicin)， 包括dynemicin A; 埃斯波霉素(esperamicin); 以及新 制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿 克拉霉素(aclacinomycin)、 放线菌素(actinomycin)、 氛茴霉素 (anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C (cactinomycin) 、 carabicin 、 洋红霉素(carminomycin)、 嗜癌霉素 (carzinophilin)、 色霉素(chromomycin)、放线菌素D (dactinomycin)、 柔红霉 素(daunombicin)、地托比星(detorubicin)、 6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比 星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN⑧、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔
比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL⑧)和脱氧多
柔比星)、表柔比星(epimbicin)、依索比星(esombicin)、伊达比星 (idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝 裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素 (olivomycin)、 培洛霉素(peplomycin) 、 potfiromycin 、 噤呤霉素 (puromycin)、 三铁阿霉素(quelamycin)、 罗多比星(rodorubicin)、 链黑菌素 (streptonigrin)、纟连佐星(streptozocin)、 杀结4亥菌素(tubercidin)、 乌笨美司 (ubenimex)、净司他丁 (zinostatin)、佐柔比星(zombicin);抗代谢物类，诸 如曱氨虫莱呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine) (GEMZAR )、替加氟 (tegafur) (UFTORAL )、卡培他滨(capecitabine) (XELODA )、埃坡霉素 (epothilone^M-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物，诸如二曱叶酸(denopterin)、 曱氨虫莱呤(methotrexate) 、 i菜罗呤(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);嘌口令 类似物，^如氟达4i滨(fludarabine)、 6-梦u基嘌呤(mercaptopurine)、辟L。米嘌 呤(thiamiprine)、辟l鸟。票呤(thioguanine); 嘧咬类似物，诸如安西他滨 (ancitabine)、 阿月包苦(azacitidine) 、 6-氛尿香(azauridine)、 卡莫氟 (carmofiar)、阿糖月包苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿 香(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿香(floxuridine);雄激素类， il"^。卡鲁睾酉同(calusterone)、 丙酉吏屈j也力f9同(dromostanolone propionate)、 表 石克雄酉孚(epitiostanol)、 美雄烷(mepitiostane)、睾内酉旨(testolactone); 抗肾上 腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦 (trilostane); 叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid); 醋葡搭内酯 (aceglatone); 醛石奔酰胺#唐芬(aldophosphamide glycoside); 氨基乙酰丙酉吏 (aminolevulinic acid); 恩尿口密咬(eniluracil); 安口丫咬(amsacrine); bestrabucil ; 比生群(bisantrene); 依达曲沙(edatraxate); 地石舞酰胺 (defosfamide); 地美可辛(demecolcine); 地吖醌(diaziquone); elfornithine; 依利醋4妄(elliptinium acetate); 依托格鲁(etoglucid); 硝酸4家；羟脲 (hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);美登木素生物 石威类(maytansinoids), i者如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin); 米 4乇胍月宗(mitoguazone); 米^6蒽酉昆(mitoxantrone); 莫派达醇(mopidamol); 二 胺硝吖p定(nitracrine);喷司他丁 (pentostatin);蛋氨氮齐(phenamet);他柔比 星(pirarubicin);》各索葱、酉毘(losoxantrone); 2-乙基酰肼(ethylhydrazide); 丙卡
巴肼(procarbazine); PSK⑧多糖复合物(JHS Natural Products, Eugene, OR); 雷佐生(razoxane); 根霉素(rhizoxin); 西佐喃(sizofiran); 螺旋锗 (spirogermanium); 纟田交链孑包菌5同酉交(tenuazonic acid); 三亚胺酉昆 (triaziquone); 2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2 毒素、疾孑包菌素(verrucarin) A 、 杆孑包菌素(roridin) A和虫它4亍菌素 (anguidin)); 乌拉坦(urethan); 长春地辛(vindesine) (ELDISINE , FILDESIN );达卡巴口秦(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine); 二溴甘 露醇(mitobronitol) ; 二溴卫矛醇(mitolactol);，派泊溴烷(pipobroman); gacytosine;阿糖胞苷(ambinoside) ("Ara-C");塞替派(thiotepa);类紫杉醇 类(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel) (TAXOL )、帕利他塞的清蛋白改造 纳米颗粒剂型(ABRAXANE丁M)和多西他塞(doxetaxel) (TAXOTERE ));苯 丁酸氮芥(chlorambucil) ; 6-石克鸟嘌呤(thioguanine); 巯基嘌口令 (mercaptopurine); 甲氨虫菜口令(methotrexate); 賴类似物，诸如顺柏(cisplatin) 和卡粕(carboplatin);长春石威(vinblastine) (VELBAN );賴(platinum);依4乇 泊苷(etoposide) (VP-16); 异环磷酰胺(ifosfamide); 米托蒽醌 (mitoxantrone); 长春新石成(vincristine) (ONCOVIN ); 奥沙利柏 (oxaliplatin);亚叶酸(leucovorin);长春瑞滨(vinorelbine) (NAVELBINE ); 能灭瘤(novantrone); 依达曲沙(edatrexate); 道诺霉素(daunomycin); 氛基 蝶呤(aminopterin);伊本膦酸盐(ibandronate);拓朴异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟曱基鸟氨酸(DMFO);类视黄酸类(retinoids),诸如视黄酸 (retinoic acid);任何上述物质的药剂学可接受的盐、酸或衍生物；以及两 种或多种上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和 泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX (奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU 和亚叶酸的治疗方案的缩写)。
该定义还包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作 用的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。 例子包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，包括例如他莫 昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX 他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene) (EVISTA )、屈洛昔芬(droloxifene) 、 4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬 (trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、 LY117018、奥那司酮(onapristone)和托 瑞米芬(toremifene) (FARESTON );抗孕酮类；雌激素受体下调剂类
(ERD);雌激素受体拮抗剂，诸如氟维司群(flilvestrant) (FASLODEX );起 抑制或关闭卯巢作用的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动 剂，诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate) (LUPRON⑧和ELIGARD⑧)、醋酸 戈舍5离片木(goserelin acetate)、 醋酉臾布舍5离才木(buserelin acetate)禾口曲普5岛4木 (triptorelin);抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide) 和比卡米特(bicalutamide);其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼 鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在肾上腺中调节雌激 素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特 (aminoglutethimide)、醋酸曱地孕西同(megestrol acetate) (MEGASE )、依西 美坦(exemestane) (AROMASIN )、 福美坦(formestane)、 法倔唑 (fadrozole)、伏氯唑(vorozole) (RIVISOR )、来曲唑(letrozole) (FEMARA ) 和阿那曲唑(anastrozole) (ARIMIDEX )。另外，化疗剂的这种定义包括二 膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS⑧或 OSTAC )、依替膦酸盐(etidronate) (DIDROCAL )、 NE-58095、唑来膦酸/ 唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate) (ZOMETA )、 阿伦膦酸盐 (alendronate) (FOSAMAX )、帕米膦酸盐(pamidronate) (AREDIA )、替鲁 膦酸盐(tiludronate) (SKELID⑧)或利塞膦酸盐(risedronate) (ACTONEL ); 以及曲沙他滨(troxacitabine) ( 1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核 苷酸，特别是那些抑制牵涉粘着细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的 反义寡核香酸，诸如例如PKC-a、 Raf、 H-Ras和表皮生长因子受体 (EGF-R); 疫苗，诸如THERATOPE 疫苗和基因疗法疫苗，例如 ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；拓朴异构酶l 抑制剂(例如LURTOTECAN ) ; rmRH (例如ABARELIX ) ; lapatinib ditosylate ( ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为 GW572016 ) ; COX-2抑制剂，诸如celecoxib (CELEBREX ; 4-(5-(4-曱苯 基)-3-(三氟曱基)-lH-吡唑-l-基)苯磺酰胺)；及任何上述物质的药剂学可接 受的盐、酸或衍生物。
"阻断性"抗体或"拮抗性，，抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学 活性的抗体。此类阻断可以任何手段发生，例如通过干扰蛋白质-蛋白质相 互作用，诸如配体与受体的结合。在一个实施方案中，阻断性抗体或拮抗 性抗体实质性或完全抑制抗原的生物学活性。
术语"癌症"和"癌性"指向或描述哺乳动物中典型特征为细胞生长/增殖 不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤(例如何杰金
氏(Hodgkin)淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类 癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺 癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫 颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠 癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外 阴癌、曱状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)及各种类型的头和颈癌。本发明的 方法和组合物具体可用于且一般针对人的肺癌，包括例如非小细胞肺癌和 小细胞肺癌，其在组织学上可表征为腺癌、大细胞、鳞状、小细胞、肺泡 细月包癌、AH生多奔卄犬(adenosquamous)等。
术语"肿瘤"在用于本文时指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性 的或者是良性的，及所有癌前的和癌的细胞和组织。
术语"样品"在用于本文时指获得自或衍生自感兴趣的受试者的组合 物，其包含有待根据例如物理、生化、化学和/或生理特点来表征和/或鉴 定的细胞和/或其它分子实体。例如，短语"肺癌样品"或"肺肿瘤样品"指得 自感兴趣的受试者的任何样品，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子 实体。
在用于本文时，"治疗"或"处理"指试图改变所治疗个体或细胞的自然 进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的 期望效果包括预防疾病的发生或复发、緩解症状、削弱疾病的任何直接或 间接病理学后果、预防转移、减緩疾病进展的速率、改善或减轻疾病状 态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的方法和组合物可用 于试图延迟疾病或病症的发生/发展。
"有效量"指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的 量。治疗剂的"治疗有效量"可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重 及该抗体在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该 治疗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。"预防有效量，，指在必 需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预 防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量 将低于治疗有效量。
除非另有说明，术语"肝细胞生长因子"或"HGF，，在用于本文时指能够在
容许HGF/c-met信号传导途经发生的条件下激活所述过程的任何天然或变 异的(无论是天然的或者是合成的)HGF多肽。术语"野生型HGF"—般指包 含天然存在HGF蛋白的氨基酸序列的多肽。术语"野生型HGF序列"一般指在 天然存在HGF中发现的氨基酸序列。c-met是已知的HGF受体，在生物学上 通过其来实现HGF胞内信号传导。基于RefSeq NM—000245的野生型人c-met 蛋白质序列描绘于图9中。
术语"持家基因"指所编码的蛋白质的活性对维持细胞功能来说是至关 重要的一组基因。这些基因通常在所有细胞类型中相似表达。持家基因包 括但不限于甘油醛-3-磷酸脱氬酶(GAPDH)、 Cypl、清蛋白、肌动蛋白例如 (3-肌动蛋白、微管蛋白、亲环蛋白、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HRPT)、 L32.28S、和18S。
术语"剪接位点"、"剪接(连接)点"、"分支点"、"多嘧啶片"在用于本 文时在哺乳动物(特别是人)的RNA剪接的语境中指本领域已知的含义。 参见例如Pagani & Baralle, Nature Reviews: Genetics (2004), 5:389-396及其 引用的参考文献。为了方便参考，图8中例示性的列出了 c-met RNA剪接 元件的序列的一个实施方案。
一般示例性技术
检测核酸突变的方法是本领域公知的。通常而非必需的是，扩增样品 中的靶核酸以提供所希望的材料量，来确定是否存在突变。扩增技术是本 领域公知的。例如，扩增产物可以涵盖或不涵盖所有编码感兴趣的蛋白质 的核酸序列，只要该扩增产物包含怀疑突变所在的特定氨基酸/核酸序列位 置。
在一个实施例中，通过将来自样品的核酸与能够与编码突变核酸的核 酸特异性杂交的核酸探针接触，并检测所述杂交，由此确定突变的存在。 在一个实施方案中，标记探针成可检测的，例如用放射性同位素(3H、 32P、 "P等)、荧光剂(若丹明、荧光素等)或发色剂标记。在有些实施方案中， 探针是反义寡聚物，例如PNA、吗啉代-氨基磷酸酯、LNA或2，-烷氧基烷 氧基。探针可以有约8个核苷酸至约100个核苷酸、或约10个至约75个、 或约15个至约50个、或约20个至约30个。在另一个方面，本发明的核酸探针在试剂盒中提供，用以鉴定样品中的c-met突变，所述试剂盒包含特 异杂交于或临近于编码c-met的核酸中的突变位点的寡核苷酸。试剂盒可进 一步包括说明根据使用试剂盒的杂交测试的结果，用c-met抑制剂治疗患包 含c-met突变的肺瘤患者的说明书。
也可通过比较扩增的核酸的电泳迁移率和相应编码野生型c-met的核 酸的电泳迁移率，由此来检测突变。迁移率差异表明扩增的核酸序列中存 在突变。可通过任何合适的分子分离技术，例如在聚丙烯酰胺凝胶上，来 确定电泳迁移率。
利用酶突变检测(EMD),也可分析核酸来4企测突变(Del Tito et al., Clinical Chemistry 44, 731-739, 1998)。 EMD使用噬菌体解离酶T4内切核酸 酶VII,其扫描双链DNA直到它检测并裂解了由碱基对错配造成的结构变 形，所述错配由核酸改变诸如点突变、插入和缺失造成。例如通过凝胶电 泳，检测到两个由解离酶裂解形成的短片段，表明存在突变。EMD方法的 益处是以单个方案直接从扩增反应中鉴定出所检验的点突变、缺失、和插 入，不需要纯化样品，缩短了杂交时间，并提高了信噪比。包含比正常至 多过量20倍的核酸的混合样品和大小至多4 kb的片段可进行测试。可是， EMD扫描不能鉴定在突变阳性样品中发生的特定碱基改变，所以如果需要， 通常要额外的测序失见程来鉴定特定的突变。如美国专利No. 5,869,245所证 实的，相似地可用CELI酶替代解离酶T4内切核酸酶VII。
另 一种用于检测本发明突变的简单试剂盒是反向杂交测试条，其与用 于检测HFE、 TFR2和FPN1基因中造成血色病的多重突变的血色病 StripAssay (Viennalabs http:〃www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)相似。 这种测试基于PCR扩增后的序列特异性杂交。对于单突变测试，可使用基 于微板的检测系统，而对于多重突变测试，可使用测试条作为"宏阵列"。试 剂盒可包括可供样品制备、扩增和突变检测即时使用的试剂。多重扩增方 案提供了便利，并允许以非常有限的体积来测试样品。利用直接StripAssay 形式，可以在不超过5小时内完成二十个及更多突变的测试，而无需昂贵 设备。从样品中分离DNA并体外扩增靶核酸(例如通过PCR)，并用生物 素标记， 一般可在单个("多重")扩增反应中进行。然后，扩增产物选择 性地与固定在诸如测试条的固体支持物上的寡核苷酸探针(野生型和突变 体特异的)杂交，其中探针固定为平行线或条带。利用链霉亲合素-碱性磷
酸酶和有色底物，来检测结合的生物素化的扩增子。这样的测试能检测本 发明的所有突变或其任意子集。对于特定的突变体探针条带，三种信号传
导模式之一是有可能的(i)仅针对野生型探针的条带，表明是正常的核酸
序列，(ii)针对野生型和突变体探针的条带，表明是杂合基因型，和(iii)仅针 对突变体探针的条带，表明是纯合突变体基因型。因此，在一个方面，本
发明提供了检测本发明突变的方法，其包括从样品中分离和/或扩增靶c-met 核酸序列，使得扩增产物包含配体，使扩增产物与包含该配体的可检测结 合配偶体的探针接触，而且该探针能够与本发明的突变特异性杂交，然后 检测所述探针与所述扩增产物的杂交。在一个实施方案中，配体是生物素， 而结合配偶体包括亲合素或链霉亲合素。在一个实施方案中，结合配偶体 包括链霉亲合素-碱性磷酸酶，其可用有色底物检测。在一个实施方案中， 探针固定于例如测试条上，其中与不同突变互补的探针彼此分开。可选地， 扩增的核酸用放射性同位素标记，在该情况中，探针不必包含可检测标记 物。
根据本发明的方法，检测野生型c-met基因的改变。本发明所述的野生 型基因的改变涵盖所有形式的突变，诸如插入、倒位、缺失、和/或点突变。 在一个实施方案中，突变是体细胞的。体细胞突变是仅发生于某些组织中 (例如在肺瘤组织中)且不在种系中遗传的那些。种系突变可以在任何身 体组织中找到。如果仅单个等位基因发生了体细胞突变，那么表示是早期 肿瘤状态。可是，如果两个等位基因都突变了，那么表示是晚期肿瘤状态。 所以如本文所述，发现c-met突变是i貪断和预后的指标。
在肝瘤组织中发现的c-met突变可使得包含突变的细胞或与突变的细 胞相互作用的其它细胞倾向于胂瘤发生。在有些情况中，本发明的突变预 计与信号传导活性相对于野生型c-met的增加有关，由此导致癌性状态。事 实上，造成外显子14缺失的本发明突变导致c-met蛋白稳定化，由此增加 了 c-met途径的信号传导并增强了包含突变的肺细胞的肿瘤发生能力。
包含耙核酸的样品可通过本领域公知的方法获得，而且它们适于特定 类型和位置的肺瘤。组织活检通常用于获得有代表性的肿瘤组织片。可选 地，可以已知或认为包含感兴趣的肿瘤细胞的组织/流体的形式间接获取肿 瘤细胞。例如，肺癌损伤的样品可通过切除术、支气管镜纟企、细针抽吸、 支气管刷检、或从痰/唾液、胸膜液或血液中获得。可从肿瘤或从其它身体
样品诸如尿、痰或血清中检测出突变的基因或基因产物。上述用于检测肿
胞从肿瘤上脱落下来，并出现在这些身体样品中。通过筛选这些身体样品， 可实现对于诸如癌的疾病的简单早期诊断。另外，通过对这些身体样品测 试突变的靶基因或基因产物，可监测治疗的进程。
本发明的方法可用于其中c-met对肿瘤发生起作用的任何肿瘤。本发明
的诊断方法对临床医生来说是有用的，由此他们可决定合适的疗程。例如， 较之仅显示出改变了一个等位基因的肺瘤，显示出改变了靶基因两个等位 基因的肿瘤可能说明要用更积极的治疗方案。本发明的方法可用于多种情 况，包括例如用于在药物开发期间帮助选择患者，用特定治疗方案治疗患 者个体时预测成功的可能性，用于评估疾病进程，用于监测治疗功效，用
于确定患者个体的预后，用于评估个体发生特定癌(例如肺癌)的倾向性， 用于区分肿瘤类型和/或胂瘤阶段等。
对组织制备物富集肺瘤细胞的手段是本领域已知的。例如，可以从石 蜡或低温保存的切片中分离组织。癌细胞也可通过流式细胞术或激光捕捉 显微解剖而与正常细胞分开。这些以及其它从正常细胞中分离肺瘤的技术 是本领域公知的。如果肿瘤组织被正常细胞高度污染，那么检测突变可能 较为困难，然而最小化污染和/或假阳/阴性结果的技术是已知的，其中一些 在下文有描述。例如，也可以对样品评估生物标志物(包括突变)的存在 情况，所述标志物已知与感兴趣的肺瘤细胞有关而与相应的正常细胞无关， 反之亦然。
可通过用本领域公知的技术来分子克隆靶核酸并测序该核酸，由此来
完成靶核酸中点突变的检测。可选地，诸如聚合酶链式反应(PCR)的扩增技 术可用于直接从肿瘤组织的基因组DNA制备物中扩增出靶核酸序列。然后 确定扩增序列的核酸序列并鉴定其突变。扩增技术是本领域公知的，例如 描述于Saiki et al., Science, 239, 487, 1988;美国专利No. 4,683,203和 4,683,195中的聚合酶链式反应。
可用于扩增本发明靶核酸的特定引物对包括列于图7的表S4中的那 些。可是，应当注意，设计并选择合适的引物是非常成熟的现有技术，因 此本发明的方法和组合物包括任何根据图7表S4中引物和/或靶核酸序列设 计的核酸探针/引物的应用。
本领域已知的连接酶链式反应也可用于扩增靶核酸序列。参见例如Wu
et al., Genomics, 4, 560-569, 1989。另外，称为等位基因特异性PCR的技术 也可使用。参见例如Ruano和Kidd, Nucleic Acids Research, 17, 8392, 1989。 根据该技术，使用的引物在其3'端与特定靶核酸突变杂交。如果不存在特 定的突变，那么不会观察到扩增产物。也可以使用耐扩增突变系统(ARMS)， 其如欧洲专利申请公开第0332435号和Newton et al., Nucleic Acids Research, 17, 7, 1989所公开的。基因的插入和缺失也可通过克隆、测序和扩增来^r测。
等位基因的改变或多态性片段的插入来评分。也可用单链构象多态性(SSCP) 分析来检测等位基因的碱基变化变体。参见例如Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86， 2766-2770， 1989和Genomics, 5， 874-879, 1989。也可用其它用 于才企测插入和缺失的本领域已知技术。
根据基因野生型表达产物的改变，也可检测野生型基因的改变。这些 表达产物包括mRNA以及蛋白质产物。通过扩增和测序mRNA或由mRNA 分子克隆制备的cDNA,来检测点突变。利用本领域公知的DNA测序技术， 来确定克隆的cDNA的序列。cDNA也可以通过聚合酶链式反应(PCR)来测 序。
本发明所述的错配是并不100。/。互补的杂交核酸双链。缺乏完全的互补 性可以是因为缺失、插入、倒位、替代或移码突变造成的。可用错配检测 来检测耙核酸中的点突变。尽管这些技术可能不如测序灵敏，然而对大量 组织样品来说更容易实施。错配裂解技术的实例是RNA酶保护方法，其在 Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7575， 1985和Meyers et al,, Science, 230, 1242, 1985中有详细描述。例如，本发明的方法可包括使用标 记的核糖核酸探针，其与人野生型靶核酸互补。衍生自组织样品的核糖核 酸探针和靶核酸在一起退火(杂交)，然后用RNA酶A消化，其能够检测 双链RNA结构中的一些错配。如果RNA酶A才企测到错配，那么它在错配 位点裂解。因此，当在电泳凝胶基质上分离退火的RNA制备物时，如果 RNA酶A检测到错配并裂解，那么将见到比核糖核酸探针与mRNA或DNA 的全长双链RNA小的RNA产物。考虑到它涵盖了怀疑突变了的位置，核 糖核酸探针不需要是全长的靶核酸mRNA或基因，但可以是靶核酸的一部
分。如果核糖核酸探针仅包含靶核酸mRNA或基因的一个区段，如果希望， 那么可能希望使用大量这些探针来筛选整个耙核酸序列的错配。
以相似的方式，可用DNA探针4企测错配，例如通过酶或化学裂解进行。 参见例如Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4397, 1988;和Shenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 989, 1975。可选地，通过错配双链体相对 于匹配双链体的电泳迁移率变化，可4全测4晉配。参见例如Cariello， Human Genetics, 42, 726, 1988。用核糖核酸纟果针或DNA#果针，可以在杂交前扩增 可能包含突变的靶核酸mRNA或DNA。尤其是如果改变是总的重排，诸如 缺失和插入，那么利用Southern杂交也可检测靶核酸DNA中的改变。
扩增出的靶核酸DNA序列也可用等位基因特异性探针筛选。这些探针 是核酸寡聚物，每一个都包含靶核酸基因中包含已知突变的区域。例如， 一个寡聚物的长度可以为约30个核苷酸，对应于部分靶基因序列。通过使 用一组这样的等位基因特异性探针，可筛选靶核酸扩增产物，以鉴定靶基 因中以前鉴定出的突变的存在。可以例如在尼龙膜上进行扩增的靶核酸序 列与等位基因特异性探针的杂交。在严格杂交条件下与特定探针的杂交表 明肿瘤组织中存在与等位基因特异性探针中相同的突变。
通过筛选相应野生型蛋白的改变，可检测野生型靶基因的改变。例如， 与耙基因产物有免疫反应性的单克隆抗体可用于筛选组织，例如用已知与
基因产物(蛋白质)的特定突变位置结合的抗体。例如，所用的抗体可以 是结合缺失的外显子(例如外显子14)的抗体或结合包含靶蛋白缺失部分 的构象表位的抗体。缺少关联抗原将表示有突变。突变等位基因产物的特 异性抗体也可用于检测突变基因产物。可以从噬菌体展示文库中鉴定抗体。 这些免疫学测定法可以以本领域任何^f更利形式进行。这些包括Western印 迹、免疫组织化学测定法和ELISA测定法。任何;险测改变的蛋白质的方法 都可用于检测野生型靶基因的改变。
利用核酸扩增技术，诸如聚合酶链式反应，本发明的引物对可用于确 定靶核酸的核芬酸序列。单链DNA引物对可以与靶核酸序列之内或周围的 序列退火，从而引发靶序列的扩增。也可使用等位基因特异性引物。该引 物仅与特定的突变靶序列退火，因此仅在存在突变的靶序列作为模板的情 况下才会扩增出产物。为了便于接下来克隆扩增的序列，引物可具有限制 酶位点序列，该序列附加在这些引物的末端。这些酶和位点是本领域公知 的。可以用本领域公知的技术来合成引物本身。 一般而言，可用寡核苷酸 合成仪制造引物，所述仪器可从商业渠道获得。设计特定引物完全在本领 域技术范围内。
本发明提供的核酸探针可用于许多目的。它们可用于对基因组DNA的
Southern杂交中，并可用于RNA酶保护方法中以4企测上文已经讨i仑过的点 突变。探针可用于检测靶核酸扩增产物。利用其它技术，它们也可用于检 测野生型基因或mRNA的错配。利用酶(例如S1核酸酶)、化学药品(例 如羟胺或四氧化4我和p底，定)、或4昔配杂交体相对于完全匹配杂交体的电泳 迁移率变化，可检测错配。这些技术是本领域已知的。参见Novack et al.， Proc. Natl. Acad. Sci.USA，83,586, 1986。 一4殳而言，探针与激酶结构域外的序列 互补。整组核酸探针可用千组成试剂盒来检测靶核酸中的突变。试剂盒容 许进行对感兴趣的靶序列的大区域的杂交。探针可彼此交叠或毗邻。
如果用核糖核酸探针来检测mRNA的错配，那么它一般与靶基因的 mRNA互补。因此，核糖核酸探针是反义探针，因为它不编码相应的基因 产物，因为它与有义链互补。核糖核酸探针一般会用放射性、比色、或荧 光材料来标记，这可以通过任何本领域已知方法来实现。如果用核糖核酸 探针来检测DNA的错配，它可以是任一极性，即有义的或反义的。相似地， 也可用DNA纟笨针来4全测错配。
本发明还提供了多种适用于进行本发明方法的组合物。例如，本发明 提供了可用于这些方法中的阵列。在一个实施方案中，本发明的阵列包含 可用于检测本发明突变的核酸分子个体或集合。例如，本发明的阵列可包 含一系列离散放置的核酸寡核苷酸个体或核酸寡核苷酸组合集，它们能与
将核酸吸附至固相基片(例如玻璃载玻片)的数种技术是本领域公知 的。 一个方法是将修饰的碱基或类似物掺入合成的核酸分子，所述碱基或 类似物包含能够附着于固体基片的部分(moiety)，诸如氨基、氨基衍生物或 带正电荷的其它基团。然后将合成产物与固相基片(诸如玻璃载玻片)接 触，所述固相基片包被有醛或会与扩增产物上的反应性基团形成共价连接 的其它反应性基团，并共价附着于玻璃载玻片。其它方法(诸如使用氨丙 基硅烷表面化学的那些)也是本领域已知的，其公开于 http:〃www.cmt,corning.com和http:〃cmgm.standord.ecu/pbrownl 。
用本领域已知方法也可能将基团附着于寡核苷酸，然后可转化为反应 性基团。寡核苦酸中核苦酸的任何附着物都将成为寡核苷酸的部分，然后 其能附着于微阵列的固相表面。
如所使用的技术需要和/或允许，可进一步修饰扩增的核酸，诸如在附 着于固相基片之前或之后，通过裂解成片段或通过附着可检测标记物来进 行。
在本发明的有些方法中，使用特异性结合c-met的抗原结合剂，所述 c-met包含本发明的突变但不是野生型的。该试剂可以是任何合适的结合剂， 诸如抗体、结合多肽和适体。这些结合剂的产生是本领域已知的，例如在 美国专利申请公开No. 2005/0042216中有描述。
c-met抑制剂抗体的例子
c-met抑制剂抗体的例子包括干扰配体(诸如HGF )与c-met结合的c-met 抑制剂。例如，c-met抑制剂可结合c-met,由此抑制HGF与c-met结合。 在一个实施方案中，拮抗剂抗体是嵌合抗体，例如包含来自非人供体的抗 原结合序列且其移植至异源非人、人或人源化序列(例如框架和/或恒定结 构域序列)的抗体。在一个实施方案中，非人供体是小鼠。在一个实施方 案中，抗原结合序列是合成的，例如通过诱变获得(例如噬菌体展示筛选 等)。在一个实施方案中，本发明的嵌合抗体具有鼠V区和人C区。在一个 实施方案中，鼠轻链V区与人K轻链融合。在一个实施方案中，鼠重链V 区与人IgGlC区融合。在一个实施方案中，抗原结合序列包含至少一个、 至少两个或全部三个轻链和/或重链CDR。在一个实施方案中，抗原结合序 列包含重链CDR3。在一个实施方案中，抗原结合序列包含保藏于美国典型 培养物保藏中心、编号为ATCCHB-11894 (杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体的部分或整个 CDR和/或可变域序列。在一个实施方案中，抗原结合序列至少包含杂交瘤 细胞系1A3.3.13或5D5.11.6所产生的单克隆抗体的重链CDR3。本发明的 人源化抗体包括在FR中具有氨基酸替代的那些及移植的CDR中具有变化 的亲和力成熟变体。CDR或FR中替代的氨基酸不限于供体或受体抗体中 存在的那些。在其它实施方案中，本发明的抗体在Fc区中进一步包含氨基 酸残基变化，其导致改善效应器功能，包括增强CDC和/或ADCC功能和B
细胞杀伤。本发明的其它抗体包括具有改善稳定性的特定变化的那些。本 发明的抗体还包括具有改善的体内ADCC功能的海藻糖缺陷变体。
在一个实施方案中，本发明的抗体片段包括包含重链的抗原结合臂，
所述重链包含至少一个、至少两个或全部三个选自下组的CDR序列 SYWLH (SEQ ID NO:l), MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:2)和 YGSYVSPLDY (SEQ ID NO:3)。在一个实施方案中，抗原结合臂所包含的 重链CDR-H1具有氨基酸序列SYWLH。在一个实施方案中，抗原结合臂所 包含的重链CDR-H2具有氨基S吏序列MIDPSNSDTRFNPNFKD。在一个实 施方案中，抗原结合臂所包含的重链CDR-H3具有氨基酸序列 YGSYVSPLDY。在一个实施方案中，本发明的抗体片段包括包含轻链的抗 原结合臂，所述轻链包含至少一个、至少两个或全部三个选自下组的CDR 序列KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4)， WASTRES (SEQ ID NO:5) 和QQYYAYPWT(SEQIDNO:6)。在一个实施方案中，抗原结合臂所包含的 轻链CDR-L1具有氨基酸序列KSSQSLLYTSSQKNYLA。在一个实施方案 中，抗原结合臂所包含的轻链CDR-L2具有氨基酸序列WASTRES。在一个 实施方案中，抗原结合臂所包含的轻链CDR-L3具有氨基酸序列 QQYYAYPWT。在一个实施方案中，本发明的抗体片段包括包含重链和轻 链的抗原结合臂，所述重链包含至少一个、至少两个或全部三个选自下组 的CDR序列SYWLH (SEQ ID NO:l)， MIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:2)和YGSYVSPLDY(SEQ IDNO:3),且所述轻链包含至少一个、至少两 个或全部三个选自下组的CDR序列KSSQSLLYTSSQKNYLA (SEQ ID NO:4)， WASTRES (SEQ ID NO:5)和QQYYAYPWT (SEQ ID NO:6)。
本发明提供了结合人c-met的人源化拮抗剂抗体或其抗原结合片段，其 中该抗体有效抑制人HGF/c-met的体内活性，该抗体在H链可变区(VH)中 至少包含保藏于美国典型培养物保藏中心、编号为ATCC HB-11894 (杂交 瘤1A3.3.13)或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细胞系所产生的单 克隆抗体的CDR3序列及基本上人共有序列(例如基本上人重链亚型III (VhIII)的人共有框架(FR)残基)。在一个实施方案中，抗体进一步包含保藏 于美国典型培养物保藏中心、编号为ATCC HB-11894 (杂交瘤1A3.3.13 ) 或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体的H 链CDR1序列和/或CDR2序列。在另一个实施方案中，前述抗体包含保藏
于美国典型培养物保藏中心、编号为ATCC HB-11894 (杂交瘤1A3.3.13 ) 或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体的L 链CDRl序列、CDR2序列和/或CDR3序列及基本上人轻链k亚型I (VkI) 的人共有框架(FR)残基。
在一个实施方案中，本发明的抗体片段包括包含重链可变域的抗原结 合臂，所述重链可变域具有序列
QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWYKQRPGQGL EWIGMEDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSA VYYCATYGSYYSPLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:7)
在一个实施方案中，本发明的抗体片段包括包含轻链可变域的抗原结
合臂，所述轻链可变域具有序列
MMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNY1AWYQQKPGQSPKL LIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLT1TSVKADDLAVYYCQQYYAYPWTFGGGTK LEIK (SEQ ID NO:8)
而在其它情况中，不干扰配体(诸如HGF )与c-met结合的c-met拮抗 剂可能是有利的。因此，在有些实施方案中，本发明的拮抗剂不结合c-met 上的配体(诸如HGF)结合位点。在另一个实施方案中，本发明的拮抗剂 基本上不抑制配体(例如HGF)与c-met结合。在一个实施方案中，本发 明的拮抗剂基本上不与配体(例如HGF )竟争结合c-met。在一个实施例中， 本发明的拮抗剂可与 一 种或多种其它拮抗剂联合使用，其中拮抗剂靶向 HGF/c-met轴内的不同过程和/或功能。因此，在一个实施方案中，本发明 的c-met拮抗剂所结合的c-met表位不同于另一种c-met拮抗剂所结合的表 位，所述另一种c-met拮抗剂诸如保藏于美国典型培养物保藏中心、编号为 ATCC HB-11894 (杂交瘤1A3.3.13 )或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)的杂 交瘤细胞系所产生的单克隆抗体的Fab片段。在另一个实施方案中，本发 明的c-met拮抗剂不同于(即它不是)保藏于美国典型培养物保藏中心、编 号为ATCC HB-11894 (杂交瘤1A3.3.13 )或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6) 的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体的Fab片段。在一个实施方案中，本 发明的c-met拮抗剂不包含保藏于美国典型培养物保藏中心、编号为ATCC HB-11894 (杂交瘤1A3.3.13 )或HB-11895 (杂交瘤5D5.11.6)的杂交瘤细 胞系所产生的抗体的c-met结合序列。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂 抑制c-met活性，但不结合c-met的野生型近膜结构域。
本发明的c-met拮抗剂抗体可以是能够干扰c-met活性的任何抗体。一
些特定的例子包括包含以下各项的抗c-met抗体
(a) 至少1个、2个、3个、4个或5个选自下组的高变区(HVR)序列
(i) 包含序列A1-A17的HVR-L1 ，
其中A1-A17是KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO:l)
(ii) 包含序歹'J B1-B7的HVR隱L2 ，
其中B1-B7是WASTRES (SEQ ID NO:2)
(iii) 包含序歹'J Cl-C9的HVR画L3，
其中Cl-C9是QQYYAYPWT (SEQ ID NO:3)
(iv) 包含序列D1-D10的HVR-H1，
其中D1-D10是GYTFTSYWLH (SEQ ID NO:4)
(v) 包含序列E1-E18的HVR-H2，
其中E1-E18是GMIDPSNSDTRFNPNFKD (SEQ ID NO:5)和
(vi) 包含序歹ll F1-F11的HVR-H3,
其中Fl-Fll是XYGSYVSPLDY(SEQIDNO:6)且X不是R;及
(b) 至少一个变异HVR,其中变异HVR序列在SEQIDNO: 1、 2、 3、 4、 5或6所述序列的至少一个残基处包含修饰。在一个实施方案中，本发 明抗体的HVR-L1包含序列SEQIDNO:l。在一个实施方案中，本发明 抗体的HVR-L2包含序列SEQIDNO:2。在一个实施方案中，本发明抗 体的HVR-L3包含序列SEQIDNO:3。在一个实施方案中，本发明抗体 的HVR-H1包含序列SEQ ID NO:4。在一个实施方案中，本发明抗体 的HVR-H2包含序列SEQ ID NO:5。在一个实施方案中，本发明抗体 的HVR-H3包含序列SEQIDNO:6。在一个实施方案中，HVR-H3包含 TYGSYVSPLDY (SEQ ID NO:7)。在一个实施方案中，HVR-H3包含 SYGSYVSPLDY (SEQ ID NO:8)。在一个实施方案中，(如本文所述， 以组合方式)包含这些序列的本发明抗体是人源化的或人的。 在一个方面，本发明提供了包含l个、2个、3个、4个、5个或6个
HVR的抗体，其中每个HVR包含选自SEQIDNO: 1、 2、 3、 4, 5、 6、 7、 和8的序列、由其组成或基本上由选组成，且其中SEQ ID NO:l对应于 HVR-L1, SEQ ID NO:2对应于HVR-L2 ， SEQ ID NO:3对应于HVR-L3, SEQ ID NO:4对应于HVR-H1, SEQ ID NO:5对应于HVR-H2，而SEQ ID NO:6、 7或8对应于HVR-H3。在一个实施方案中，本发明的抗体包含HVR-L1、
HVR-L2、 HVR-L3、 HVR-Hl、 HVR-H2、和HVR-H3,其中每个依次包含 SEQIDNO: 1、 2、 3、 4、 5和7。在一个实施方案中，本发明的抗体包含 HVR-L1、 HVR-L2、 HVR-L3、 HVR-H1、 HVR-H2、和HVR-H3，其中每个 依次包含SEQIDNO: 1、 2、 3、 4、 5和8。
本发明抗体中的变异HVR可在HVR内具有一个或多个残基的修饰。 在一个实施方案中，HVR-L2变体在任意组合的以下位置包含1-5 (1, 2, 3， 4或5)个替代B1(M或L), B2(P, T， G或S), B3 (N， G, R或T)， B4 (I, N或F), B5(P, I, L或G)， B6(A， D， T或V)和B7 (R, I， M或G)。 在一个实施方案中，HVR-H1变体在任意组合的以下位置包含1-5 (1, 2， 3， 4或5)个替代D3(N， P， L， S， A, I), D5 (I，. S或Y), D6(G, D, T， K， R), D7 (F， H， R， S, T或V)和D9 (M或V)。在一个实施方案中，HVR-H2 变体在任意组合的以下位置包含1-4(1, 2， 3或4)个替代E7(Y)， E9(I)， E10 (I), E14(T或Q)， E15 (D, K， S， T或V)， E16 (L), E17 (E, H， N 或D)和E18(Y, E或H)。在一个实施方案中，HVR-H3变体在任意组合的 以下位置包含1-5(1, 2, 3， 4或5)个替代Fl (T, S)， F3 (R， S, H, T, A， K)， F4(G), F6(R, F, M， T, E, K, A, L， W)， F7(L， I, T， R, K, V)， F8 (S, A), F10 (Y, N)和Fll (Q, S, H, F)。每个位置后括号中 的字母表示示例性的替代(即取代)氨基酸；对于本领域技术人员显而易 见的是，其它氨基酸在本文所述语境中作为替代氨基酸的合适性可常规利 用本领域已知和/或本文所述的技术来评估。在一个实施方案中，HVR-L1 包含序列SEQIDNO:l。在一个实施方案中，变体HVR-H3中的Fl是T。 在一个实施方案中，变体HVR-H3中的Fl是S。在一个实施方案中，变体 HVR-H3中的F3是R。在一个实施方案中，变体HVR-H3中的F3是S。在 一个实施方案中，变体HVR-H3中的F7是T。在一个实施方案中，本发明 的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是T或S, F3是R或S,而F7是T。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是T, F3是R而F7是T。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3， 其中F1是S。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3,其中 F1是T,而F3是R。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3， 其中F1是S， F3是R而F7是T。在一个实施方案中，本发明的抗体包含 变体HVR-H3，其中F1是T， F3是S, F7是T，而F8是S。在一个实施方
案中，本发明的抗体包含变体HVR-H3，其中F1是T， F3是S， F7是T， 而F8是A。在有些实施方案中，所述变体HVR-H3抗体进一步包含HVR-L1 、 HVR-L2、 HVR-L3 、 HVR-H1和HVR-H2，其中每个依次包含SEQ ID NO: 1、 2、 3、 4和5所述序列。在有些实施方案中，这些抗体进一步包含人亚 型III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中，框架共有序列在 第71、 73和/或78位包含替代。在这些抗体的有些实施方案中，第71位是 A, 73是T和/或78是A。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体进一步 包含人kI轻链框架共有序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-L2，其中B6是V。 在有些实施方案中，所述变体HVR-L2抗体进一步包含HVR-L1、 HVR-L3、 HVR-H1、 HVR-H2和HVR-H3,其中每个依次包含SEQ IDNO: 1、 3、 4、 5和6所述序列。在有些实施方案中，所述变体HVR-L2抗体进一步包含 HVR-L1 、 HVR-L3 、 HVR-H1 、 HVR-H2和HVR-H3,其中每个依次包含SEQ ID NO: 1、 3、 4、 5和7所述序列。在有些实施方案中，所述变体HVR-L2 抗体进一步包含HVR-L1、 HVR-L3、 HVR-H1、 HVR-H2和HVR-H3 ，其中 每个依次包含SEQIDNO: 1、 3、 4、 5和8所述序列。在有些实施方案中， 这些抗体进一步包含人亚型III重链框架共有序列。在这些抗体的一个实施 方案中，框架共有序列在第71、 73和/或78位包含替代。在这些抗体的有 些实施方案中，第71位是A, 73是T和/或78是A。在这些抗体的一个实
施方案中，这些抗体进一步包含人Kl轻链框架共有序列。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H2，其中E14是T， E15是K而E17是E。在一个实施方案中，本发明的抗体包含变体HVR-H2, 其中E17是E。在有些实施方案中，所述变体HVR-H2抗体进一步包含 HVR-L1、 HVR-L2、 HVR-L3、 HVR-H1、和HVR-H3,其中每个依次包含 SEQ ID NO: 1 、 2、 3 、 4和6所述序列。在有些实施方案中，所述变体HVR-H2 抗体进一步包含HVR-L1、 HVR-L2、 HVR-L3、 HVR-H1、和HVR-H3,其 中每个依次包含SEQ ID NO: 1、 2、 3、 4、和7所述序列。在有些实施方 案中，所述变体HVR-H2抗体进一步包含HVR-L1、 HVR-L2、 HVR-L3、 HVR-H1、和HVR-H3，其中每个依次包含SEQ ID NO: 1、 2、 3、 4、和8
所述序列。在有些实施方案中，这些抗体进一步包含人亚型m重链框架共
有序列。在这些抗体的一个实施方案中，框架共有序列在第71、 73和/或
78位包含替代。在这些抗体的有些实施方案中，第71位是A, 73是T和/ 或78是A。在这些抗体的一个实施方案中，这些抗体进一步包含人Kl轻链 框架共有序列。
下面是本发明方法和组合物的实施例。根据上文提供的一般描述，可 以理解的是，可以实施各种其它实施方案。
实施例
材料和方法
用苏木精和曙红(H&E)染色冷冻的原发性肿瘤组织标本以确诊并评估 肿瘤内容物。选择显示出有〉50。/o肿瘤内容物的标本来提取DNA。用嵌套引 物(表S4 )来进行基因组DNA的PCR扩增，并用ExoSAP-IT试剂盒(USB) 纯化产物。接着以有义和反义方向测定PCR产物的序列。为了确认核苷酸 缺失，TOPO克隆PCR产物，测序3-5个单克隆。为了测序cDNA产物， 用Qiagen的一步RT-PCR试剂盒来扩增RNA。
Met转录物表达总水平用标准Taqman 4支术通过定量RT-PCR来评估。 Met转录物水平对持家基因(P-葡糖醛酸糖苷酶(GUS))标准化，结果表示 成标准化的表达值(=2—ACt)。 针对GUS的引物/探针集有 正向，5 ，-TGGTTGGAGAGCTCATTTGGA-3'; 反向，5'-GCACTCTCGTCGGTGACTGTT-3，；和 探针，5 ， (VIC)陽TTTGCCGATTTCATGACT-(MGBNFQ)醫3 ，。 针对Met的引物/探针集有
正向，5 ， -CATTAAAGGAGACCTCACCATAGCTAAT-3';
反向，5'-CCTGATCGAGAAACCACAACCT-3，；和
探针，5 ，-(FAM)画CATGAAGCGACCCTCTGATGTCCCA-(BHQ隱1 )-3 ，。
Met扩增子代表野生型和可选剪接的Met转录物之间的保守区。
从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)、 NCI癌症治疗和-渗断部门的肿瘤库(NCI Division of Cancer Treatment andDiagnosis tumor repository)、 或曰本卫生科学基地(Japanese Health Sciences Foundation)获得细胞系。所有细胞系维持于补充了 10% FBS (Sigma)、青霉 素/链霉素(GIBCO)、和2mML-谷氨酰胺的RPMI 1640。
为了在冷冻的组织标本中进行蛋白质表达分析，在200(il细胞裂解緩冲 液(Cell Signaling)中用Polytron⑧均浆器(Kinematica)对组织(~100mg)均浆， 所述緩沖液含蛋白酶抑制剂混合剂(Sigma)、磷酸酶抑制剂混合剂I和II (Sigma)、 50mM氟化钠、和2mM原钒酸钠。在4°C轻摇1小时以进一步裂 解样品，然后用蛋白ASepharoseFastFlow(Amersham)和蛋白G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham)的混合物预清除。用Bradford试剂(BioRad)测定蛋白 质浓度。然后用SDS-PAGE解析蛋白质(20吗)，转移至硝酸纤维素膜，并 用Met(DL-21， Upstate)或(3-肌动蛋白(1-19, Santa Cruz)抗体进行免疫印迹。 通过增强的化学发光(ECL Plus, Amersham)使蛋白质显现。
结果和讨论
为了完全定位肿瘤中的Met突变，我们测序了 一组肺和结肠肿瘤标本 中的所有Met的编码外显子，所述标本代表原发性肺瘤、肿瘤细胞系和原 发性肿瘤异种移植物模型(图4中的表S1 )。在我们的测序努力中，我们在 原发性肺肺瘤标本中鉴定出了外显子14侧翼的内含子区中的体细胞杂合突 变(图1A,图2)。突变专门定位到5'剪接位点的上游内含子区，或涵盖了 3'剪接位点连接点和3'端周围的内含子(图1A )。这些缺失是肿瘤特异性的， 没有在相同个体的非肿瘤性肺组织中鉴定到(图3)。在H596 (—种非小细 胞肺癌(NSCLC)细胞系)中，我们在3p剪接供体位点中鉴定出了纯合的点 突变(图1A)。在外显子14的二核苷酸剪接位点共有和上游多嘧啶片内存 在突变，并观察到了外显子13和外显子15仍旧同相(in-phase)，这说明缺 少外显子14的潜在Met转录物仍能产生功能性Met蛋白。为了定位它，我 们首先对突变的肿瘤和细胞系进行Met RNA的RT-PCR扩增。所有三个内 含子突变造成转录物长度比野生型的短，符合其缺失了外显子14 (图1B)。 我们还通过测序RT-PCR产物，确证了缺少外显子14,而且我们的结果显 示了去除Met的L964至D1010氨基酸的读码框内(in-frame)缺失。有趣的 是，突变形式的受体是最占支配地位的表达形式，尽管肿瘤样品是杂合型
的外显子14缺失(图IB),表明变体转录物优先表达。证实占支配地位表
达的是截短的Met蛋白的Western印迹进一步确证了这个结论(图1C )。包 含这些内含子突变的标本对于测序的相应外显子中的K-ras、 B-raf、 EGFR、 和HER2是野生型的。总之，这些结果说明了这些Met内含子突变占优势 的性质。有趣的是，以前有报道说在正常小鼠组织中缺少外显子14的Met 剪接变体，然而关于肿瘤发生的功能结果并不清楚(20，")。可是，我们在 所检查的任何正常人肺标本中没检测到该剪接变体有表达(数据未显示)。 如以前所讨i仑的(")，还证实了正常人组织中缺少该剪4妄变体。据净艮道，在 原发性人NSCLC标本中，有包含缺少外显子14的剪接变体的cDNA;可 是，没有评估体细胞诱变在介导剪接缺陷中的作用，也没有评估可能表达 的(如果有的话)任何突变c-met的功能结果(W)。由于包含剪接变体的核 酸在癌细胞中并非罕见，因此还不知道报道的剪接变体的功能关联性。
分别在13%和18%的原发性肺和结肠癌标本中鉴定到了 Met中的总体 基因改变，其中改变定位于胞外脑信号蛋白(Sema)结构域和胞内近膜和激酶 结构域(图1C、图5中的表S2、图6中的表S3)。在有代表性的细胞系和 异种移植物模型中概括出这些改变，其中在肺癌细胞系中鉴定出了别的胞 外结构域改变。定位于近膜结构域的基因改变对于肺癌标本来说是独特的 (6.5%)，而且它们在结肠癌中没有鉴定到。另外，近膜改变与K-ras突变 相互排斥(图5的表S2 )。匹配患者的正常邻近组织的DNA测序揭示了 ， 在这些原发性肿瘤标本中的许多Met改变代表了罕见的多态性(图1C,图 6的表S3 )。该多态性包括以前报道的近膜结构域中的替代，在Met氨基酸 位置R970C和T992I处(22,")。如通过异位表达所评估的，鉴定到的唯一 的另一种体细胞突变涉及激酶结构域第1108位处的氨基酸替代，其导致形 成激酶失活的受体(数据未显示)。
Met近膜结构域内外显子14缺失47个氨基酸(L964-D1010),去除了 对于Cbl结合和下调活化的受体所必需的Y1003磷酸化位点。为了研究介 导Met信号传导中的该负调节位点的丧失，我们评估了突变受体活化的机 理。我们发现，剪接变体蛋白在功能上能够影响下游HGF/c-met相关的细 胞信号传导，并增加了致瘤潜力(数据未显示)，因此首次证实了与肺瘤发 生有关的c-met剪接变体的功能性结果。
在我们的分析中，RPC中没有鉴定到活化Met激酶结构域突变，而且
以前就注意到了(")。可是，在与癌有关的数种受体酪氨酸激酶中发现了激
酶结构域突变。近来在用EGFR抑制剂治疗的患者的肺肿瘤中表征EGFR， 鉴定出具有激酶结构域突变的肺肿瘤亚类，说明了 EGFR在肺癌中起重要 作用(27-W)。我们对肿瘤特异性近膜Met缺失的鉴定和表征强调了一种完 全不同的Met活化机制，其通过延緩受体下调并延长下游信号传导来进行。 而且，这些观察结果强有力的说明，Met在肺癌中起着重大的作用。这些数 据暗示，受体下调中的相似突变可导致其它致癌基因的活化，并有利于进 行不限于激酶结构域的其它序列分析。另外，在本文所述的多个非激酶结 构域位置中观察到了突变，说明这些突变也可能与人肺肿瘤发生有关，例 如使某些患者倾向于肺癌的发生和/或发展。
不管肿瘤细胞中异常剪接的内在性质，涉及驱使剪接缺陷的顺式作用 调节元件中的体细胞突变是罕见的。尽管在数种基因中找到了造成剪接缺 陷的种系突变，但是1型神经纤维瘤病(NF1)肿瘤抑制蛋白通过各种突变的 失活，提供了仅有的由癌中体细胞突变造成剪接缺陷的已知例子(3/)。我们 的数据强有力的支持了以下观点，即肺癌也利用体细胞突变造成的剪接事 件来活化致瘤基因产物。鉴定出了可差异影响剪接体装配的多类内含子突 变，还选择性的排除了外显子14,突出了 Met中该突变事件的关联性，特 别是在人肺癌的内容中。
部分参考文献列表
1. L. Trusolino, P. M. Comoglio,淑i ev G3固r 2， 289 (Apr， 2002).
2. C. Birchmeier, W. Birchmeier, E. Gherardi, G. F. Vande Woude， 7Vaf J ev M / Ce〃脂4, 915 (Dec, 2003).
3. C. Ponzettoa/., CW/ 77, 261 (Apr 22, 1994).
4. K. M. Weidner " a/" Atowre 384, 173 (Nov 14, 1996).
5. G. Pelicci "a/.， 10, 1631 (Apr 20, 1995).
6. P. Peschard W fl/., Afo/ CW/ 8, 995 (Nov, 2001).
7. P. Peschard, N. Ishiyama， T. Lin, S. Lipkowitz, M. Park, J5w/ C7ze淤279, 29565 (Jul 9, 2004).
8. A. Petrdlia/.， Ato騰416， 187 (Mar 14， 2002).
9. K. Shtiegman, Y. Yarden, S画w C""cer肠/13， 29 (Feb, 2003).
10. M. D. Marmor， Y. Yarden, O"coge"e 23, 2057 (Mar 15, 2004).
11. P. Peschard， M. Park, O 騰r Ce// 3， 519 (Jim, 2003).
12. J. M. Siegfried d a/.， ^朋r/2固c 5Wg 66, 1915 (Dec, 1998).
13. P. C. Ma " a/., j""ctwcer i es 23, 49 (Jan-Feb, 2003).
14. B. E. Elliott, W. L. Hung， A. H. Boag， A. B. Tuck， Caw JP—W 尸W謹co/ 80, 91 (Feb, 2002).
15. C. Seidel, M. Borset, H. Hjorth-Hansen, A. Sundan, A. Waage,她d Owco/ 15， 145 (S印，1998).
16. G. Maulik a/., C>tofe Grawf/z Factor i ev 13, 41 (Feb, 2002).
17. R, Wang, L. D. Ferrell, S. Faouzi， J. J. Maher， J. M. Bishop, / Ce//说W 153 1023 (May 28， 2001).
18. L. Schmidt" a/.，胸16, 68 (May, 1997).
19. M. Jeffers a/" /Voc扁加d5W j 94, 11445 (Oct 14， 1997).
20. C. C. Lee, K. M. Yamada，C/iem 269, 19457 (Jul 29, 1994).
21. CM. Baek， S. H. Jeon, J. J. Jang, B. S. Lee, J. H. Lee，Mo/ 36， 283 (Aug 31， 2004).
22. P. C. Ma " a/, ， C騰w Aey 65, 1479 (Feb 15, 2005).
23. P. C. Ma " a/.， C騰w to 63, 6272 (Oct 1, 2003).
24. M. Jeffers, G. A. Taylor， K, M. Weidner, S. Omura， G. F. Vande Woude，
Mo/ Ce〃所o/17, 799 (Feb, 1997).
25. K. Ohashi &,淑她d 6， 327 (Mar， 2000).
26. M. Kong-Beltran, J. Stamos， D. Wickramasinghe, Qmcer Ce// 6， 75 (Jul, 2004).
27. T. J. Lynch d a/" iV￡"g/350， 2129 (May 20, 2004).
28. R. Sordella, D. W. Bell, D. A. Haber, J. Settleman, 5W認e 305, 1163 (Aug 20, 2004).
29. W. Pao "a/.，A^/^cat/5W C/S J 101, 13306 (Sep 7, 2004).
30. J. G. Paez a/., 6We膨304， 1497 (Jun 4， 2004).
31. E. Serra a/.， //画G麼f戰416 (May, 2001).
权利要求
1.预后方法，其包括确定来自受试者的肺癌样品是否在编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该突变在第N375、I638、V13、V923、I316和/或E168位处造成氨基酸变化。
2. 预后方法，其包括确定来自受试者的肺癌样品是否在编码人c-met的核 酸序列中包含突变，其中该序列在外显子14和/或其侧翼的内含子中有 突变，其中该突变影响外显子剪接。
3. 在样品中检测肺癌的方法，其包括确定样品是否在编码人c-met的核酸 序列中包含突变，其中该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/ 或E168位处造成氨基酸变化。
4. 在样品中检测肺癌的方法，其包括确定样品是否在编码人c-met的核酸 序列中包含突变，其中该突变在外显子14和/或其侧翼的内含子中，其 中该突变影响外显子剪接。
5. 区别非癌性的与癌性的肺组织的方法，所述方法包括确定样品是否包 含在编码人c-met的核酸序列中包含突变的肺组织，其中该突变在第 N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变化，其中 样品中检测到突变表明存在癌性的肺组织。
6. 区别非癌性的与癌性的肺组织的方法，所述方法包括确定样品是否包 含在编码人c-met的核酸序列中包含突变的肺组织，其中该突变在外显 子14和/或其侧翼的内含子中，其中该突变影响外显子剪接，其中样品 中检测到突变表明存在癌性的肺组织。
7. 鉴定肺癌中c-met突变的方法，所述方法包括将肺癌样品与能够;险测编 码人c-met的核酸序列中突变的试剂接触，其中该突变在第N3 75 、 163 8 、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变化。
8. 鉴定肺癌中c-met突变的方法，所述方法包括将肺癌样品与能够检测编 码人c-met的核S吏序列中突变的试剂接触，其中该突变在外显子14和/ 或其侧翼的内含子中，其中该突变影响外显子剪接。
9. 鉴定能用c-met抑制剂治疗的肺癌的方法，所述方法包括确定来自受试 者的肺癌样品是否在编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该突变 在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变化。
10. 鉴定能用c-met抑制剂治疗的肺癌的方法，所述方法包括确定来自受试 者的肺癌样品是否在编码人c-met的核S吏序列中包含突变，其中该序列 在外显子14和/或其侧翼的内含子中有突变，其中该突变影响外显子剪 接。
11. 确定受试者中的肺癌对用c-met抑制剂进行的治疗的响应性的方法，所 述方法包括确定来自用c-met抑制剂治疗的受试者的肺癌样品是否在 编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该突变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变化，其中缺少突变的核 酸序列表明肺癌对用c-met抑制剂进行的治疗是响应的。
12. 确定受试者中的肺癌对用c-met抑制剂进行的治疗的响应性的方法，所 述方法包括确定来自用c-met抑制剂治疗的受试者的肺癌样品是否在 编码人c-met的核S殳序列中包含突变，其中该序列在外显子14和/或其 侧翼的内含子中有突变，其中该突变影响外显子剪接，其中缺少突变 的核酸序列表明肺癌对用c-met抑制剂进行的治疗是响应的。
13. 监测用c-met抑制剂治疗肺癌的受试者中最小限度后遗症的方法，所述 方法包括确定来自用c-met抑制剂治疗的受试者的样品是否在编码人 c-met的核酸序列中包含突变，其中该突变在第N375、I638、V13、V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变化，其中检测到所述突变表明存在最 小限度遗留的肺癌。
14. 监测用c-met抑制剂治疗肺癌的受试者中最小限度后遗症的方法，所述 方法包括确定来自用c-met抑制剂治疗的受试者的肺癌样品是否在编 码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该序列在外显子14和/或其侧 翼的内含子中有突变，其中该突变影响外显子剪接，其中检测到所述 突变表明存在最小限度遗留的肺癌。
15. 扩增编码人c-met的核酸的方法，其中该核酸包含相对于野生型c-met 在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变化 的突变，所述方法包括用包含图7表S4中所列任何引物/探针序列的核 酸来扩增怀疑或已知包含该核酸的样品。
16. 扩增编码人c-met的核酸的方法，其中该核酸在外显子14和/或其侧翼 的内含子中包含突变，其中该突变影响外显子剪接，所述方法包括用 包含图7表S4中所列任何引物/探针序列的核酸来扩增怀疑或已知包含 该核酸的样品。
17. 在样品中鉴定c-met中特定突变的方法，其中该突变是相对于野生型 c-met在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸 变化的突变，所述方法包括将样品与包含图7表S4中所列任何引物/ 探针序列的核酸接触。
18. 在样品中鉴定c-met中特定突变的方法，其中该突变在外显子14和/或 其侧翼的内含子中，其中该突变影响外显子剪接，所述方法包括将样 品与包含图7表S4中所列任何S1物/探针序列的核酸接触。
19. 检测肺癌中存在突变的c-met的方法，该方法包括将怀疑或已知包含突 变的c-met的样品与包含图7表S4中所列任何引物/探针序列的核酸接 触。
20. 检测肺癌中存在突变的c-met的方法，该方法包括将怀疑或已知包含突 变的c-met的样品与抗原结合剂接触，其中所述样品与所述抗原结合剂 的结合或不结合表明存在或缺少包含至少一部分外显子14缺失的 c-met多肽。
21. 一企测肺组织中的癌症病情的方法，所述方法包括确定来自怀疑患肺癌 的受试者的样品是否在编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该突 变在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处造成氨基酸变 化，其中检测到所述突变表明在受试者的肺中存在癌症病情。
22. ^^测肺组织中的癌症病情的方法，所述方法包括确定来自怀疑患肺癌 的受试者的样品是否在编码人c-met的核酸序列中包含突变，其中该序 列在外显子14和/或其侧翼的内含子中有突变，其中该突变影响外显子 剪接，其中检测到所述突变表明存在最、限度遗留的肺癌。
23. 前述权利要求任一项的方法，其中突变影响外显子剪接，其中该突变 影响外显子剪接从而使产生的c-met蛋白缺少至少一部分外显子14。
24. 前述权利要求任一项的方法，其中突变影响外显子剪接，其中该突变 包括图6 (表S3)中所示突变。
25. 肺癌的生物标志物，其中该生物标志物包括在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处包含造成氨基酸变化的突变的c-met。
26. 肺癌的生物标志物，其中该生物标志物包括在外显子14和/或其侧翼的 内含子中包含突变的c-met，其中该突变影响外显子剪接。
27. 权利要求25或26的生物标志物，其中该生物标志物是核酸分子。
28. 权利要求25或26的生物标志物，其中该生物标志物是多肽。
29. 肺癌成像剂，其中该试剂特异性结合包含突变的c-met，其中该试剂结 合在蛋白质第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处包含突 变的c-met多肽，或其中该试剂结合在对应于第N375 、 163 8 、 V13 、 V923 、 1316和/或E168位处氨基酸变化的核酸位置处包含突变的c-met编码核 酸。
30. 肺癌成像剂，其中该试剂特异性结合包含至少一部分外显子14缺失的 c-met多肽，或其中该试剂特异性结合缺少至少一部分编码外显子14 的序列的c-met编码核酸。
31. 能够与c-met编码核酸特异性杂交的多核苷酸，所述c-met编码核酸在 对应于第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处氨基酸变化 的核酸位置处包含突变。
32. 能够与c-met编码核酸特异性杂交的多核苷酸，所述c-met编码核酸缺 少至少一部分编码外显子14的序列。
33. 能够特异性结合c-met多肽的抗原结合剂，所述c-met多肽在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处包含突变。
34. 能够特异性结合c-met多肽的抗原结合剂，所述c-met多肽包含至少一 部分外显子14缺失。
35. 阵列/基因芯片/基因集合，其包含能够与c-met编码核酸特异性杂交的 多核苷酸，所述c-met编码核酸在对应于第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处氨基酸变化的核酸位置处包含突变。
36. 阵歹'j/基因芯片/基因集合，其包含能够与c-met编码核酸特异性杂交的 多核香酸，所述c-met编码核酸缺少至少一部分编码外显子14的序列。
37. 计算才几可读耳又介质，其包括在第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或 E168位处包含突变的人c-met氨基酸多肽序列，和/或在对应于第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处氨基酸变化的核酸位置处包含 突变的编码人c-met多肽的核酸序列。
38. 计算机可读取介质，其包括包含至少一部分外显子14缺失的人c-met 氨基酸多肽序列，和/或缺少至少一部分编码外显子14的序列的人c-met 编码核酸。
39. 试剂盒，其包括本发明的组合物，及说明使用该组合物来检测人c-met 中第N375、 1638、 V13、 V923、 1316和/或E168位处突变的说明书。
40. 试剂盒，其包括本发明的组合物，及说明使用该组合物来检测包含外 显子14缺失的人c-met的说明书。
全文摘要
本发明提供了可用于检测肺癌细胞中c-met突变的方法和组合物。
文档编号C12Q1/68GK101180410SQ200680017935
公开日2008年5月14日 申请日期2006年3月24日 优先权日2005年3月25日
发明者罗伯特·L·尧克 申请人:健泰科生物技术公司