专利名称：酶分析方法
技术领域：
本发明是关于样品中含有的酶的分析方法。更详细来说，例如在测 定酶活性的方法中，使将测定对象酶底物结合于不溶性载体上形成的固 相底物与样品反应，检测被酶裂解的底物片段的量的酶分析方法。
背景技术：
目前，在临床诊断检查实践中，要求短时间且高精度地在"i午多试样 中测定出作为疾病诊断指标的活体成分，并将其结果迅速、准确地反馈 到治疗现场，可以根据这些结果有效选择适当的药剂、治疗方法；观察 治疗过程；预见疾病的复发。
作为诊断疾病的指标的生物材料(所谓的诊断标记物)涉及蛋白 质、核酸、酶、多糖类、脂类等很多方面，而且，要早期了解疾病，能 够测定极其微量浓度的生物材料的手段是很重要的。生物材料的大部分 是化学反应中的催化剂及其抑制活性物质，其代表是酶及其抑制剂。活 体内的酶反应是利用活性化物质和抑制其反应的抑制物质，进行控制、 调整，达到调节机能的目的。例如，在活体内的血液的凝固，纤维蛋白 溶解系统中，涉及到许多酶及其抑制剂，测定这些物质在临床方面很重 要。
尤其关于酶，利用不同目的的酶实施合成底物测定法和免疫测定 法。其中，在合成底物法中，由于目标酶的作用，能够通过检测出游离 出来的色素和荧光物质，检测出活性因子，并对其定量。
例如，凝血酶是关系到血液凝固的内切蛋白酶的一种，是作用于纤 维蛋白原，生成纤维蛋白的重要酶。作为其合成底物，公知的有Bz-Phe-Val-Arg-pNA(非专利文献1 ) 、 Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(专利文献1 )、 H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (专利文献2)等。因为酶反应后，对硝基苯胺 (pNA)游离出来能发出黄色，通过在405nm，把它进行比色，可以测 定凝血酶因子活性，可以用酶活性表示凝固溶解纤维蛋白的能力。
另外，组织因子(Tissue Factor:以下称作TF )也可以用显色性合 成底物[非专利文献2及非专利文献3]进行活性测定。
除了凝血酶和TF以外，在凝固溶解纤维蛋白的系统中，纤维蛋白
溶酶、抗凝血酶W ( ATW )、(冯)维勒布兰德病(血管性血友病)因 子裂解酶(别称ADAMTS13)、第X因子、第XI因子、第XH因子、蛋 白C、血浆血管舒緩素、组织血管舒緩素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、 尿激酶等活性因子，可以用合成底物进行活性测定。
这样，作为活体成分的微量测定方法，酶测定法，就可以利用酶底 物反应，从复杂成分的混合物中进行特别分选，无需如在普通的定量法 中的从样品中分离出必要的对象物质的前处理，而且，酶测定法具有高 灵敏度、高精确度定量的特征。另外，与使用放射性同位素的放射酶测 定法比较，以荧光或酶标记为特征的酶测定法既廉价又不产生危险的废 弃物，在测定的灵敏度精确度方面也不逊色，所以被广泛使用。
这样，许多活性因子(酶)，利用其底物的特异性，开发出多种分 析系统。另一方面，为了得到特异性更强的底物物质，还在进行着研究， 其中，由于由于开发出了合成底物，可以进行更准确的(底物特异性更 强)测定。但是，这些合成底物，基本上都是在与其结合的色素和荧光 色素游离之后，才显色产生荧光，而不是在任何条件下都能表达信号， 必须把特定物质与色素或荧光色素的特定部位相结合，所以开发新的合 成底物并不容易。
另外，对于在液相中进行的酶反应，在直接检测显色的时候，容易 受到样品液混浊和着色的影响。在检测荧光的时候，若样品中混有发荧 光的物质，则使检测结果受其影响也变得不准确。
专利文献h特开昭52-3492号公报
专利文献2:特开昭52-24590号公报
非专利文献1:"血栓形成研究(Thrombosis Research)，，(爱尔 兰)1972年，1巻，p.267-278
非专利文献2:"临床化学(Clinical Chemistry)"(美国)1989 年，35巻，p.1897
非专利文献3:"临床病理"，1995年，43巻,p.13
发明内容
发明要研究的课题
因此，本发明的课题是在采用底物的酶分析法中，提供易操作且灵
敏度高的酶分析法。
解决问题的手段
上述问题可以通过本发明，利用下述的酶分析方法解决，所述的酶 分析法的特征是包括以下步骤(1 )使可能含分析对象酶的被检验样 品和下述的固定化底物在液体中接触的步骤(以下称为接触步骤)，其 中，所述的固定化底物是将可被上述分析对象酶裂解的酶底物结合于不 溶性载体上的形成的；
(2) 分离上述液体和不溶性载体的步骤(以下称分离步骤)
(3) 分析不溶性载体上残存的底物或底物片段，和/或分析从不溶 性载体游离到液体中的底物片段的步骤(以下称分析步骤)。
按照本发明的分析方法的 一 个优选实施方案，所述的结合于不溶性 载体上的上述酶底物，在被分析对象酶裂解从而由不溶性载体游离出来 的底物片段一侧被标记物质作了标记。
另外，按照本发明分析方法的一个优选实施方案，用下述标记化伴
生物(卜于一)实施上述步骤(3)的分析，所述的标记化伴生物
是与所述的酶底物经上述分析对象酶裂解后所产生的新抗原特异结 合、并经标记物质标记化的伴生物。按照本发明的分析方法一个更优选 的实施方案，经标记的伴生物是标记抗体。在此，所谓"新抗原"是指 酶底物经对象酶裂解后所产生的、结合于不溶性载体的底物片段或游离 的底物片段的酶底物裂解部位。酶底物裂解部位包括肽序列和因被裂解 而变化的酶底物的立体构造。
根据本发明的分析方法的又 一优选实施方案，标记物质是荧光物 质、发光物质、显色物质或酶。
根据本发明的分析方法的更适宜的又一种状态，不溶性载体是颗粒。
根据本发明的分析方法的更适宜的又一种状态，颗粒是乳胶颗粒或
石兹4生颗粒。
另外，本发明是关于酶分析用的试剂盒，其特征是所述的分析用试 剂盒包含结合在不溶性载体上且能被分析对象酶裂解的酶底物的固定 化底物，而且所述的固定化底物是上述酶底物在经分析对象酶裂解后由 不溶性载体游离出来的底物片段一侧被标记物质作了标记的标记化固 定化底物。
进而，本发明还是涉及酶分析用的试剂盒，其包含下述的固定化底 物和标记化伴生物，所述的固定化底物是能被分析对象酶裂解的酶底物 结合于不溶性载体上所形成的固定化底物，所述的标记化伴生物是与上 述酶底物经分析对象酶裂解所产生的新抗原特异结合、并经标记物质作 了标记的标记化伴生物。
再者，在本说明书中的用语"分析"中包含判定有无分析对象物质 存在的"检测"和对于分析对象的量或活性进行定量或半定量的确定的 "测定"。
发明的效果
根据本发明，提供了测定酶剂量的酶测定法，其可应用于简便、迅 速且高灵敏度检测对象酶的方法。
为表示利用本发明的酶分析方法，测定血浆中凝血酶活性的
测定结果的图表。横轴是血浆稀释系列的稀释率；纵轴是发光量(单位
=记数)。为表示利用本发明的酶分析方法测定血浆中ADAMTS13活性 的测定结果的图表。横轴是血浆稀释系列的稀释率；纵轴是发光量(单 位=记数)。
具体实施方案
本发明的酶分析方法中至少要用到结合在不溶性载体上、能被分析 对象酶裂解的固定化底物。本发明的酶分析方法中，按照使用的标记物 质的标记方式，包含有，如
(1 )结合于不溶性载体上的酶底物由标记物质作了标记的方式(以 下有时称为非免疫分析法)
(2)使用下述标记化伴生物的方式，所述的标记化伴生物是与上 述酶底物经分析对象酶裂解所产生的新抗原特异结合、并经标记物质作 了标记的标记化伴生物(以下有时称为免疫分析法)。
利用本发明的酶分析方法可以分析的对象酶，只要是能在特异的部
位裂解底物的酶就可以，并没有特别的限定。可以举出，例如在临床诊 断中作为酶检查对象的各种酶，即在人类的各种疾病中上升或减少的 酶，或者与人类疾病无关的各种酶，或人类之外的各种动物的酶。
作为被检验样品，只要是可能含分析对象酶的样品即可，没有特别 的限定。例如生物学中的液体样品、尤其是血液、血清、血浆、尿或脑 脊髓液等。
本发明中使用的酶底物，只要是能用分析对象酶特异裂解的物质即 可，没有特别的限制，可以根据分析对象酶适当选择。上述酶底物可以 利用公知的方法制备，例如从人类和动物的体液中采集寄生生物的粗提
品或纯化品的方法；从人工养殖的生物中取得来自生物的粗提品或纯化 品的方法；利用基因重组技术和细胞培养技术生产核酸或蛋白质的方 法；或者利用化学合成技术合成多肽和半抗原的方法等。
例如使用合成底物的情况下，用作凝血酶的可以是含有Gly-Pro-Arg 的肽。用作第XII因子的例如可以是Gln-Gly-Arg;用作纤维蛋白溶酶的例 如可以是Glu-Lys-Lys;用作第X因子的例如可以是Ile-Glu-Gly-Arg;用 作组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂的例如可以是含Pyr-Gly-Arg的 肽；用作ADAMTS13的例如可以是血管性血友病因子(von Willebrand Factor; vWF )的第1596 ~第1668位的氨基酸组成的片段(Koichi Kokame, Masanori Matsumoto ， Yoshihiro Fujimura, and Toshiyuki Miyata， VWF73, a region from D1596 To R1668 of von Willebrand factor, provides a mimmal substrate for ADAMTS-13. Blood， Jan 2004; 103; 607-612 )。
作为本发明中使用的固定载体只要是能把酶底物固定的即可，任何 形态的不溶性载体都能利用，例如，可以利用能够物理性吸附底物的材 质(如聚苯乙烯制)构成的板、管、珠、片，或者具有起固定化底物作 用的适当的功能基的玻璃、磁性载体、乳胶颗粒或膜等。从把固定化底 物从反应系统分离时便于操作这一点考虑，优选使用颗粒，为了使上述 分离操作能用机器，优选使用不溶性磁性颗粒。
不溶性》兹性颗粒的粒径，通常使用0.05|am ~ 5pm的，优选有 0.3|_im~3|dm范围粒径的不溶性》兹性颗粒。作为物理的吸附方法，例如 把底物直接固定在不溶性磁性颗粒上的方法。作为化学的负载方法，例 如利用可以使磁性颗粒表面存在的氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、环
氧基等经化学修饰与底物结合的功能基，把底物直接固定在颗粒上的方 法和经化学键在颗粒和底物分子之间导入间隔分子，使底物固定的方 法。在此，可以把抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，用化学方式固定在 不溶性磁性颗粒上作为间隔分子，把生物素化底物结合在它上面，制备 固定化底物。进而，还可举出，使抗体或抗原在白蛋白等其它蛋白质上 化学结合后，把其蛋白质化学结合在颗粒上的方法。
一般，负载的底物
定，通常每lg载体颗粒负载lmg 500mg，优选负载10mg ~ 100mg。
本发明的免疫分析法中使用的伴生物质，只要是能与酶底物经分析 对象酶裂解后所产生的新抗原特异结合的物质即可，没有特别的限定， 例如在抗体或底物中附加了糖链的情况下，识别特定的糖链的刀豆球蛋
选在不溶性载体上残存的底物一侧产生的新抗原。使用抗体作为伴生物 质时，上述抗体可以根据分析对象酶适当选择，可以利用由底物或其片 段预先免疫人、鼠、兔、大白鼠、羊等动物得到的抗血清、亲和纯化的 多克隆抗体或单克隆抗体等。为了避免非特异性结合，优选使用单克隆抗体。
作为本发明中使用的标记物质，可以使用公知的各种标记物质，例 如荧光物质(例如铕)、发光物质(如虫荧光素)、显色物质[如对硝基 笨胺(pNA)],或者酶(如过氧化物酶)；从试剂的稳定性、灵敏度方 面考虑，优选酶。作为酶，例如过氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶 P-半乳糖苷酶、尿素酶、虫荧光素酶等。特别是利用以1, 2二氧环丁烷 (1, 2 - Dioxetane)为底物的碱性磷酸酶的活性测定法，因为显示出非常 强的信号，能得到较高的检测灵敏度，适用于微量成分的测定。
在本发明中，非免疫分析法是用标记物质，对在不溶性载体上固定 的酶底物(固定化底物)作标记；免疫分析法是用标记物质，对伴生物 质(特别是抗体)作标记。在对固定化底物作标记时，把标记物质结合 在与酶裂解的部位不同的部位，而且是因被分析对象酶裂解而从不溶性 载体游离出来的部位(例如固定化末端和相反的末端)。标记化底物(优 选酶标记底物)或标记化伴生物(优选酶标记伴生物质，特别是酶标记 抗体)的制备方法是公知的，可以选择任意的方法。例如可以在酶中导
入马来酰亚胺基，在底物或抗体中导入巯基，使两者反应，进行酶标记。 用来导入马来酰亚胺基的试剂，可以适当使用N-羟基辟u基琥珀酰亚胺基 酯等。另外，用来导入琉基的试剂，可以适当使用如S-乙酰基巯基琥珀
酸酐等。接着，把导入的马来酰亚胺基和巯基，在pH7以下，4。C条件 下，反应过夜，由此可以制成酶标记底物或酶标记抗体。
作为检测来自标记物质的信号强度变化的手段，根据标记物质的种 类及测定仪器的特性，适当选择，可以利用公知的方法，如比色法、荧 光法、或发光法等。例如使用过氧化酶作为标记物质时，也可以把鲁米 诺作为底物，用化学发光法检测，特别适用于微量测定(例如，田中弘 一郎、石川榮治用辣根过氧化酶作为标记的酶免疫测定法中荧光法和 发光法的比较、临床检查仪器'试剂、11: 567-569, 1988 )。另外，用 碱性磷酸酶作为标记物质时，使用AMPPD [3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基 -4-(3"-磷酰氧基)笨-1,2-二氧杂环丁烷(3- ( 2'-spiroadamantane ) -4-methoxy-4- ( 3"phosphoroxy ) phenyl-1 ，2-dioxetane ) ]、 1,2-二氧杂环丁 烷(CDP-Star;卜口匕° 7夕X公司制)]等公知的底物，可以使检测的灵 敏度更高，所以是优选的。
下面，就本发明的酶分析法，按各实施方案、具体的测定顺序，进 4亍更详细的"i兌明。
在作为本发明的酶分析方法的 一种方式的非免疫分析法中，包括但 并不限定于以下的步骤，例如使下述的固定化底物与含酶的试样反应一 定时间后，洗净固定化底物，使固定化底物上的被裂解的标记化底物片 段、试样，以及固定化底物相分离，其中，上述的固定化底物是针对目 标酶特异的底物的一端作了标记、在另一端固定于不溶性载体(例如不 溶性磁性颗粒)的固定化底物。接着，测定不溶性磁性颗粒上残存的、 未被裂解的底物的标记物质的量，由此分析试样中含有的酶活性。
本发明中的非免疫分析法包含的步骤，例如 (Al )使(a)有可能含分析对象酶的被检验样品与(b)下述的固 定化底物在液体中接触的步骤，所述的固定化底物是将能被分析对象酶 裂解的酶底物结合在不溶性载体上的固定化底物，而且所述的固定化底 物是上述酶底物在经分析对象酶裂解后由不溶性载体游离出来的底物 片段一侧被标记物质作了标记的标记化固定化底物。 (A2)分离上述液体和不溶性载体的步骤。
载体游离出来的液体中的底物片段。
上述步骤(Al )中采用的标记化固定化底物，是结合于不溶性载体 的，而且是用标记物质作了标记的酶底物。上述标记化固定化底物中的 酶底物部分，有分析对象酶特异裂解的部位，与上述裂解部位不同的、 并且由被分析对象酶裂解而从不溶性载体游离出来的部位(例如与固定 化末端相反的末端)由标记物质作了标记。因此在步骤(Al)中，含有 分析对象酶的被检验样品和标记化固定化底物接触时，由于分析对象酶 在标记化固定化底物特异裂解部位把底物裂解，底物片段内，标记化底 物片段从不溶性载体游离出来，另一方面，未被分析对象酶裂解的固定 化底物残存在不溶性载体上。本步骤中上述接触时间，只要是能够使被 检验样品中可能含有的分析对象酶与固定化底物进行反应即可，没有特
别的限定，可以根据反应条件(例如试剂及试样的使用量、温度、pH 等)适当确定，通常为3分钟-24小时，优选15分钟 1小时。
在上述步骤(A2)中，把实施上述步骤(Al)后的不溶性载体和 除此之外的组分(即，包含游离底物片段及被检验样品的液体部分)分 离。上述分离操作可以按常法实施，例如当用磁性颗粒作为不溶性载体 时，例如可以使用磁石或者离心分离；当用乳胶颗粒作为不溶性载体 时，可以通过离心操作或过滤进行分离。在下面的步骤(A3)中，分析 不溶性载体含有的标记物质时，最好在上述分离后，洗涤不溶性载体， 再充分除去游离底物片段。
在上述步骤(A3)中可以对不溶性载体中残存的底物片段，或者从 不溶性载体中游离出来的液体中的底物片段的任意一方进行分析，也可
以只于其双方进4亍分析。
在分析从不溶性载体中游离出来的、液体中的底物片段时，通过测 定游离底物片段中含有的标记物质的量，可以确定游离底物片段的量， 进而，例如通过制作校正曲线，可以确定被检验样品中含有的分析对象 酶的剂量或活性。被检验样品中含有分析对象酶时，相应于所述酶的剂 量或活性，游离底物片段的量会相应增加。
另一方面，在分析不溶性载体中未被裂解而残存的固定化底物时， 通过测定残存的标记物质的量，可以确定残存标记底物(即固定化标记 底物)的量，进而，例如通过制作校正曲线，可以确定被4全验样品中含
有的分析对象酶的剂量或活性。被检验样品中含有分析对象酶时，相应 于所述酶的剂量或活性，固定化标记底物的量会相应减少。
作为本发明的酶分析方法的另 一种方式的免疫分析法，包括但并不 限定于以下的步骤，例如，固定化底物和试样反应一定时间后，添加与 裂解的片段特异结合的标记化抗体，使其反应一定时间，洗净后，通过 测定结合于固定化底物的标记化抗体量，可以分析试样中含有的酶的活性。
本发明中的免疫分析法，使用上述酶底物与被上述分析对象酶裂解 后生成的新抗原特异结合，而且用标记物质作了标记的标记化伴生物， 实施分析步骤。下面，以新抗原为在不溶性载体上残存的底物片段一方 所产生的新抗原的情形为主，说明本发明的免疫分析法。但本领域技术 人员可以理解，其也适用于针对新抗原为产生在游离的底物片段一方的 情况。向反应系统内添加标记化伴生物的时机，比如可以是接触步骤、 分离步骤、或分析步骤的任意期间。
例如，在^l妄触步骤中添加标记化伴生物时，可以在^皮^r-险4f品与固 定化底物接触之前(即被检验样品或固定化底物的任意一方和标记化伴 生物接触后，被检验样品或固定化底物的另一方再与之接触)；与接触 时(即让被检验样品、固定化底物及标记化伴生物三者同时接触)；或 者接触后(即让被检验样品和固定化底物接触后，进一步再接触标记化 伴生物)添加。由于标记化伴生物与经由分析对象酶裂解酶底物所产生 的新抗原特异结合，而不与酶裂解前的固定化底物结合，所以接触步骤 中的酶反应与标记化伴生物是否存在无关。在接触步骤中添加标记化伴 生物时，若被检验样品中含有分析对象酶，而且固定化底物被上述酶裂 解，则形成底物片段(固定化底物片段或游离底物片段)与标记化伴生 物(优选标记化抗体)的复合体(优选免疫复合体)。
在分离步骤中添加标记化伴生物时，可以在分离操作之前，或在分 离操作之后添加。比如在分离操作之后添加标记化伴生物时，若标记化 伴生物是识别残存在不溶性载体的底物片段一方所形成的新抗原的伴 生物的情况下，添加到由分离操作得到的不溶性载体后，可以经过洗涤 不溶性载体，除去未反应的标记化伴生物。
在分析步骤中添加标记化伴生物时，例如在上述分离步骤中得到的 不溶性载体中添加标记化伴生物后，可以把不溶性载体洗净，除去未反
应的标记化伴生物，实施标记物质的分析。
从可以省略分离反应过的标记化伴生物和未反应的标记化伴生物 的操作这一点考虑，优选在接触步骤中或分离步骤的分离操作之前，添 加标记化伴生物。
在免疫分析法中的分析步骤中，比如标记化伴生物是识别不溶性载 体中残存的底物片4殳 一 方所形成的新抗原的伴生物的情况下，通过分析 与不溶性载体上残存的底物片段特异结合的标记化伴生物可以确定被 检验样品中含有的分析对象酶的剂量或活性。也就是说，可以通过测定 特异结合于不溶性载体上残存的底物片段的标记化伴生物的标记物质 的量，确定固定化底物片段的量，比如，再进一步通过制作校正曲线， 确定被检验样品中含有的分析对象酶的剂量或活性。在被检验样品中含 有分析对象酶的情况下，相应于酶的剂量或活性，固定化底物片段的量 会相应增加，特异结合于底物片段的标记化伴生物的量也会增加。
本发明的酶分析用试剂盒，至少包含结合在不溶性载体上、可以被 分析对象酶裂解的酶底物的固定化底物。本发明的酶分析用的试剂盒 中，包括适用于本发明的非免疫分析法的试剂盒(以下称非免疫分析用 试剂盒)和适用于本发明的免疫分析法的试剂盒(以下称免疫分析用试 剂盒)。
在本发明的非免疫分析用试剂盒中，至少包含结合在不溶性载体上 的、可以被分析对象酶裂解的酶底物的固定化底物，而且，所述的固定 化底物是上述酶底物在经分析对象酶裂解后由不溶性载体游离出来的 底物片^殳一侧被标记物质作了标记的标记化固定化底物。
在本发明的免疫分析用试剂盒中，至少包含下述的固定化底物和标 记化伴生物，所述的固定化底物是能被分析对象酶裂解的酶底物结合于 不溶性载体上所形成的固定化底物，所述的标记化伴生物是与上述酶底 物经分析对象酶裂解所产生的新抗原特异结合、并经标记物质作了标记 的标记化伴生物。
本发明的酶分析用试剂盒，根据标记物质及检测系统等，还可以进 一步含有，如酶底物、洗涤液、试样稀释液和/或反应扩增剂。比如，可 以在第 一试剂中含有固定化底物，在第二试剂中含有能发现底物中被标 记的物质信号的物质。作为非免疫分析用试剂盒，具体例如由
第 一试剂固定化底物溶液(石成性磷酸酶标记)
第二试剂化学发光用底物(如AMPPD) 构成的试剂结构，或者作为免疫分析用药剂，例如由 第 一试剂固定化底物溶液
第二试剂特异识别裂解片段的标记化抗体(碱性磷酸酶标记) 第三试剂化学发光用底物(如AMPPD)
构成的试剂结构，根据检测系统，适当变更标记物质的组成，可以 构成各种结构。
下面说明使用这些分析用试剂盒的具体测定方法的例子。首先，使 认为含有待测定的酶的样品，与含有被上述酶裂解的部位，与负载了经
酶标记过的底物的不溶性磁性颗粒构成的第1试剂一起，在反应容器的 液体溶剂中进行反应。或者，使认为含有待测定的酶的样品溶液和上述
第1试剂、以及针对待测定的不溶性磁性颗粒上的底物裂解部位的、酶 标记抗体构成的第2试剂，在反应容器的液体溶剂中进行反应。在向反 应容器的液体溶剂中加入第1试剂、第2试剂时，同时加也可以，分别 加也可以。另外，关于加入的顺序，先从哪种试剂开始加都可以。
添加各种试剂后需要充分进行混合，也可以在混合均匀之后，停止 混合经过放置后再反应。反应和普通的免疫化学反应同样，通常在pH5 ~ IO的条件下进行，优选在pH6~7的条件下进行。关于温度，通常在2~ 5CTC的范围能够实施，但优选在室温或37 45。C条件下反应。反应时间 是从刚一反应到1昼夜的任意时间。但考虑到灵敏度和便于操作，通常 设定在3~60分钟的范围。
通常使用緩冲液来维持目的pH 。比如用 MES ( 2-Morpholmoetha腿lphonic Acid)、磷酸等作为緩冲液，可以使用从弱酸 性到中性，常用的大部分緩冲液。许多情况下，为了避免非特异反应， 而添加氯化钠等盐类及牛血清白蛋白等蛋白质。
与反应液相对应的不溶性磁性颗粒通常为0.0001 - 1重量％，优选 使用0.001-0.1重量％;与反应液相对应的酶标记抗体通常为0.00001 ~ O.lmAbs,优选使用0.0001 ~ O.OlmAbs。
实施例
下面，根据实施例具体说明本发明，但本发明的范围，不受这些限制。
《实施例1:凝血酶活性的测定》 (1 )底物的标记化
C末端生物素标记肽底物的合成肽底物(N-Gly-Pro-Arg-生物素)是 按照用1,2-二氨基乙烷三笨甲基树脂和用N-a-叔丁氧羰基甘氨酸作为 肽的N-末端氨基酸残基的Fmoc化学法，使用肽自动合成仪合成的。从 树脂除去肽的C末端氨基酸后，用5- (N-琥珀酰亚氨基氧基羰基)戊烷 基D-生物素酰胺，通过1,2-二氨基乙烷作了生物素标记。生物素标记肽 的侧链的全部保护基，通过与三氟乙酸反应除去。用市场出售的碱性磷 酸酶标记试剂盒(同仁产品代码LK12)，把得到的N-Gly-Pro-Arg-生 物素，作了 N末端氨基的碱性磷酸酶标记。 (2)底物在磁性颗粒上的结合
使抗生蛋白链菌素标记磁性颗粒(夕、、4大/UA4才亍7夕公司制、 粒径2.8nm)的1%悬浮液和前项(1)中制备的标记底物(0.5mg/mL) 在5Ommol/LMES緩冲液(pH6 )中反应1小时，用前述緩沖液洗涤后， 进行用0.3。/。牛白蛋白/0.1mol/LTns緩沖液(pH8 )的封闭，制备了结合 标记底物的磁性颗粒。
(3 )血浆中的凝血酶测定
利用小型自动免疫测定装置(PATHFAST;三菱化学Iatron公司制) 进行了测定。具体而言是使60fiL已知含量的凝血酶(0.1IU/mL)的血 浆稀释系列和lOO(aL结合标记底物的磁性颗粒的悬浮液在37。C条件下 反应5分钟，用0.1mol/LTris緩冲液(pH8 ) /0.15mol/L NaCl/0.1。/。曲才立 通(Triton) X-100,洗涤磁性颗粒后，混合100pL作为化学发光底物溶 液的CDP-Star(卜口匕° 夕只公司)溶液，在37。C条件下反应4分钟后， 计算发光量。把血浆换成生理盐水，作为空白试验，进行了同样的操作。 结果如图1所示。
如图表所示，得知由于凝血酶的浓度越高，固定化底物越易被分 解，标记了酶的部位(底物片段)游离出来，颗粒上残存的底物量减少， 发光读数随浓度而减少。用凝血酶已知浓度(或活性)的血浆或标准试 剂，制作的校正曲线可对样品中的凝血酶浓度(或活性)定量。 《实施例2: ADAMTS13活性的测定》 (1 )底物的制备
把vWF的部分片段(第1596 ~第1668位的氨基酸构成的片段。以
下称为vWF73)，作为ADAMTS13[别称血管性血友病因子(vWF) 裂解蛋白酶(von Willebrand Factor cleaving protease )]的底物,4耍Koichi Kokame, Masanori Matsumoto , Yoshihiro Fujimura ， and Toshiyuki Miyata, vWF73， a region from Dl 596 to Rl 668 of von Willebrand Factor, provides a minimal substrate for ADAMTS13, Blood, Jan 2004; 103: 607-612中记载的方法制备。
(2)底物在磁性颗粒上的结合 使粒径2.4fim的^兹性乳胶(JSR制)的1%溶液和(1 )中制备的vWF73 (50(Vg)在50mmol/L MES緩冲液(pH6 )中，在室温下反应1小时， 用前述緩沖液洗涤后，进行用0.3。/。牛白蛋白/0.1mol/LTris緩冲液(pH8) 的封闭，制备了结合底物的磁性颗粒。
(3 ) vWF单克隆抗体的碱性磷酸酶标记 4安照Cruz MA， Whitelock J， Dong JF.Evaluation of ADAMTS-13 activity in plasma using recombinant von Willebrand Factor A2 domain polypeptide as substrate。 Thromb Haemost. 2003; 90 ( 6 ) : 1204-9的^己 载，制成了特异识别vWF73的ADAMTS13裂解部位的单克隆抗体。利 用蛋白质G柱，由抗血清纯化IgG，再在O.lmol/L乙酸钠(pH3.9)溶 液中，于37t:条件下用4%胃蛋白酶消化过夜，制备F(ab')2。再添加 2-巯基乙胺溶液，在37。C条件下进行90分钟反应后，用UltrogelAcA44 柱分离Fab，。在50mmol/L硼酸钠緩冲液(pH7.6) 、 lmmol/L氯化镁及 0.1mmol/L氯化锌緩沖液中对碱性磷酸酶进行透析。在该透析液中添加 N-( 6-马来酰亚胺caproyloxy ) 丁二酰亚胺，在30。C条件下培养30分钟。 用交联葡聚糖G-25柱进行凝胶过滤后，浓缩，制备加入马来酰亚胺的 碱性磷酸酶。把加入马来酰亚胺的碱性磷酸酶10nmol/0.1mol/L Tris緩冲 液(pH7 )(包含1mmol/L氯化镁、0.1mmol/L氯化锌)和 Fab'50nmo1/0. lmol/L磷酸钠緩沖液(pH6 )(包含5mmol/L EDTA )混 合，在4。C条件下培养20小时。添加10 mmol/L 2-巯基乙胺溶液，在 UltrogelAcA44柱，用0.1mol/L Tris缓沖液(pH6.8 )(包含0.1mmol/L 氯化钠、lmmol/L氯化镁、0.1mmol/L氯化锌)进行凝胶过滤，得到酶 标记Fab，。
(4 ) ADAMTS13活性的测定
用小型自动免疫测定装置(PATHFAST;三菱化学Iatron公司制) 进行测定。具体是，使60pL健康人的血浆稀释系列与(2 )中制备的100pL 结合底物的磁性颗粒的悬浮液，在37。C条件下反应5分钟，再添加(3) 中制备的^5成性磷酸酶标记抗体vWF单克隆抗体lmAbs，在37。C条件下 反应4分钟。用0.1mol/LTns緩沖液(pH8 ) /0.15mol/L NaC1/0.1%曲拉 通(Triton) X-]00，把石兹性颗粒洗净后，混合lOOfiL,作为化学发光底 物溶液的CDP-Star (卜口匕。？夕7公司制)溶液，在37。C条件下反应2 分钟，计算发光量。把血浆换成生理盐水，进行同样的操作，作为空白 试验。结果如图2所示。
产业上的可利用性
本发明的酶分析方法，比如可以应用于临床i貪断4全查方面。以上4安 照特定的方式说明了本发明，但是本领域技术人员能力所及范围内的变 换和改良也包括在本发明的范围内。
序列表文本
下面序列表的数字标题〈223 〉中记载了 "人工序列"的描述。序 列号1的序列中表示的氨基酸序列是合成底物。
权利要求
1.一种酶分析方法，其特征在于所述的酶分析方法包含以下分析步骤(1)使可能含分析对象酶的被检验样品和下述的固定化底物在液体中接触的步骤，其中，所述的固定化底物是将可被上述分析对象酶裂解的酶底物结合于不溶性载体上的形成的；(2)分离上述液体和不溶性载体的步骤；(3)分析不溶性载体上残存的底物或底物片段，和/或分析从不溶性载体游离到液体中的底物片段的步骤。
2. 根据权利要求1所述的酶分析方法，其中，所述的结合于不溶 性载体上的上述酶底物，在被分析对象酶裂解从而由不溶性载体游离出 来的底物片段一侧被标记物质作了标记。
3. 根据权利要求1所述的酶分析方法，其中，用下述标记化伴生 物实施上述步骤(3)的分析，所述的标记化伴生物是与所述的酶底物 经上述分析对象酶裂解后所产生的新抗原特异结合、并经标记物质标记 化的伴生物。
4. 根据权利要求3所述的酶分析方法，其中，所述的标记化伴生物是标记化抗体。
5. 根据权利要求2 4的任一项所述的酶分析方法，其中，所述的标记物质是荧光物质、发光物质、显色物质或酶。
6. 根据权利要求1 ~ 5的任一项所述的酶分析方法，其中，所述的 不溶性载体是颗粒。
7. 根据权利要求6所述的酶分析方法，其中，所述的颗粒是乳胶 颗粒或》兹性颗粒。
8. —种酶分析用试剂盒，其特征在于所述的酶分析用试剂盒包 含结合在不溶性载体上且能被分析对象酶裂解的酶底物的固定化底 物，而且所述的固定化底物是上述酶底物在经分析对象酶裂解后，由不 溶性载体游离出来的底物片段一侧被标记物质作了标记的标记化固定 化底物。
9. 一种酶分析用试剂盒，其特征在于其包含下述的固定化底物 和标记化伴生物，所述的固定化底物是能被分析对象酶裂解的酶底物结 合于不溶性载体上所形成的固定化底物，所述的标记化伴生物是与上述酶底物经分析对象酶裂解所产生的新抗原特异结合、并经标记物质作了 标记的标记化伴生物。
全文摘要
本发明公开了一种酶分析方法和酶分析用试剂盒。酶分析方法包含以下步骤(1)使可能含分析对象酶的被检验样品和下述的固定化底物在液体中接触的步骤，其中，所述的固定化底物是将可被上述分析对象酶裂解的酶底物结合于不溶性载体上的形成的；(2)分离上述液体和不溶性载体的步骤；(3)分析不溶性载体上残存的底物或底物片段，和/或分析从不溶性载体游离到液体中的底物片段的步骤。酶分析用试剂盒，其至少包含将能被分析对象酶裂解的酶底物结合在不溶性载体上的固定化底物。
文档编号C12Q1/37GK101180405SQ20068001746
公开日2008年5月14日 申请日期2006年5月19日 优先权日2005年5月20日
发明者小仓实, 小野智子 申请人:株式会社三菱化学药得论