测定植酸酶活性的方法

专利名称：测定植酸酶活性的方法
专利说明测定植酸酶活性的方法 本发明涉及分析植酸酶活性的方法，涉及在此方法中一类芳香磷酸酯/盐化合物的应用，涉及实施此方法的试剂盒，并涉及可用于此方法的全新化合物和组合物。
植酸酯是谷类和豆类中磷的重要储存形式。然而，单胃动物，如猪、家禽和鱼不能代谢或吸收植酸酯(或植酸)，因此将其排泄出来导致高密度家畜生产区域的磷污染。而且，植酸也通过与如钙、铜和锌等金属螯合成为单胃动物体内的抗营养剂。
为这些动物的生长和健康提供足够的磷而在其饲料中添加了无机磷酸盐。如此添加成本高，并且进一步增加了污染问题。
植酸酯被植酸酶转化，该酶通常催化植酸酯水解为低肌醇-磷酸酯和无机磷酸盐。植酸酶可用作动物饲养的添加剂来提高有机磷对动物的可用性并降低对环境的磷污染(Wodzinski R.J.，Ullah A.H.，Adv Appl Microbiol.42，263-302(1996))。
文献中已对真菌中的一些植酸酶(Wyss M.et al.Appl.Environ.Microbiol.65(2)，367-373(1999)；Berka R.M.et al.Appl.Environ.Microbiol.64(11)，4423-4427(1998)；Lassen S.et al.Appl.Environ.Microbiol.67(10)，4701-4707(2001))和细菌中的一些植酸酶(Greiner R.et al Arch.Biochem.Biophys.303(1)，107-113(1993)；Kerovuo et al.Appl.Environ.Microbiol.64(6)，2079-2085(1998)；Kim H.W.et al.Biotechnol.Lett.25，1231-1234(2003)；Greiner R.et al.Arch.Biochem.Biophys.341(2)，201-206(1997)；Yoon S.J.et al.Enzyme andmicrobial technol.18，449-454(1996)；Zinin N.V.et al.FEMS Microbiol.Lett.236，283-290(2004)))进行了描述。
已知的在溶液中分析植酸酶的方法是基于对酶-催化水解反应中，从植酸释放的正磷酸盐的检测。磷酸盐通常在硫酸中与钼酸盐反应后，通过分光光度检测(例如Heinonen J.K.，Lahti R.J.Anal.Biochem.113，313-317(1981))。此方法灵敏但需要使用腐蚀性试剂(硫酸)和易燃试剂(丙酮)，也不适用于分析粗植酸酶制品或含游离无机磷酸盐的天然样品中的植酸酶活性。而且，基于磷钼酸盐的方法不能用于检测生长在固体培养基上的活微生物菌落的植酸酶活性。
这样的“板上”分析对分离和开发产植酸酶的微生物菌株特别有用。现有技术中已有大量开发用于检测植酸酶活性的“板上”技术的尝试。基于溶解不溶性植酸盐的方法(Shieh TR and Ware JH.Appl.Microbiol.16(9)1348-1351(1968)；Bae HD et al.J.Microbiol.Methods.39，17-22(1999))不但不灵敏而且受限于微生物生长期间培养基酸化产生的假阳性信号。基于刺激其中植酸为唯一磷源的营养板上的磷酸依赖性、无植酸酶的报告基因细菌的生长的方法(Chen JC.Biotechnology techniques 12(10)759-761(1998))缓慢并且分辨率一贯不佳，原因是检测细菌生长需要长期培养使得磷酸酯扩散。
相反，在含有过量无机磷酸盐和/或在固体微生物营养基表面上检测磷酸酶活性是简单而高效的。基于显色磷酸酶底物，如α-萘基磷酸酯、对硝基苯基磷酸酯和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸酯的方法是本领域已知的，并且这些底物均可购得(例如，购自Sigma-Aldrich)。然而，这些底物与植酸酶的作用均不令人满意。
仍未解决的问题是提供可用于检测活微生物菌落和粗植酸酶制品的植酸酶活性的分析方法。
另一个仍未解决的问题是提供可用于检测植酸酶活性的分析方法，其不使用腐蚀性试剂和/或易燃试剂。
本发明致力于/减少现有技术中的这些问题。
根据第一方面，本发明提供了检测样品中植酸酶活性的方法，其包括 i)将所述样品与植酸酶底物结合，以及 ii)测量所述植酸酶底物的有机代谢物的水平。
根据第二方面，本发明提供了检测样品中植酸酶活性的试剂盒，其包括植酸酶底物和显示试剂。
根据第三方面，本发明提供了包括芳香基团和多个磷酸酯/盐基团的化合物作为植酸酶底物的应用。
根据第四方面，本发明提供了包括芳香基团和多个磷酸酯/盐基团的化合物在检测酶活性方法中的应用。
根据第五方面，本发明提供了如下所述的分子式(I)的化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H、C1-12烷基、C1-12烷氧基、SO3H、OSO3H、NO2、NH2、NH(C1-12烷基)、N(C1-12烷基)2、OPO3H2、CO2H、CN、C1-12卤代烷基、或者R1、R2、R3、R4、R5和R6中的任何一对或多对与其连接的碳原子一起形成饱和、不饱和或芳香的C3-12碳环或杂环； 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少两个是OPO3H2或其盐形式。
根据第六方面，提供了包括植酸酶底物和显示试剂的组合物。
为引用的简便，本发明这些和其他方面通过合适的章节标题来讨论。然而，在每一章节内所教导的内容不必限制在该具体章节内。
植酸酶活性 在此使用的术语“植酸酶活性”是指样品催化植酸酯(肌醇六磷酸酯)分解产生无机磷(例如正磷酸盐)的能力。在此使用的术语植酸酶包括根据国际生物化学和分子生物学联盟的命名委员会分类的3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、4-植酸酶(也指6-植酸酶，E.C.3.1.3.26)或5-植酸酶(E.C.3.1.3.72)。优选的植酸酶是3-植酸酶(E.C.3.1.3.8)、4-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或5-植酸酶(E.C.3.1.3.72)。
在广泛的意义下，因为其催化了磷酸酯键的裂解，所以植酸酶代表了磷酸酶的一种亚型。然而，在此使用的术语“磷酸酶”是指能够裂解磷酸酯键的酶，其对除植酸外的底物具有选择性。然而，技术人员能认识到植酸酶具有一定程度的磷酸酶活性；反过来，磷酸酶具有一定程度的植酸酶活性。
样品 在此使用的术语“样品”是指用于确定植酸酶活性存在与否的物质。这样的样品的实例包括发酵肉汤的提取物、纯化的酶制品、微生物培养物(包括在板上和在溶液中)等。
植酸酶底物 在此使用的术语“植酸酶底物”是指能够被植酸酶催化的反应所转化从而产生代谢物的化合物。
优选地，植酸酶底物不是植酸酯/盐。
优选地，植酸酶底物能够被植酸酶催化的反应所转化从而产生如下描述的有机代谢物。
优选地，植酸酶底物包括芳香基团。
在此使用的“芳香基团”是指具有单环(例如苯基)或多个缩合(稠合)环(例如萘基或蒽基)的不饱和芳香碳环或杂环基团，其具有5至14个碳原子，优选6至14个碳原子。优选的芳基基团包括苯基、萘基等。在此使用的“杂芳基”是指单环或双环的芳香基团，其具有1至6个碳原子并在至少一个环(如果多于一个环的话)内具有1至4个选自氧、氮和硫的杂原子。
这样的杂芳基基团可具有单环，例如吡啶基、吡咯基或呋喃基，或者多个稠环，例如吲哚基、吲哚嗪基(indolizinyl)、苯并呋喃基或苯并噻嗯基。优选的杂芳基包括吡啶基、吡咯基和呋喃基。
优选地，芳香基团是碳环芳香基团。更优选地，芳香基团是苯基或萘基。最优选地，芳香基团是苯基。
优选地，植酸酶底物包括含一个或多个含磷基团。合适的含磷基团是磷酸酯/盐、亚磷酸酯/盐、硫代磷酸酯/盐、膦酸酯及其盐形式、其卤代物和烷基衍生物。优选的含磷基团是磷酸酯-OPO3H2及其盐形式。合适的盐形式包括碱金属盐、碱土金属盐和铵盐。
优选地，植酸酶底物包括多个含磷基团。更优选地，植酸酶底物包括至少3个含磷基团。更优选地，植酸酶底物包括至少4个含磷基团。更优选地，植酸酶底物包括至少5个含磷基团。更优选地，植酸酶底物包括至少6个含磷基团。更优选地，植酸酶底物包括6个含磷基团。
在替代的优选具体实施方式
中，植酸酶底物包括2个或3个含磷基团。更优选地，植酸酶底物包括3个含磷基团。
在优选具体实施方式
中，植酸酶底物包括芳香基团和多个磷酸酯/盐基团。
在特别优选的具体实施方式
中，植酸酶底物具有分子式(I)
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H、C1-12烷基、C1-12环烷基、C1-12烷氧基、SO3H、OSO3H、NO2、NH2、NH(C1-12烷基)、N(C1-12烷基)2、OPO3H2、CO2H、CN、C1-12卤代烷基、或者R1、R2、R3、R4、R5和R6中的任何一对或多对与其连接的碳原子一起形成饱和、不饱和或芳香的C3-12碳环或杂环； 其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少2个是OPO3H2或其盐形式。
在此使用的烷基是指脂肪烃链并且包括例如1至6个碳原子的直链和支链，如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、n-戊基、异戊基、新戊基、n-己基和异己基。
卤素、卤代物或卤代是指碘、溴、氯、和氟。
在此使用的卤代烷基是指如上所述烷基的至少一个氢原子被一个卤素原子取代，并且包括全卤代烷基(即，所有碳原子被卤素原子取代的烷基)。优选的卤代烷基是三氟甲基和三氯甲基。
在此使用的杂环是指包括1至5个独立选自N、S、O和P的杂原子的环结构。
除非对本文中的芳基、杂芳基、碳环、杂环或环烷基另有限定性说明，否则这些基团可任意地被1至5个独立地选自如下构成的组中的取代基所取代羟基、具有1至6个碳的酰氧基、具有1至6个碳的酰基、具有1至6个碳的烷基、具有1至6个碳的烷氧基、具有2至6个碳的烯基、具有2至6个碳的炔基、具有1至6个碳的取代烷基、具有1至6个碳的取代烷氧基、具有1至6个碳的烯基、具有1至6个碳的取代炔基、氨基、被1个或2个具有1至6个碳的烷基取代的氨基、具有1至6个碳的氨酰基、具有1至6个碳的酰胺基、叠氮基、氰基、卤素、硝基、具有1至6个碳的硫代烷氧基、具有1至6个碳的取代的硫代烷氧基、和三卤代甲基。
在上述烷基、烯基、炔基、硫代烷氧基和烷氧基上的取代基包括卤素、CN、OH和氨基。芳基上优选的取代基包括具有1至6个碳的烷基、具有1至6个碳的的烷氧基、卤素、氰基、硝基、三卤代甲基和具有1至6个碳的硫代烷氧基。
优选地，植酸酶底物不含游离芳香OH基团(一个OH基团直接连接到芳香基团上)。更优选地，植酸酶底物不含选自OH、NH2、SH或烷氧基的芳香取代基团。更优选地，植酸酶底物不含具有电子供体特性的芳香取代基团。更优选地，植酸酶底物不含具有电子供体特性的取代基团。
优选地，R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H和OPO3H2，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少两个是OPO3H2或其盐形式。
优选地，底物选自间苯三酚三磷酸酯、苯六酚六磷酸酯和苯五酚五磷酸酯或其盐形式。更优选地，底物是间苯三酚三磷酸酯。
有机代谢物 在此使用的术语“有机代谢物”是指包括至少一个碳原子的上述植酸酶底物的植酸酶催化反应的产物。在某些例子中，有多于一个有机代谢物。
有机代谢物优选地包括游离羟基(OH)基团。有机代谢物更优选地包括游离芳香OH基团(OH基团直接连接到芳香基团上)。更优选地，有机代谢物包括游离酚羟基(OH基团直接连接到苯环上)。
特别优选地，植酸酶底物不含游离芳香OH基团，并且有机代谢物不含游离芳香OH基团。
在优选具体实施方式
中，芳基磷酸酯(II)是植酸酶底物。其可被植酸酶催化的反应所转化，从而产生相应的具有游离芳香OH的有机代谢物(III)。这描绘在方案1中。

方案1 其中“Ar”代表上述的芳香基团。
当植酸酶底物是间苯三酚三磷酸酯时，有机代谢物是间苯三酚二磷酸酯。当植酸酶底物是苯五酚五磷酸酯时，有机代谢物是苯五酚四磷酸酯。当植酸酶底物是苯六酚六磷酸酯时，有机代谢物是苯六酚五磷酸酯。
测量 有机代谢物的水平可通过任何合适的方法确定。这些对本领域技术人员都是显而易见的。
在此使用的术语“测量水平”包括检测有机代谢物存在与否，例如通过观察颜色变化。
合适测量技术包括 色谱技术，例如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、薄层色谱(TLC)； 光谱技术，例如红外光谱、紫外光谱、核磁共振谱(NMR)、荧光光谱、分光光度法，光度测定，吸收光谱和比色法； 显示技术，例如检测颜色改变或析出； 其他技术，例如重量测量。
在一个特别高度优选的方法中，测量步骤包括使如上所述的有机代谢物发生反应产生有色产物。
在此使用的“有色产物”是指吸收400至800纳米范围内电磁辐射的产物。其包括多于一个组分。
有机代谢物以此方式转化为有色产物具有特别的优点，因为其可以通过视觉、比色、照相、光度或分光光度确定植酸酶活性的存在和水平。
显示试剂 在此使用的术语“显示试剂”是指能够与上述有机代谢物反应从而产生如上所述的有色产物的任何试剂或试剂组合物。
优选地，显示试剂能够与有机代谢物反应从而产生有色产物并且与植酸酶底物不发生化学反应；即是说，在正常条件下其仅与代谢物发生反应。
优选地，显示试剂与含游离OH基团的化合物反应从而产生有色产物。更优选地，显示试剂与含游离芳香OH基团的化合物反应从而产生有色产物。最优选地，显示试剂与酚化合物反应从而产生有色产物。
在特别优选的具体实施方式
中，显示试剂能够参与和酚化合物的亲电取代反应。更优选地，该试剂包括重氮盐(包含-N≡N+基团的化合物)。更加优选地，显示试剂包括选自色盐(Fast Salts)组的重氮盐，包括固紫盐(FastViolet salt，特别是固紫B)、固黑盐(特别是固黑K)、固蓝盐(特别是固蓝B)。更加优选地，显示试剂包括固蓝B。最优选地，显示试剂包括固蓝B和醋酸钠。
在可替代的优选具体实施方式
中，显示试剂包括氧化还原指示剂。在此使用的术语“氧化还原指示剂”是指能够参与酚化合物的氧化还原(还原-氧化)反应从而产生有色产物的试剂。特别优选的氧化还原指示剂是氯化硝基四氮唑蓝。更优选地，氧化还原指示剂包括氯化硝基四氮唑蓝和吩嗪甲基硫酸酯。
方法的实施 本领域技术人员非常清楚有许多合适的技术可用于本发明的方法。以最广泛的意思，将上述样品与上述植酸酶底物结合。在此使用的“联合”是指使植酸酶底物和样品混合、联合、杂和、接触或其他允许反应的方式，这样在植酸酶底物转化为有机代谢物的过程中，显示出任何上述植酸酶活性。
本发明的方法可在溶液中进行，例如在微生物反应釜或微孔板。在此情况下，将包括样品的溶液添加到含植酸酶底物的溶液或反之。技术人员能够确定是否有必要添加例如缓冲液等的其它组分。
另外，本发明的方法可在固体支持物上进行，例如微生物菌落生长在琼脂平板上的情况。在此情况下，包括琼脂平板的微生物菌落是样品。此种情况下的植酸酶底物有利于通过简单地用含植酸酶底物的溶液覆盖平板的方法与样品结合。
可在测量有机代谢物的水平前，将植酸酶底物和样品联合并温育一定时间。另选地，可使植酸酶底物和样品联合并随时间测量有机代谢物水平(即连续地测量)。
当使用显示试剂时，可在进行此方法期间的任何时间点加入显示试剂。例如，可将包括显示试剂和植酸酶底物的组合物添加到样品中。另选地，植酸酶底物可添加到含显示试剂和样品的组合物中。另外，可在样品与植酸酶底物温育一定时间后添加显示试剂。
试剂盒 一方面，本发明涉及测定样品中植酸酶活性的试剂盒，其包括植酸酶底物和显示试剂。植酸酶底物和显示试剂可在同一个组合物中，或者作为同时、依次或单独使用的组分用在本发明的方法中。也可有其他组分，例如稳定剂、缓冲液和防腐剂。
本发明的化合物 可根据以下反应方案或其修改中描述的方法，使用易得的起始材料、试剂和常规合成步骤，方便地制备本发明的化合物。也能使用这些方法步骤的变体，这些对本领域技术人员已知并在其已有技术范围内。
方案2显示了从相应酚化合物(IV)，通过受保护的中间产物(V)制备多磷酸酯化合物(VI)的通用方法，其中G代表了保护基团。合适的保护基团G易于被本领域技术人员确定，其包括苄基、三烷基硅烷基(trialkylsilyl)(特别是三甲基硅烷基和叔丁基二甲基硅烷基)以及C1-6烷基。

方案2 方案3显示了从间苯三酚(VII)制备三磷酸间苯三酚(IX)。在这个反应中，通过二苄基亚磷酸酯与四氯化碳反应在原位产生二苄基氯磷酸酯。氢化受保护的中间产物(VIII)产生最终产物。

方案3


通过实施例及

的方式进一步详细描述本发明 图1显示了使用三磷酸-间苯三酚的显色反应显示的两个粗酶制品的pH图。上板-Citrobacter freundii来源的植酸酶，下板-Stenotropomonas tropophila来源的磷酸酶。两板相邻的行含有一系列双倍稀释的酶制品。列含有如实施例5中描述缓冲为不同pH的反应混合物(每两个相邻列之间的增量是0.5pH值)。
图2显示了从土壤微生物混合群落里筛选产植酸酶微生物菌株。左板显示了在醋酸纤维素滤膜表面上的微生物生长(从营养琼脂平板移过来)。右板显示了如实施例8中描述的用六磷酸-苯六酚染色后，同一平板下面的琼脂。
图3显示了在几个微生物分离物中，植酸酶/磷酸酶的检测。14个从土壤来源的不同细菌分离物在营养琼脂表面生长，并如实施例9中描述的用三磷酸-间苯三酚染色。
现在通过下述实施例进一步详细说明本发明。
缩写 DMAP二甲基氨基吡啶； DIPEA二异丙基乙胺； Bn苄基； TPP三磷酸间苯三酚； OD光密度。
实施例 实施例1合成间苯三酚三磷酸酯(IX)
间苯三酚三磷酸酯(IX)使用Silverberg等的磷酸化方法(Tetrahedronletters 37，771-774(1996))从购得的间苯三酚而成得到。在多颈圆底烧杯内，将间苯三酚(2.52g)溶解在355ml的无水乙腈中。反应期间，通过持续的氮气流排出烧瓶中的空气，并使用磁力搅拌仪连续搅动反应混合液。使用冰盐浴冷却溶液到低于-10℃。向溶液中以如下顺序加入四氯化碳(46g)、N，N-二异丙基乙胺(16.3g)和N，N-二甲基氨基吡啶(0.75g)。紧接着，缓慢添加二苄基亚磷酸酯(23g)，这样反应混合液的温度不会升高到-10℃以上。添加完二苄基亚磷酸酯后，反应混合物在-10℃温育1小时。此时，停止氮气流和冷却，并向反应混合液中添加150ml 0.5M的KH2PO4水溶液。混合液用乙酸乙酯提取(3次，150ml)。混合的乙酸乙酯提取液用水(200ml)洗涤2次，用饱和NaCl(200ml)洗涤1次并用无水硫酸钠干燥。通过旋转蒸发去除乙酸乙酯，所得产物溶解在75ml甲醇-四氢呋喃混合液(1∶1)中。添加1g钯碳，氢在大气压下缓慢通过反应混合液起泡，过夜。添加200ml水到反应混合液中，并用NaOH调节pH值至7.0。在降低的压力下用旋转蒸发器去除溶剂。根据HPLC分析，该产物是基本同质的，HPLC分析使用了由AS50自动上样仪、AS50热外壳、GP50梯度泵和ED50电化学检测器构成的DionexDX-600系统(Dionex，Sunnyvale，CA)，其使用了lonPac AG11(2×50mm)保护柱、lonPac AS11-HC(2×250mm)分析柱和ATC-1阴离子捕获柱，自生成抑制器设置为50mA。通过混合(A)200mM NaOH和(B)H2O0-5分钟，40-80mMNaOH；5-40分钟，80-135mM NaOH；40-42分钟，135-140mM NaOH实现梯度谱。用CHROMELEON 6(Dionex)软件进行数据收集和处理。
实施例2.苯六酚六磷酸酯(X)的合成
苯六酚通过Fatiadi等的方法合成(J.Res.Natl.Bur.Std.67A，153-62(1963))。1200g 30％水合乙二醛与6L含800g Na2SO3和300g NaHCO3的水溶液混合。向混合物通空气，并对其缓慢加热到约90℃。此时停止通风，但继续加热直到开始沸腾。使反应混合物缓慢冷却到室温。在冷却中形成的结晶沉淀用100ml甲醇-水(1∶1)洗涤1次，100ml甲醇洗涤1次，并溶解在500ml热的2.5M盐酸内。使用冰浴将溶液缓慢冷却到室温。四羟基对-苯醌的结晶沉淀用少量的冰冷水洗涤并重溶在500ml热的2.5M盐酸内。向溶液中添加200g SnCl2*2H2O，再使其沸腾。向溶液中添加500ml浓盐酸，溶液再次加热到沸腾后再加1L浓盐酸。冷却时形成的粗苯六酚沉淀从1L含5g SnCl2的2.5M HCl中重结晶。制剂保存在真空脱气器中的固体NaOH上。苯六酚基本如实施例1中描述的用二苄基氯磷酸磷酸化，不同在于使用了1.7g苯六酚并且在-10℃反应1h后，另外进行1h室温温育。使用在分析TPP中使用的同样的HPLC方法确认苯六酚六磷酸酯(X)的纯度。
实施例3.其他多羟基苯的其他磷酸酯的合成 使用如在实施例1和2中描述的相同磷酸化方法可以合成芳香多酚的其他磷酸酯衍生物。合成苯五酚(Chem.Commun.(London)9，441(1967))、多种苯四酚和苯三酚(Dressier H.，and Hotter S.Poiyhydroxybenzenes.InEncyclopaedia of chemical technology(3rd edition)，Mark H.F.et al.，eds.JohnWiley&sons.Vol 18，pp.670-704(1982))的方法是已知的。几种多羟基酚也可以购得。
实施例4.磷酸化的多羟基苯可作为植酸酶的底物 在微孔板中，在100μl反应混合液中进行酶学分析。酸性植酸酶和磷酸酶的反应混合液包括10mM底物溶解在含0.8mM CaCl2的、pH5.5的200mM醋酸钠缓冲液中。对碱性植酸酶和磷酸酶，使用同样的条件，不同在于用pH7.5的200mM Tris*HCI缓冲液替换醋酸钠缓冲液。反应在37℃下进行1h，用已知方法的变型测定释放出的磷酸盐/酯(Heinonen J.K.，Lahti R.J.AnalBiochem.113(2)，313-317(1981))。简单说，在每个微孔板的孔中，向100μl反应混合液中添加200μl新鲜制备的AMM溶液(7.5N H2SO4、15mM钼酸铵和丙酮-1∶1∶2)。在添加AMM试剂后的不早于10分钟且不晚于30分钟时间内测量390nm处的吸收值。通过建立已知浓度磷酸酯/盐溶液的标准曲线确定磷酸酯/盐的量。
植酸酶和磷酸酶都催化磷酸酯的水解。这样，这两组酶之间的差别就是定量的，而非定性的，并且可以定义为对植酸酯和简单的单磷酸酯(例如葡萄糖6-磷酸酯或果糖6-磷酸酯)水解的相对效率。磷酸酶水解植酸酯时趋于相对无效率，相反，大多数植酸酶水解单-取代糖磷酸酯时无效率。为测试多磷酸化的多羟基苯是否能用作植酸酯的模拟物，我们测试了几种不同植酸酶和磷酸酶作用于六磷酸-苯六酚和果糖6-磷酸酯的磷酸酯释放。Aspergillusniger(NatuphosR)、Escherichia coli(Phyzyme XPR)和Peniophoralycii(RonozymeR)来源的植酸酶以及土豆酸性磷酸酶在pH5.5进行分析，而碱性细菌磷酸酶、小牛肠磷酸酶和虾磷酸酶在pH7.5进行分析。此实验的结果(表1)证明苯六酚六磷酸酯对所有测试过的植酸酶来说是比果糖6-磷酸更好的底物，而对典型的磷酸酶，结果相反。相似地，间苯三酚三磷酸酯对于所有测试过的植酸酶是好的底物。然而，它不像苯六酚六磷酸酯那样具有选择性，因为它对于所有测试过的典型磷酸酶也是好的底物。
表1.以果糖6-磷酸酯和苯六酚六磷酸酯或间苯三酚三磷酸酯作为底物，不同酶的磷酸酯-释放活性的比率 实施例5.使用间苯三酚三磷酸酯检测液体分析中植酸酶或磷酸酶的活性 为在pH3-5.5范围内分析，100μl反应混合液含2mM间苯三酚三磷酸酯，其溶于含0.8mM CaCl2的200mM醋酸钠缓冲液中，将其添加到微孔板的孔中，并添加20μl的适当稀释的植酸酶或磷酸酶溶液。混合液在37℃温育60分钟，再添加50μl新鲜制备的含3mg/ml固蓝B的、pH5.3的5M醋酸钠溶液。在添加固蓝B后10分钟至20分钟内，分光光度(570nm)或照相记录颜色发展。此检测植酸酶/磷酸酶的方法也可用于比3-5.5更低或更高的pH值。在这种情况下，用其他合适的缓冲液替换醋酸钠缓冲液。例如，甘氨酸*HCl可用于pH1.5-3的范围，Tris-马来酸盐可用于pH6-9的范围。图3显示了此方法如何用于植酸酶或磷酸酶的pH图的快速评估。
实施例6.使用间苯三酚三磷酸酯检测饲料样品中添加的植酸酶的活性 饲料样品以10-25％(w/v)悬浮于50mM甘氨酸/HCI，pH2.5，并在室温搅动30分钟。固体物质澄清后，去除上清液，置于Eppendorf管内并用1％(w/v)活性碳(Norit)处理。悬浮液在室温下搅动10分钟，并用10,000rpm离心1分钟。去除100μl上清液，并在微孔板的孔内与100μl含20mM间苯三酚三磷酸酯的250mM甘氨酸/HCl，pH2.5溶液混合。微孔板在37℃温育60分钟，再添加25μl含2.5mg/ml固蓝B(Sigma D9805)的、pH5.3的5M醋酸钠溶液。15-20分钟后，光度测定或照相记录颜色强度。
实施例7.使用苯六酚六磷酸酯检测液体分析中植酸酶的活性 将100μl存在于200mM醋酸钠缓冲液(含0.8mM CaCl2)中的反应混合液(含2mM苯六酚六磷酸酯、1mg/ml氯化硝基四氮唑蓝和0.02mg/ml吩嗪甲基硫酸酯)添加到微孔板的孔中，并添加20μl适当稀释的植酸酶或磷酸酶溶液。可看到产生了颜色，如果需要，则通过测量在570nm的OD来定量。
实施例8.使用苯六酚六磷酸酯检测固体支持介质上的植酸酶的活性 微生物菌落生长在覆盖醋酸纤维素滤膜(type OE 67，Shleicher-Schüll)的营养平板表面。除去表面的滤膜，琼脂用含2mM苯六酚六磷酸酯、1mg/ml氯化硝基四氮唑蓝和0.02mg/ml吩嗪甲基硫酸酯的琼脂糖溶液(0.7％)覆盖。覆盖染色琼脂糖的平板在37℃下温育直到产生颜色，最多1-2小时。营养琼脂表面出现的暗斑对应于分泌植酸酶活性的微生物菌落(图2)。
实施例9.使用苯六酚六磷酸酯检测固体支持介质上的植酸酶和/或磷酸酶的活性 微生物菌落生长在营养平板的表面。一条滤纸(Whatman NO1)浸在其中含2mM间苯三酚三磷酸酯和1mg/ml固蓝B的、pH5.5的200mM醋酸钠缓冲液中，在纸巾上轻擦，置于皮式平板(Petri plate)的表面与微生物菌落接触。在2-5分钟内，分泌植酸酶或磷酸酶的菌落周围出现蓝紫色，并在约30-60分钟到达最高值。
所有在以上说明书中提到的文献通过引用包括在本文内。本发明方法和系统的多种修改和变体在不脱离本发明精神的情况下，对本领域技术人员是显而易见的。尽管本发明用特定的优选具体实施方式
来描述，但应当认识到本发明不应当限制在这些特定的具体实施方式
中。实际上，对化学或相关领域技术人员显而易见的实施本发明的所述方式的多种变体包括在下述权利要求的范围内。
权利要求
1.检测样品中植酸酶的方法，其包括
i)将所述样品与植酸酶底物结合，以及
ii)测量所述植酸酶底物的有机代谢物的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述植酸酶底物包括芳香基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述芳香基团是苯基。
4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物包括至少一个含磷基团。
5.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物包括多个含磷基团。
6.根据权利要求4或5任一项所述的方法，其中所述含磷基团是磷酸酯/盐基团。
7.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物包括芳香基团和多个磷酸酯/盐基团。
8.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物具有分子式(I)；
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H、C1-12烷基、C1-12烷氧基、SO3H、OSO3H、NO2、NH2、NH(C1-12烷基)、N(C1-12烷基)2、OPO3H2、CO2H、CN、C1-12卤代烷基、或者R1、R2、R3、R4、R5和R6中的任意一对或多对与其所连接的碳原子一起形成饱和、不饱和或芳香的C3-122碳环或杂环；
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少两个是OPO3H2；
或其盐形式。
9.根据权利要求8所述的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H和OPO3H2，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少两个是OPO3H2或其盐形式。
10.根据权利要求9所述的方法，其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少一个是H。
11.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述底物选自间苯三酚三磷酸酯、苯六酚六磷酸酯和苯五酚五磷酸酯或其盐形式。
12.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述底物是苯六酚六磷酸酯或其盐形式。
13.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述植酸酶底物不含游离羟基。
14.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述有机代谢物具有游离羟基。
15.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述测量步骤ii)包括将代谢物与显示试剂反应产生有色产物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述显示试剂选自氧化剂、还原剂和亲电子试剂。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述显示试剂包括重氮盐。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述重氮盐是色盐。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述色盐选自固紫B、固黑K和固蓝B。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述显示试剂包括氯化硝基四氮唑蓝。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述显示试剂进一步包括吩嗪甲基硫酸酯。
22.测定样品中植酸酶活性的试剂盒，其包括植酸酶底物和显示试剂。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于权利要求1-21任一项所述的特征。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，其包括苯六酚六磷酸酯、氯化硝基四氮唑蓝和任选的吩嗪甲基硫酸酯。
25.根据权利要求22所述的试剂盒，其包括色盐和如权利要求10所定义的化合物。
26.含有芳香基团和多个磷酸酯/盐基团的化合物作为植酸酶底物的应用。
27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于权利要求8-13任一项所述的特征。
28.含有芳香基团和多个磷酸酯/盐基团的化合物在检测酶活性的方法中的应用。
29.根据权利要求28所述的应用，其中所述酶活性是磷酸酶或植酸酶活性。
30.根据权利要求28或29所述的应用，其特征在于权利要求1-21任一项所述的特征。
31.分子式(I)的化合物
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6独立地选自H、C1-12烷基、C1-12烷氧基、SO3H、OSO3H、NO2、NH2、NH(C1-12烷基)、N(C1-12烷基)2、OPO3H2、CO2H、CN、C1-12卤代烷基、或者R1、R2、R3、R4、R5和R6中的任意一对或多对与其所连接的碳原子一起形成饱和、不饱和或芳香的C3-12碳环或杂环；
其中R1、R2、R3、R4、R5和R6中至少2个是OPO3H2；
或其盐形式。
32.根据权利要求31所述的化合物，其为间苯三酚三磷酸酯、苯六酚六磷酸酯和苯五酚五磷酸或其盐形式中的一种。
33.包括植酸酶底物和显示试剂的组合物。
34.根据权利要求33所述的组合物，其特征在于权利要求1-21任一项的特征。
35.通过引用任一实施例而在此之前充分描述的方法。
36.通过引用任一实施例而在此之前充分描述的试剂盒。
37.通过引用任一实施例而在此之前充分描述的应用。
38.通过引用任一实施例而在此之前充分描述的化合物。
39.通过引用任一实施例而在此之前充分描述的组合物。
全文摘要
本发明提供了检测样品中植酸酶活性的方法，其包括将植酸酶底物与所述样品联合，并测量所述植酸酶底物的有机代谢水平。
文档编号C12Q1/42GK101175861SQ200680017005
公开日2008年5月7日 申请日期2006年5月15日 优先权日2005年5月16日
发明者维贾伊·库马尔, 安德烈·米亚斯尼科夫 申请人:丹尼斯科有限公司