专利名称：一类具有抗氧化活性的六肽、其分离方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物技术领域，具备涉及一类具有抗氧化活性的角类多肽、其分离方法及用途。本申请为200910233784. 1的分案申请。
背景技术：
角类动物药材是祖国医学宝库的重要组成部分，其功效确切，作用特点突出。中国现已知最早的本草著作《神农本草经》中就已经记载了犀角(Cornu Rhinoceri Asiatici) 和羚羊角(Cornu Saigae Tataricae)的性味与功效，而后汉代《名医别录》中出现了关于水牛角(Cornu Bubali)性味与功效的记载。千百年来，犀(广)角、羚羊角、水牛角等角类药材一直是中医临床不可或缺的要药，主要用于治疗热证。然而，目前法律已经明令禁止使用及交易犀角及其制品，赛加羚羊作为濒危物种，其角的使用也受到限制，只有水牛角因取材广泛，价格低廉，疗效确切而被沿用至今。从20世纪60年代起，科研人员就开始对多种角类药材进行比较研究与评价，结果认为水牛角在氨基酸组成、宏微量元素组成、药理药效作用等方面与犀角相似且功效确切，因此目前中医普遍采用水牛角及水牛角浓缩粉代用犀 (广)角用作医药工业和临床调剂，取得良好的效果，以缓解中医临床千年来对于犀(广) 角使用的依赖性。水牛角 Cornu Bubali 为牛科动物 Bubalus bubal is Linnaeus 的双角，为 2005 版 《中华人民共和国药典》收载品种，性味苦，寒，归心，肝经。水牛角主要含有角蛋白、多肽、氨基酸、胆固醇等物质，具清热解毒、凉血、定惊等功效，中医临床以直接煎汤或入方剂煎汤服用，主要用于治疗温病高热，神昏谵语，发斑发疫，吐血衄血，惊风，癫狂等证。虽然犀(广)角、羚羊角、水牛角等角类药材应用历史逾千年，但因药材来源部位、 材质、组成成分等特殊性，其效应物质基础与作用机制的研究还较为薄弱，关于其活性成分的报道几乎为零。因此，如何充分利用现代生物技术手段，从角类药材中分离纯化活性多肽并进行结构鉴定，深入开展研究角类药材效应物质基础与作用机制研究，是该领域科研技术人员多年来努力寻求突破的研究方向之一。
发明内容
本发明采用现代生化技术手段，对水牛角中具有抗氧化活性多肽成分进行跟踪， 进行逐步的分离、纯化，并对此活性组分的结构进行分析鉴定。本发明公开了下列3种结构式的多肽Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)；Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn(II)；Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn (III)。它们均分离自水牛角，也可人工合成。从水牛角分离的方法包括a、取水牛角粉，用纯水加热回流提取，滤过，滤液浓缩冷冻干燥，得粗提物；
b、对粗提物进行凝胶柱层析分离，在254nm下检测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，测定抗氧化活性；C、将最高抗氧化活性的组分进一步利用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离纯化，离子交换柱先用50mM磷酸盐缓冲液(PBS)pH6. 5，以lml/min流速预处理池； 上样后，离子交换柱用50mM PBS pH6. 5，以lml/min流速洗脱池，然后以线性梯度为0_0. 3M NaCl的PBS缓冲液50mM，pH6. 5洗脱，洗脱曲线在2Mnm下检测；根据洗脱峰收集每个组分， 冷冻干燥；d、将c得到的冻干粉，纯水溶解成较高浓度，通过Waters 2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进行脱盐，测定抗氧化活性，得到较好抗氧化活性组分D2和D3 ；e、将组分D2和D3，再通过Waters 2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进一步分离纯化；以线性梯度为2% -60%甲醇洗脱，其中含0. 三氟乙酸，在230nm下检测；D2组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为4. 6min和7. 3min的两个色谱峰，分别为多肽I 和II ；D3组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为5. ^iin的色谱峰，为多肽III ；收集得到的样品，减压浓缩除去甲醇后，冷冻干燥；分别得到多肽I，II和III的冻干粉。上述分离纯化方法纯化的活性多肽I、II、III的分子量分别为708. 090Da, 1018. 296Da 和 1271. 379Da。结构式Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)；Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn(II)；Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn (III)。 将3个多肽溶于细胞培养液中，经过稀释分别配成0. 5 μ M，5 μ M和50 μ M溶液，与大鼠脑微血管内皮细胞(rCMECs)预孵1 后，去除含多肽的细胞培养液，用PBS洗两遍，加入含有500 μ M H2O2的细胞培养液，共孵池后，进行MTT实验，同时吸出细胞上清液用于测定LDH含量。结果表明，3个多肽在5 μ M和50 μ M浓度时，能够增加rCMECs细胞存活率，减少上清LDH释放量，对H2A所致rCMECs损伤均有保护作用。其中以多肽III的抗氧化活最佳，明显优于多肽I和多肽II，能够显著提高细胞存活率，并减少LDH的释放。结果见图1 和图2。本发明对水牛角中具有抗氧化活性的多肽成分进行跟踪，进行逐步分离、纯化，并对纯多肽进行氨基酸序列分析，获得3个具有抗氧化活性的角类多肽。本发明工艺简单，应用范围广，为其它角类药材物质基础研究，活性成分的分离纯化提供思路与方法。3个活性多肽的特点是具有良好的抗氧化活性，对H2A所致的rCMECs过氧化损伤具有保护作用，体现了抗氧化活性；3个活性多肽分子量特点都低于2kDa，分子量越小的多肽越易于穿过机体半透膜到达作用部位；氨基酸组成特点是都含有疏水性氨基酸和质子供体氨基酸，疏水性氨基酸残基能够促进多肽与生物系统内脂质的结合，质子供体氨基酸能够提供质子参与氧化还原反应，因此3个活性多肽的脂溶性较好，并具有良好的抗氧化活性。本发明分离得到的多肽分子量小，活性突出，氨基酸序列明确，为进一步人工合成活性多肽提供了必要的基础，为今后开发利用角类抗氧化活性多肽进行药品、保健品等产品研究开发奠定了基础。本发明的活性多肽可以和药学上可接受的载体混合制成各种剂型，也可以和食品添加剂混合制成保健食品。本发明的多肽还可以和药用盐形成药学上可接受的盐的形式存在。
图1为纯化多肽I、II和III抗rCMECs氧化损伤MTT实验示意图。图2为纯化多肽I、II和III抗rCMECs氧化损伤LDH释放实验示意图。图3为kphadex G_25凝胶柱层析分离水牛角提取物中活性多肽的层析示意图。图4为DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析分离活性组分G3的层析示意图。图5为Waters自动纯化HPLC系统纯化活性成分D2的层析示意图。图6为Waters自动纯化HPLC系统纯化活性成分D3的层析示意图。图7为纯化多肽I的串联质谱及氨基酸序列从头计算示意图。图8为纯化多肽II的串联质谱及氨基酸序列从头计算示意图。图9为纯化多肽III的串联质谱及氨基酸序列从头计算示意图。
具体实施例方式实施例1(1)水牛角提取物的制备取水牛角粉500g，与5000ml纯水混合，加热微沸回流提取两次，每次8小时，煎煮结束后合并滤液，滤过，滤液在50°C减压旋转蒸发浓缩至适量后进行冷冻干燥，可得粗提物冻干粉，用于后面不同组分的分离及各组分抗氧化活性评价实验。(2)对粗提物的凝胶柱层析分离将步骤(1)制得的粗提物与纯水混合，在4°C下充分搅拌，4°C下12000rpm后离心 20min,收集上清液，采用滴定管将样品小心加到kphadex G-25柱2. OX IOOcm顶端。用纯水进行洗脱，流速为0. 15ml/min，检测波长为2Mnm，自动分部收集器收集洗脱液样品，每 2ml收集1管。经G-25凝胶柱层析后共获得G1，G2，G3和G4四个组分，其层析示意图见图 3。收集这四个组分，冷冻干燥后，进行细胞实验，以噻唑蓝(MTT)实验和乳酸脱氢酶(LDH) 释放实验为指标，观察四个组分对H2A所致rCMEC损伤的保护作用，评价其抗氧化活性。结果表明，G3具有最高的抗氧化损伤活性，进行进一步的阴离子交换层析。(3)对分离组分的阴离子交换柱层析分离经过步骤O)的分离得到的活性组分先用适量50mM PBS pH6.5缓冲液溶解，上样到DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱2. 0X 20cm，离子交换柱事先用50mM PBS pH6. 5缓冲液充分平衡。上样后，用50mM PBS pH6. 5以lml/min流速洗涤，待出现穿透峰Dl后，采用线性梯度为0-0. 3M NaCl的50mM PBS pH6. 5缓冲液洗脱，出现D2和D3两个组分，其层析示意图见图4。收集这三个组分冷冻干燥，冻干粉用少量蒸馏水溶解后，通过Waters2545-24894676自动纯化HPLC系统进行脱盐，分离柱为SunFire C18反相柱， 19mmX 50mm;进样后，先采用2 %甲醇洗脱^iin，后用60%甲醇洗脱lOmin，收集60%甲醇洗脱液，减压旋转蒸发浓缩除去甲醇后，冷冻干燥；冻干粉进行细胞实验，以MTT实验和LDH 释放实验为指标，观察三个组分对H2A所致rCMEC损伤的保护作用，评价其抗氧化活性。结果表明，D2和D3均具有良好的抗氧化损伤活性，进一步通过反相HPLC进行纯化。
(4)反相HPLC层析纯化经阴离子交换柱层析分离后获得的具有较好抗氧化活性组分，再通过 Waters2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进一步分离纯化；以线性梯度为2% -60%甲醇洗脱，其中含0. 三氟乙酸(TFA)，在230nm下检测；D2组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为4. 6min和7. 3min的两个色谱峰，分别为多肽I和II，其层析示意图见图5 ； D3组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为5. 4min的色谱峰，为多肽III，其层析示意图见图6 ；根据洗脱峰收集样品，减压浓缩除去甲醇后，冷冻干燥；冻干后得到3个角类活性多肽冻干粉，分别为I，II和III。多肽I的序列为Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val，多肽II 的序列为 Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn,多肽 III 的序列为 Ala-Ala-Asp-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn。多肽I和II从D2部分分离纯化获得，多肽III从D3 部分分离纯化获得。(5)纯化活性多肽的序列分析在此研究中，我们采用经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F-MS) 和串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MQ分析3个活性多肽的分子量及其氨基酸序列。MALDI-T0F 上样基质选用α-氰基-4-羟基肉桂酸，将大约1μ 1的样品与1基质充分混合后，点样于上样靶，室温下干燥。MALDI-T0F/T0F-MS分析激光波长为337nm，一级质谱加速电压设置为19kV，串联质谱最终加速电压为^kV,串联质谱大约由1000次轰击累加而成。结果获得 3个多肽的[M+H] +分别为709. 090Da, 1019. 296Da和1272. 379Da ；3个多肽的氨基酸序列分另1J为:Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val, Tyr-Glu-Asp-Cys-Thr-Asp-Cys-Gly-Asn 禾口 Ala-Ala-As p-Asn-Ala-Asn-Glu-Leu-Phe-Pro-Pro-Asn，3个多肽的串联质谱及氨基酸序列从头计算示意图见图7，图8和图9。
权利要求
1.具有式I的多肽或其药学上可接受的盐Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val(I)。
2.权利要求1的多肽的制备方法，包括a、取水牛角粉，用纯水加热回流提取，滤过，滤液浓缩冷冻干燥，得粗提物；b、对粗提物进行凝胶柱层析分离，在254nm下检测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，测定抗氧化活性；C、将最高抗氧化活性的组分进一步利用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱分离纯化，离子交换柱先用50mM磷酸盐缓冲液pH6.5，以lml/min流速预处理池；上样后，离子交换柱用50mM磷酸盐缓冲液pH6. 5，以lml/min流速洗脱2h，然后以线性梯度为 0-0. 3MNaCl的磷酸盐缓冲液50mM，pH6. 5洗脱，洗脱曲线在254nm下检测；根据洗脱峰收集每个组分，冷冻干燥；d、将c得到的冻干粉，纯水溶解成较高浓度，通过Waters2545-2489-2676自动纯化 HPLC系统进行脱盐，测定抗氧化活性，得到较好抗氧化活性组分D2和D3 ；e、将组分D2和D3，再通过Waters2545-2489-2676自动纯化HPLC系统进一步分离纯化；以线性梯度为2% -60%甲醇洗脱，其中含0. 三氟乙酸，在230nm下检测；D2组分反相HPLC层析分离时，收集保留时间约为4. 6min的色谱峰，为多肽I ；收集得到的样品，减压浓缩除去甲醇后，冷冻干燥；得到多肽I的冻干粉。
3.—种药物组合物，其中含有权利要求1的多肽或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。
4.权利要求1的多肽或其药学上可接受的盐用于制备抗氧化药物的用途。
全文摘要
本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的六肽、其分离方法及用途。本发明的多肽具有下列序列结构Gln-Tyr-Asp-Gln-Gly-Val。这种多肽提取分离自水牛角，药理试验证明，本发明的多肽具有良好的抗氧化活性。
文档编号C07K1/18GK102321157SQ201110278428
公开日2012年1月18日 申请日期2009年10月26日 优先权日2009年10月26日
发明者刘睿, 唐于平, 段金廒, 郭建明, 钱大玮 申请人:南京中医药大学