一种测定物质抗氧化活性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种测定物质抗氧化活性的方法，具体涉及该测定物质抗氧化活性的 方法在药品、食品及其保健品研究方面的应用，属于药品、食品及其保健品研究领域。
【背景技术】
[0002] 机体自由基过量（氧化应激，Oxidative stress)可以引起生物膜脂质、蛋白质和 DNA的氧化性损伤，导致癌症、衰老、动脉硬化以及多种老年慢性疾病。
[0003] 抗氧化剂能够通过干扰活性氧自由基链锁反应的启动和蔓延，最终阻断自由基反 应过程，起到有效减少氧自由基毒害作用。人体通过补充抗氧化剂，调节体内氧化还原平 衡，达到预防、治疗与氧化应激相关疾病的目的。因此，种类繁多的各种抗氧化的药物，食品 及饮料被广泛开发生产。
[0004] 目前，体外分析抗氧化活性的方法有以下几类：（1)抗氧化剂与 稳定自由基的反应，如：galvinoxyl、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼， 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)，ABTS · + (2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑 _6_ 横酸） 2, 2f -azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid cation radical ； (2) 采用竞争反应测定，如：抗氧化能力指数测定法（oxygen radical absorbance capacity 0RAC) ;(3)通过测定物质对金属离子Fe(III)、CU(II)的还原能力，来反映抗氧化能力；(4) 测定总抗氧化能力（total antioxidant capacity TAC)。
[0005] 关于药物、食品及其保健品的抗氧化活性测定的体外方法虽然很成熟，但是体外 分析中所使用的化学评价结果是否能直接应用于生物体系，始终未能解决。体外分析中所 使用的化学体系，与体内试验中的生物体系，两者截然不同。
[0006] 在这种情形之下，采用传统的体外分析方法，测定的结果并不可靠。
[0007] 而采用生物标记方法的体内分析结果就较为可靠。但是，体内试验的受试对象是 人或者动物，实验成本高、试验周期长，操作麻烦等，并不适合药物的前期筛选。药物的生物 利用度和体内代谢也会影响到药物在体内的抗氧化活性，导致检测结果的不准确。
[0008] 本发明公开了一种测定抗氧化活性的方法，采用体内测定方式，可以使用不同的 氧化应激因子，测定单一化合物和混合物，且具有测定结果准确、操作方法简单，测定仪器 易得、成本低廉的优点。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供了一种评价药物、食品及其保健品等的抗氧化能力的方法， 具体为一种测定物质抗氧化活性的方法，本发明的另一目的是提供一种测定物质抗氧化活 性的方法在药品、食品及其保健品研究方面的应用。
[0010] 该方法为：以大肠杆菌为模型，供试样品预先与大肠杆菌培养，然后加入氧化剂， 继续培养，采用光电比浊法，测定细菌生长情况，供试样品的抗氧化活性与供试样品对细菌 氧化应激的保护作用呈正相关性，可采用细菌存活率来反映供试样品抗氧化活性的大小， 计算公式如下：
[0011] 存活率（％ )=(药物组0D/阴性对照组0D) X 100 %，其中0D为optical density(光密度）的缩写。
[0012] 其中，所述的大肠杆菌为：处于对数期的大肠杆菌。
[0013] 其中，所述大肠杆菌为：标准菌株CMCC(B) 44102。
[0014] 其中，所述的氧化剂为过氧化氢，过氧化氢的实验浓度为75mM。
[0015] 其中，所述的光电比浊法检测0D (光密度）时采用波长为600nm。
[0016] 其中，所述的采用光电比浊法测定细菌生长情况时的检测时间为供试样品预先与 大肠杆菌培养3h。
[0017] 其中，供试样品为水溶性物质、或脂溶性物质。
[0018] 其中，所述的水溶性物质在检测前溶解于生理盐水，脂溶性物质在检测前溶解于 二甲基亚砜或者乙醇。
[0019] 本发明还提供一种测定物质抗氧化活性的方法在药品、食品及其保健品抗氧化活 性测定方面的应用。
[0020] 本发明还提供一种测定物质抗氧化活性的方法在研究具有抗氧化活性药物的构 效关系方面的应用。
[0021] 采用本发明的方法，以大肠杆菌为模型，以氧化应激因子，如过氧化氢诱导处于对 数生长期大肠杆菌处于氧化状态，采用光电比浊法（0D600)测定大肠杆菌的生长曲线，发 现氧化应激损伤后的细菌，表现出短暂的生长休眠期和生长缓慢。发现引入抗氧化剂保护 后的细菌，表现出生长休眠期缩短，细菌快速进入生长期。
[0022] 总之，与未加抗氧化剂的细菌比较，加入抗氧化剂的细菌生长休眠期缩短，细菌快 速进入对数生长状态。因此药物的抗氧化活性与药物对细菌氧化应激的保护作用呈正相关 性，可采用细菌存活率来反映药物抗氧化活性的大小。计算公式如下：
[0023] 存活率（％ )=(药物组0D/阴性对照组0D) X 100%
[0024] 同现有的方法相比，本发明具有以下优势：
[0025] (1)大肠杆菌，具有抗氧化防御系统，包括各种抗氧化酶基因和内源性抗氧化剂。 因此，以大肠杆菌为模型较化学模型更接近体内环境。
[0026] (2)与哺乳细胞不同，处于肠道区的微生物它们与高浓度的抗氧化剂直接作用，并 且大多数抗氧化剂是以其本身的化学结构存在，并非代谢物存在。因此，采用本发明的方 法，对于揭示抗氧化的结构与活性关系，为以天然抗氧化剂为先导的人工抗氧化剂的设计 提供了有效的基础数据。
[0027] (3)采用本发明的方法，对单一化合物或者混合物，亲水性化合物以及亲脂性化合 物均可以进行活性测试。
[0028] (4)本发明的方法结果准确、简单易行，对设备要求不高，成本低廉，具有普遍的适 用性。
【附图说明】
[0029] 图1为过氧化氢对大肠杆菌的氧化应激损伤结果图。
[0030] 图2为肉桂酸类化合物的结构式。
[0031] 实施方式
[0032] 下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不 局限于以下所述。
[0033] 实施例1过氧化氢对大肠杆菌的氧化应激损伤模型的建立
[0034] 1、实验材料
[0035] 大肠杆菌CMCC⑶44102,购自广东环凯微生物科技有限公司，广州市萝岗区广州 开发区科学城神舟路788号；
[0036] 过氧化氢（30% H202，分析纯，天津市东区红岩试剂厂）。
[0037] 2、实验方法
[0038] 大肠杆菌CMCC(B)44102,接种于LB培养基（酵母膏：5g，蛋白胨：10g，NaCl :10g， 水：1000ml)，置于摇床中隔夜培养10~11小时，摇床转速为每分钟150转，温度为37°C。 在超净台下移取少量处于对数生长期的细菌，用LB培养基稀释至0D 6。。值约为0.2,然后 加入氧化应激因子过氧化氢。反应液体积为3mL，过氧化氢的浓度梯度为25mM/L、50mM/L、 75mM/L、100mM/L，对照为不加过氧化氢。将反应试管放入摇床，转速为每分钟160转，温度 为37°C。每30分钟取样，并用双蒸水1. 5倍稀释后，测定0D_。
[0039] 用过氧化氢诱导对数生长期的大