一种ace抑制酶解液及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶解液，尤其涉及一种ACE抑制酶解液及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 高血压是世界上最为普遍也是危害性最大的疾病之一。研究发现，人体血压主要 由肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统共同调控，而血管紧张素转化酶(ACE)对 这两系统都有重要影响，可导致血压升高。因此抑制ACE的活性，可以起到治疗高血压的功 效。除了人工合成的普利类药物，食物来源的ACE抑制剂因其天然可食疗、安全无副作用，成 为研究热点。ACE抑制剂可从各类食物材料中通过发酵或酶解，然后通过分离纯化的方式制 备。
[0003] 扇贝裙边即扇贝的外套膜，作为扇贝柱加工的主要副产物，占扇贝总重（除贝壳 外）的30.0%，其营养成分与扇贝柱类似，富含蛋白质且氨基酸种类齐全，具有很高的营养 价值，但目前利用率很低，除了少数被处理为动物饲料低价出售，大部分被当做废弃物丢 弃，导致很大的浪费和污染。
[0004] 因此，本领域的技术人员致力于通过酶解、纯化的方式，利用扇贝裙边等利用率 低、商业价值小的蛋白质来源，制备ACE抑制剂。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是确定合适的酶和最优的酶解条件，利用扇贝裙边作 原料，通过透析技术，得到具有ACE抑制效果的酶解液。
[0006] 本发明公开了一种ACE抑制酶解液的制备方法，包括以下步骤：
[0007] 1)将扇贝裙边洗净、烘干、粉碎，过筛，得到扇贝裙边粉；
[0008] 2)向磷酸盐缓冲液中里加入扇贝裙边粉以及α-胰凝乳蛋白酶，混匀，进行水解反 应，高温终止水解反应，离心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液；
[0009] 3)向α-胰凝乳蛋白酶酶解液中加入磷酸氢二钾溶液将pH调节至7.5,然后添加羧 肽酶A和羧肽酶B，混匀，进行水解反应，高温终止水解反应，得到羧肽酶A/B酶解液；
[0010] 4)将羧肽酶A/B酶解液放入lOOODa CE透析袋，浸没于去离子水中透析，小于 lOOODa的组分扩散至去离子水中，将带有小于lOOODa的组分的去离子水装入500Da CE透析 袋内，浸没于去离子水中透析，得到留在透析袋内的500_1000Da的组分，即得到ACE抑制酶 解液。
[0011] 进一步地，步骤1)具体为:将扇贝裙边用水反复清洗3次，然后置于烘箱中65°C烘 干，将烘干的扇贝裙边粉碎，过60目筛，得到扇贝裙边粉。
[0012] 进一步地，步骤2)具体为：向60mL 0.035M PH8.0磷酸盐缓冲液中里加入4g的扇贝 裙边粉以及24mg 800U/mga-胰凝乳蛋白酶，漩涡混匀，在37°C下水解反应5h，高温终止水解 反应，离心，取上清，得到α-胰凝乳蛋白酶酶解液。
[0013] 进一步地，步骤3)具体为：取α-胰凝乳蛋白酶酶解液9.8mL，通过加入磷酸氢二钾 溶液将口讯周节至7.5，然后添加10(^1^ 2001]/1^羧肽酶4和10(^1^001]/1^羧肽酶8，漩涡混匀， 于45°C下水解反应8h，高温终止水解反应，得到羧肽酶A/B酶解液。
[0014] 进一步地，步骤4)中两次透析的时间均为10-14h，期间均换一次去离子水。
[0015] 本发明所涉及的ACE抑制酶解液是通过上述制备方法制得的ACE抑制酶解液。
[0016] 尤其是，ACE抑制酶解液的半抑制浓度（IC5Q值)为800-900yg/mL。
[0017]优选地是，ACE抑制酶解液的IC5Q值为893yg/mL，ACE抑制酶解液中分子的大小为 500-1000Da〇
[0018] 进一步地，ACE抑制酶解液来自扇贝裙边，扇贝裙边的蛋白质含量为50-55% ;扇贝 裙边的脯氨酸含量为200-210nmol/mg，占扇贝裙边的总蛋白质含量的5.0-5.5%。
[0019] 本发明所涉及的ACE抑制酶解液能够应用在制备降压药和/或降压食品。比如，作 为制备普利类降压药的原料。
[0020] 其有益效果：
[0021] (1)通过α-胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A/B两步酶解扇贝裙边得到的ACE抑制酶解液其 ACE抑制的IC5Q值为893yg/mL，具备一定的降血压功能。普通ACE抑制酶解液(未经分离纯化） 的IC 5Q值一般在mg/ml的级别，即1000-10000yg/mL范围内。本发明中，因为采用了针对性的 两步酶解以及优化酶解时间，同时利用透析分离出ACE抑制肽较为集中的500-1000Da组分， 使得扇贝裙边酶解液的IC 5Q = 893yg/mL，比普通的ACE抑制酶解液更好。
[0022] (2)扇贝裙边粉中蛋白质含量为52.5±0.8%，脯氨酸含量为207.53nmol/mg，占总 蛋白质含量的5.2%，有利于制备酶解液。
[0023] (3)用α-胰凝乳蛋白酶酶解5h，扇贝裙边蛋白的水解度达到最高值，为7.7 土 0.3%〇
[0024] (4)用羧肽酶A/B酶解8h，酶解液的水解度达到最高值，比α-胰凝乳蛋白酶解液提 高 3·5±0·3%。
[0025] (5)本发明提供的制备方法是从扇贝裙边酶解得到ACE抑制酶解液，为扇贝裙边提 供了一种新的利用途径，降低了资源浪费和污染，提升了扇贝裙边的商业价值和利用率。
[0026] (6)本发明提供的ACE抑制酶解液，食物来源，对于进一步的应用于降压药物或降 压食物的生产更加安全可靠。
[0027] (7)本发明的制备方法步骤简单，可以用于工业生产。
【附图说明】
[0028] 图1是α-胰凝乳蛋白酶水解时间与水解度曲线。
[0029] 图2是羧肽酶Α/Β水解时间与水解度曲线。
[0030] 图3是透析各组分抑制ACE的IC5Q值。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图和具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些 实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。下述实施例中所使用 的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说 明，均可从商业途径得到。
[0032]实施例1、ACE抑制酶解液的制备方法 [0033] 1、扇贝裙边的预处理：
[0034]将购买的扇贝裙边用水反复清洗3次。然后放置烘箱中65°C过夜，直至烘干。将烘 干的扇贝裙边利用多功能粉碎机进行粉碎，并过60目筛，得到扇贝裙边粉，备用。
[0035] 2、扇贝裙边营养成分分析：
[0036] 通过凯氏定氮法，测得海湾扇贝裙边粉中蛋白质含量为52.5±0.8%。通过全自动 氨基酸分析仪进行氨基酸成分分析，结果表明脯氨酸含量为207.53nmol/mg，占总蛋白质含 量的5.2%。
[0037] 3、水解度的测定：
[0038] 根据Adler-Nissen的方法进行改进，具体操作步骤如下:取0. lmL酶解液样品于试 管中，加入2.2mL 0.21M磷酸盐缓冲液(pH 8.2)和2mL 0.1%三硝基苯磺酸，混合均匀，50°C 避光水浴lh。反应结束后，加入4mL的0.1M盐酸，震荡后室温静置30min，测定混合液的340nm 吸光值。同时以不同浓度的L-亮氨酸替代样品，执行相同操作，用以拟合0D34Q与氨基态氮浓 度的关系曲线。水解度的计算按照Ben jakul&Morrissey ' s的公式进行改进，具体如下：
[0039] DH= (ht-ho)/(ht〇t-ho) X 100
[0040] 其中DH:水解度（％)
[0041] ht:反应后氨基态氮浓度(mmol/g)
[0042] ho:反应前氨基态氮浓度(mmol/g)
[0043] htclt:样品肽键总数(mmol/g)，即样品100%彻底水解后氨基态氮浓度。扇贝裙边的 ht〇t为7 · 99mmol/g〇
[0044] 4、α_胰凝乳蛋白酶酶解条件优化：
[0045]向60mL 0.035Μ ρΗ8.0磷酸盐缓冲液中里加入4g的扇贝裙边粉以及24mga-胰凝乳