铁死亡抑制剂在制备治疗铁过载疾病的药物中的应用

铁死亡抑制剂在制备治疗铁过载疾病的药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种铁死亡抑制剂在制备治疗铁过载疾病的药物中的应用，该铁死亡抑制剂为Ferrostatin?1。本发明为以铁死亡为靶点的铁过载疾病的治疗提供了理论依据，特别是对遗传性血色病的药物研发提供了基础。
【专利说明】
铁死亡抑制剂在制备治疗铁过载疾病的药物中的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在治疗铁过载疾病中的应用。
【背景技术】
[0002]铁死亡(Ferroptosis)是一类铁依赖的细胞死亡途径，不同于凋亡、坏死、自噬等其他死亡途径。铁死亡表现为细胞脂质过氧化水平和标志基因Ptgs2表达量升高，可特异性被铁离子螯合剂抑制。
[0003]Ferrostatin-1是目前公认的铁死亡抑制剂。作为含有N-环己基的化合物，Ferrostatin-1与细胞膜磷脂双分子层有较高亲和性，能有效清除细胞膜脂质过氧化。体外实验中，Ferrostatin-1作用于癌细胞，抑制Erast in诱导的胞楽和脂质ROS积累，进而抑制铁死亡。在新生大鼠大脑中，Ferrostatin-1抑制谷氨酸盐诱导的神经元铁死亡。此外，Ferrostat in_l不能抑制细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化或螯合铁，说明Ferrostat in_l抑制铁死亡不通过调控MEK/ERK通路、细胞铁水平或抑制蛋白合成。与生育酚等还原剂类似，Ferrostatin-1不稳定，容易被氧化成稳定的2，2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)。
[0004]铁是人体必需的微量元素之一，铁代谢平衡紊乱会导致严重的疾病。在铁过载时，细胞内过量的铁会通过Fenton反应产生大量氧化自由基，破坏蛋白质、核酸等细胞结构，导致细胞死亡。血色病(Hemochromatosis)又称遗传性血色病，是常见的慢性铁负荷增多的常染色体遗传疾病，表现为过多的铁储存于肝脏、心脏和胰腺等实质性器官，导致组织器官退行性病变，引发肝病、糖尿病、心脏病等慢性疾病。血色病通常由铁调素及其调控基因突变导致，目前治疗方法较为局限。
[0005]虽然铁在铁死亡过程中发挥重要作用，但目前还没有关于铁代谢与铁死亡的报道。铁代谢紊乱(尤其是铁过载)是否会导致Ferroptosis也不得而知。目前已知的铁死亡抑制剂有Ferrostatin-1、生育酸、β-巯基乙醇等，均未被使用或报道过用来治疗遗传性血色病等铁过载疾病。
[0006]因此，以铁死亡为靶点，通过铁死亡抑制剂靶向抑制铁过载引发的铁死亡，对遗传性血色病的治疗具有重要意义。

【发明内容】

[0007]本发明要解决的技术问题是提供铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在制备治疗铁过载疾病药物中的应用，为新药研发和创新疗法提供基础。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明提供一种铁死亡抑制剂在制备治疗铁过载疾病的药物中的应用，该铁死亡抑制剂为Ferrostatin-1。
[0009]在发明过程中，发明人发现铁过载会导致铁死亡。根据文献报道，小分子化合物Ferrostatin-1是铁死亡特异性抑制剂。发明人发现在小鼠肝原代细胞中，Ferrostatin-1能明显抑制铁离子刺激导致的铁死亡。通过对野生型小鼠饲喂高铁饲料诱导铁过载，Ferrostatin-1处理能明显抑制铁过载导致的铁死亡。进一步通过血色病小鼠模型证实，Ferrostatin-1能明显抑制铁过载导致的铁死亡，但并不改变小鼠的组织铁含量。该研究结果为Ferrostat in-Ι改善铁过载疾病提供了理论依据，特别是对遗传性血色病的药物研发提供了基础。
[0010]铁死亡抑制剂Ferrostatin-1在治疗铁过载疾病时，其用法和用量为:每天肌肉注射或静脉滴注ferrostatin-l(lmol/kg体重)，2周为一疗程。
[0011]综上所述，本发明提供了铁死亡抑制剂在治疗铁过载疾病中的应用，具体的，所述铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可用于制备治疗遗传性血色病(HereditaryHemochromatosis)并发症的药物，或者预防补铁时铁死亡毒性的补充剂。本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了Ferrostatin-1在抑制膳食性铁过载和遗传性血色病中的铁死亡过程，为以铁死亡为靶点的铁过载疾病的治疗提供了理论依据，特别是对遗传性血色病的药物研发提供了基础。
【附图说明】
[0012]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0013]图1为Ferrostatin-1体外抑制铁过载引发的铁死亡；
[0014]A:空白处理(Con)、柠檬酸铁FAC(10yM)、柠檬酸铁FAC(10yM)加二甲基亚砜(DMSO)、柠檬酸铁FAC(10yM)加Ferrostatin-1 (2μΜ)，柠檬酸铁FAC(10yM)加DFO(1yM)，柠檬酸铁FAC(10yM)加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(10yg/mL)，柠檬酸铁FAC(10yM)加坏死抑制剂Necrostat in-1 (10yg/mL)共处理小鼠肝原代细胞12小时，对细胞脂质过氧化的抑制效果;
[0015]B:空白处理(Con)、柠檬酸铁FAC(10yM)、柠檬酸铁FAC(10yM)加二甲基亚砜(DMSO)、柠檬酸铁FAC(10yM)加Ferrostatin-1 (2μΜ)，柠檬酸铁FAC(10yM)加DFO(1yM)，柠檬酸铁FAC(10yM)加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(10yg/mL)，柠檬酸铁FAC(10yM)加坏死抑制剂Necrostatin-1(10yg/mL)共处理小鼠肝原代细胞12小时，对细胞Ptgs2 mRNA表达的抑制效果。
[0016]图2为Ferrostatin-1腹腔给药能抑制小鼠膳食铁过载导致的铁死亡；
[0017]A:高铁饲料饲喂8周，Ferrostatin-1 (Ferr-1，每天lmol/kg体重)腹腔注射2周，C57BL/6小鼠肝脏Ptgs2mRNA表达水平；
[0018]B:高铁饲料饲喂8周，Ferrostatin-l(Ferr_l，每天lmol/kg体重)腹腔注射2周，C57BL/6小鼠肝脏非血红素铁含量。
[0019]图3为Ferrostatin-1腹腔给药能抑制血色病小鼠中的铁死亡并改善肝损伤；
[0020]A:Ferrostatin-l (Ferr-1，每天lmol/kg体重)腹腔注射2周，Smad4f/f和Smad4Alb/A1M、鼠肝脏Ptgs2 mRNA表达水平；
[0021 ] B: Ferrostatin-l (Ferr-1，每天lmol/kg体重)腹腔注射2周，Smad4f/f和Smad4Alb/A1M、鼠肝脏非血红素铁含量。
[0022]C: Ferrostatin-l (Ferr-1，每天lmol/kg体重)腹腔注射2周，Smad4f/f和Smad4Alb/A1M、鼠血清ALT活性。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0024]实施例1:
[0025]1.材料和方法
[0026]1.1实验原料制备
[0027]化合物单体Ferrostatin-l、DFO、Z-VAD-FMK、Necrostatin_l和朽1檬酸铁均购自SIGMA公司。Ferrostatin-l、DF0、Z_VAD-FMK、Necrostatin_l溶于无菌二甲基亚讽DMSO中，柠檬酸铁溶于磷酸盐缓冲液中，配置成所需浓度。
[0028]1.2小鼠肝原代细胞
[0029]小鼠肝原代细胞通过II型胶原酶缓冲液灌流法从C57BL/6小鼠肝脏中获得。培养条件:含10%FBS(GIBC0)的DMEM高糖型培养基(GIBC0)，37°C，5%C02饱和湿度培养箱。待细胞贴壁后，在培养基中分别加入磷酸盐缓冲液PBS，柠檬酸铁(ΙΟΟμΜ，终浓度，下同)，柠檬酸铁(ΙΟΟμΜ)+凋亡抑制剂(10yg/mL)，柠檬酸铁(ΙΟΟμΜ)+坏死抑制剂(10yg/mL)，柠檬酸铁(100yM)+Ferrostatin-l(2yM)。处理 12小时后，收集细胞，进行Real-time PCR(见1.3)和细胞膜脂质过氧化水平测定(见1.4)。
[0030]1.3RNA提取和Real-time PCR
[0031 ] Trizol(Life Techno1gies)法提取细胞和组织的RNA，具体操作按说明书进行。Nanodrop lOOOSpectrophotometer上检测RNA纯度(00260/00280^?= 1.9-2.1)及RNA浓度(ng/μ?)，调整RNA浓度到lyg/μ?。
[0032]2.0yg RNA经DNase (Promega)处理后，]\1_]\11^反转录酶(？1'01116 8&)和01丨80((1丁)18primer(Takara B1 Inc.)进行反转录。CFX96Real_Time System(B1-Rad)中进行Real-time PCR检测Ptgs2mRNA水平，检测体积为1ul，试剂米用iQ SYBR Green Supermix(B1-Rad)，引物序列如下:
[0033]mouseActb(P-actin):
[0034]forward:AAATCGTGCGTGACATCAAAGA
[0035]reverse:GCCATCTCCTGCTCGAAGTC
[0036]mouse Ptgs2:
[0037]forward:CTGCGCCTTTTCAAGGATGG
[0038]reverse:GGGGATACACCTCTCCACCAo
[0039]1.4细胞膜脂质过氧化水平测定
[0040]贴壁的小鼠肝原代细胞用胰酶消化成单细胞悬液。Cll-BODIPY(1yM)室温避光孵育30分钟，PBS洗3次，流式细胞仪检测。C11-B0DIPY购自Invitrogen。
[0041 ] 1.5实验动物
[0042]3周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，SPF环境饲养。标准饲料AIN-76A(铁含量50mg/Kg，Research Diets，Inc)适应喂养一周后，按体重随机分组，每组6?8只。根据实验设计，对照组用基础饲料喂养8周；高铁组用高铁饲料喂养8周；治疗组用高铁饲料(铁含量8.3g/Kg,Research Diets，Inc)喂养8周，最后2周每隔一天腹腔注射Ferrostatin-l (lmol/kg体重)。5 %水合氯醛腹腔麻醉后，心脏采血，分离血清，并收集肝脾肾组织(液氮保存)，检测肝损伤指标(见1.6)和肝脏Ptgs2表达量(方法同1.3)。
[0043]1.6肝损伤指标的检测
[0044]临床上常用血清中谷氨酸-丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性来衡量肝损伤水平。血清ALT活性检测使用上海申索佑福医学诊断用品有限公司的丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒，检测方法依照说明书。
[0045]1.7统计方法
[0046]所用统计采用R软件分析，实验数据以Mean± SD表示。细胞和动物实验的组间比较采用Tukey ’ s检验(ANOVA)，两组间比较以Student ’ s t_test检验，以P〈0.05认为有统计学意义。
[0047]2.结果
[0048]2.1 Ferrostatin-l在小鼠肝原代细胞中抑制铁过载导致的铁死亡
[0049]分离商品化C57BL/6小鼠的肝原代细胞并体外培养，在培养基中分别加入磷酸盐缓冲液I3BS，柠檬酸铁FAC( ΙΟΟμΜ，终浓度，下同)，柠檬酸铁FAC( ΙΟΟμΜ)+凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(10yg/mL)，柠檬酸铁 FAC(10yM)+坏死抑制剂Necrostatin-1 (10yg/mL)，柠檬酸铁 FAC(100yM)+Ferrostatin-l (2μΜ)。12小时后，检测铁死亡指标，包括细胞膜脂质过氧化和Ptgs2 mRNA水平。每个处理设3个复孔，实验重复三次。
[0050]实验发现柠檬酸铁刺激能显著上调细胞膜脂质过氧化水平和Ptgs2mRNA表达，说明体外铁过载会引发铁死亡。铁离子螯合剂DFO和Ferrostatin-l处理能明显抑制铁对脂质过氧化和Ptgs2表达量的上调，而凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和坏死抑制剂Necrostatin_l处理则没有抑制作用。这说明Ferrostatin-l在体外水平能抑制铁过载导致的铁死亡。
[°°511 2.2 Ferrostatin-l抑制膳食铁过载导致的铁死亡
[0052]4周龄的C57BL/6雄性小鼠随机分成3组，分别饲喂标准饲料(铁含量50mg/kg，Research Diets, Inc)8周、高铁饲料(铁含量8.3g/kg，Research Diets, Inc)8周、高铁饲料8周加最后2周腹腔注射Ferrostatin-l (每天lmol/kg)，检测肝脏Ptgs2mRNA水平和肝脏非血红素铁含量。
[0053]结果显示，高铁饲料饲喂能明显上调肝脏非血红素铁含量和Ptgs2mRNA水平，说明体内水平铁过载也会导致铁死亡。Ferrostatin-l联合处理能明显抑制高铁膳食对Ptgs2表达的上调，说明Ferrostatin-l在体内水平能抑制铁过载导致的铁死亡。同时，高铁饲料与Ferrostatin-l联合处理组同高铁饲料单独处理组相比，肝脏非血红素铁含量没有明显差异，说明Ferr ο s tat i η-1抑制铁死亡的同时，并不影响机体的铁代谢水平。
[0054]铁剂补充目前常在临床上用于治疗缺铁性贫血，但铁的过量摄入会导致铁死亡。该研究提示，铁剂可以与Ferrostatin-l联合使用，在不影响补铁效果的同时，降低铁的铁死亡毒性。
[0055]2.3 Ferrostatin-l缓解血色病小鼠的表型
[0056]遗传性血色病是常见的铁过载疾病。Smad4肝脏特异敲除小鼠(Smad4Alb/Alb)的表型与发病机制与遗传性血色病相似。6周龄的雄性Smad4Alb/Alb小鼠给予腹腔注射Ferrostatin-l (lmol/kg每天)，2周后检测肝脏非血红素铁含量、血清ALT活性和Ptgs2mRNA水平。
[0057]结果显示，与对照小鼠(Smad4fl°x/fl°x)相比，Smad4Alb/Alb小鼠的肝脏铁含量、Ptgs2mRNA水平明显上升，说明血色病小鼠中存在铁死亡。给予Ferrostatin_l处理后，肝脏Ptgs2表达量明显下降，说明Ferrostatin-l能抑制血色病小鼠中的铁死亡。血色病模型中，铁过载会导致肝损伤，进而引发一系列并发症。本底状态下，Smad4Alb/Alb小鼠的血清ALT水平较SmacMfzMnIl明显升高；对Smad4AllVA1M、鼠给予Ferrostatin-l处理后，血清ALT水平明显下降至对照小鼠水平，说明通过F err ο s tat i η-1革El向抑制铁死亡能明显改善了血色病小鼠的病理状态。
[0058]基于此，Ferrostatin-l抑制铁过载导致铁死亡是治疗铁过载相关疾病(血色病)的治疗方法。
[0059]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.铁死亡抑制剂在制备治疗铁过载疾病的药物中的应用，该铁死亡抑制剂为Ferrostatin-10
【文档编号】A61P3/12GK105943530SQ201610307748
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】王福俤, 王浩, 闵军霞
【申请人】浙江大学