一种asbel抑制剂及其在治疗三阴性乳腺癌药物中的应用
【专利摘要】本发明一种ASBEL抑制剂及其在治疗三阴性乳腺癌药物中的应用，具体为一种抑制人BTG3基因天然反义转录物ASBEL的反义寡聚核苷酸及其应用。该抑制剂特异性结合天然反义转录物ASBEL，解除其对BTG3蛋白表达的抑制作用，从而有效抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和迁移等。本发明的抑制剂不仅限于所述的修饰方法，任何可以有效防止其降解的修饰方法都是有效的。
【专利说明】
一种ASBEL抑制剂及其在治疗三阴性乳腺癌药物中的应用
技术领域：
[0001 ]本发明涉及一种ASBEL抑制剂及其在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。本发 明还涉及含有该抑制剂的药物组合物。
【背景技术】：
[0002] 癌症是一种恶性疾病。由于各种致癌因素的作用，机体细胞发生增殖调控的异常， 一旦其无法得到有效地控制，就可能导致癌症的发生。这些致癌因素多种多样，有些来自机 体自身的基因突变，有些来自于环境中的有毒有害物质，还有一些来自于其他疾病，等等。 细胞内基因表达量出现紊乱被证实是癌细胞的一大特征，而人为地对某些关键基因表达量 进行控制，可能会恢复癌细胞的凋亡过程或抑制其增殖的能力，从而使癌症得到控制。
[0003] 三阴性乳腺癌是一种以ER(雌激素受体）、PR(孕激素受体）以及HER2(人表皮胜正 因子受体2)均为阴性为特征的乳腺癌亚型。三阴性乳腺癌恶性度很高，易发生转移，预后 差，且当前没有特有的针对性治疗指南。目前主要的治疗手段仍然是放疗、化疗及手术切除 治疗，复发风险较大。乳腺癌已经成为当今世界上女性癌症发病率最高的一种，而三阴性乳 腺癌又是乳腺癌各个亚型中最为危险的。从基因的角度找到能治疗三阴性乳腺的全新的有 效药物，具有十分重要的意义。
[0004] 人类全基因组中只有2%的DNA序列编码蛋白，而其余的大部分DNA序列，可以转录 出非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。这些ncRNA对于细胞信号的传递，代谢及增殖水平 调控，蛋白表达量的控制等等方面都有着重要的作用。ncRNA的种类多种多样，其中长度在 200nt以上的被称为长非编码RNA( long non-coding RNA，lncRNA)。目前已经发现的IncRNA 已经有超过三千种，它们的作用机制不尽相同，可以通过表观遗传调节，转录调节和转录 后调节等方式去调控靶点的活性。IncRNA中有一类被称为天然反义转录物（nature antisense transcripts，NATs)，它们一般从基因的反义链上转录，并通过与信使RNA (message RNA，mRNA)形成杂交而抑制mRNA的翻译过程。ASBEL(antisense ncRNA in the ANA/BTG31ocus)是NATs类别中的一种，长度约为2kb，基因位于人21号染色体。它通过与 BTG3的mRNA形成杂交，阻止其出细胞核进入胞浆，从而降低了细胞中抑癌蛋白BTG3的表达 量（Satoshi Yanagida,Kenzui Taniue,Hironobu Sugimasa,et al.ASBEL,an ANA/ BTG3antisense transcript required for tumorigenicity of ovarian carcinoma[J] ? Scientific Reports，2013;3:1305·)〇
[0005] 研究表明，癌细胞的增殖、代谢、迀移、侵袭等过程的失调与IncRNA的表达异常有 关。针对表达异常的IncRNA进行人为纠正，可能会恢复癌细胞的程序性凋亡或抑制其生长， 从而对癌细胞的发展进行有效地控制。当前对于IncRNA的研究还不够全面和深入，而针对 IncRNA的癌症治疗将是一个很有发展前景的方向。
【发明内容】
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[0006] 本发明提供了一种ASBEL抑制剂在制备治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。
[0007] 1. 一种ASBEL抑制剂，其特征在于，所述ASBEL抑制剂具有与天然反义转录物ASBEL 有16个连续的核苷酸互补的序列。
[0008] 2.所述抑制剂为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者肽核酸。
[0009] 3.所述抑制剂为脱氧核糖核苷酸时，序列为-CGGTCTGGGCCGCCGA-3 ' ；所述抑制剂 为核糖核苷酸时，序列为5 ' -CGGUCUGGGCCGCCGA-3 '。
[0010] 4.所述抑制剂进一步被修饰。所述修饰选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰 中的一种或几种的组合。
[0011] 5.所述修饰选自硫代修饰、2 甲氧基修饰、锁核酸修饰和胆固醇修饰中的一种 或几种。
[0012] 6.所述的抑制剂用于制备治疗与BTG3低表达相关疾病的药物的用途。
[0013] 7.所述抑制剂可与其他治疗药物联合施用。例如阿霉素。
[0014] 8.所述BTG3低表达相关疾病为乳腺癌，优选为三阴性乳腺癌。
[0015] 9. -种药物组合物，含有所述的抑制剂以及药学上可接受的载体。例如脂质体类 纳米载体。
[00?6]本发明中所述ASBEL抑制剂(命名为antago34)为一条长度为16nt的反义寡脱氧核 苷酸链，序列为5 ' -CGGTCTGGGCCGCCGA-3 '。所述ASBEL抑制剂用于制备治疗三阴性乳腺癌药 物。
[0017] 进一步，所述三阴性乳腺癌为三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231。
[0018] 本发明设计的反义寡脱氧核苷酸antag〇34,其序列具有特异性生物学活性，所以 任何增加反义寡脱氧核苷酸稳定性的修饰都可以适用。本发明中所述antago34在其5'端和 3 '端分别进行3个碱基的硫代磷酸化修饰。
[0019] 本发明的上述antag〇34被转染进入MDA-MB-231细胞中后，能有效的诱导细胞凋 亡，且可观察到细胞增殖减慢，迀移率下降。
【附图说明】：
[0020] 图1A表明ASBEL抑制剂(antago34)对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响。其中， antagoNC组为阴性对照，siASBEL组为靶向ASBEL的siRNA，Lipo组为转染时只加入lipo， Blank组为不做任何处理的空白对照。
[0021] 1B图表明PS (硫代磷酸化修饰)和LNA(锁核酸修饰)修饰的antago34，在不同浓度 下对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响。
[0022] 图2A、B表明antago34对人乳腺癌细胞MDA-MB-231中BTG3基因的mRNA和蛋白水平 的影响。其中，GAPDH为蛋白内参。
[0023] 图3A、B表明antago34对人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响。
[0024] 图4表明antago34对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迀移能力的影响。
【具体实施方式】：
[0025]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但列举这些实施例只是起说明作 用，本发明的保护范围并不仅限于此。
[0026] 实施例1:合成ASBEL抑制剂、阴性对照及siRNA
[0027] 反义寡脱氧核苷酸链ASBEL抑制剂（即antag〇34)，由上海生工生物工程股份有限 公司合成，其序列为5'-0661'(^666(^6(^64-3'，其中第1、2、3、14、15、16位碱基间进行硫代 磷酸化修饰。阴性对照（a n t a g ο N C )的碱基修饰方式完全一样，其序列为5 ' -TCCACGCGCAGTACAA-3 '。上述序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。锁核酸修饰 的antag〇34,由上海辉睿生物科技有限公司合成，其序列、阴性对照的序列以及修饰的位置 和数量，与上述硫代磷酸化修饰完全相同。
[0028] 靶向ASBEL的siRNA序列为5'-GCAAACGTTTCTAGGAACA-3'，由广州市锐博生物科技 有限公司合成。
[0029]实施例2:ASBEL抑制剂对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的抑制作用 [0030] 在96孔板中培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231，细胞培养基为添加了 10%胎牛血清 (Gibco)(指胎牛血清在培养基中所占体积为10%，下同）的DMEM培养基(Gibco)。待细胞汇 合度在40% (指每孔中贴壁细胞所占面积占底面积40%，下同）时，使用lipofectamine2000 (Invitrogen)进行转染，ASBEL抑制剂（即antago34)、阴性对照antagoNC以及siASBEL的浓 度均为ΙΟΟηΜ，以每孔0.25μ1的lipofectamine2000的用量准备转染液，用不含血清的Opti-MEM培养基(Gibco)进行稀释。按照说明书进行孵育和转染后，在条件为37 °C、5 %⑶2(指C02 在孵箱中的气体中所占体积比为5%，下同）的细胞培养箱中进行培养，分别在24小时、48小 时和72小时取出，使用CCK8细胞增殖检测试剂盒(东仁化学科技有限公司)进行检测。
[0031] 结果见图1。结果显示相比于对照，antago34能有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的 增殖。
[0032] 硫代磷酸化和锁核酸修饰作用效果比较:在96孔板中培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231，细胞培养基为添加了 10%胎牛血清(6丨1^〇)的01^1培养基(6丨1^〇)。待细胞汇合度在 40%时，使用 lipofectamine2000( Invitrogen)分别转染浓度为 50nM、100nM 和200nM 的硫代 磷酸化修饰的antago34以及锁核酸修饰的antago34。转染分别用两种修饰方法修饰的阴性 对照antagoNC，浓度均为100nM。以每孔0· 25μ1的lipofectamine2000的用量准备转染液，用 不含血清的Opti-ΜΕΜ培养基(Gibco)进行稀释。按照说明书进行孵育和转染后，在条件为37 °C、5%C0 2的细胞培养箱中进行培养，在48小时取出，使用CCK8细胞增殖检测试剂盒（东仁 化学科技有限公司)进行检测。
[0033]结果见图1B。结果显示采用锁核酸修饰的antago34与硫代磷酸化修饰的antago34 相比，作用效果类似，随着药物浓度的增加，对细胞的增殖抑制效果更加明显。并且两种修 饰对细胞均没有非特异性的毒性作用。
[0034] 实施例3: ASBEL抑制剂对人乳腺癌细胞MDA-MB-231内BTG3基因表达的影响
[0035] 在6孔板中培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231，细胞培养基为添加了 10 %胎牛血清 (Gibco)的DMEM培养基（Gibco)。待细胞汇合度在40%左右时，使用1丨？(^6(^3111丨1162000 (Invitrogen)进行转染。共设三组，分别转染100nM antago34,100nM antagoNC以及不添加 任何药物的空白对照组。转染时每孔的lip〇fectamine2000的用量为5μ1，用不含血清的 Opti-MEM培养基(Gibco)进行稀释。按照说明书进行孵育和转染后，在条件为37 °C、5 %⑶2 的细胞培养箱中进行培养，48小时后收取蛋白和RNA。
[0036] Western Blot检测：收取6孔板中的细胞，用RIPA细胞裂解液冰上充分裂解，离心 后收取上清蛋白溶液。使用BCA蛋白定量试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司）进行蛋白 浓度测定，根据浓度进行稀释并加入5X蛋白上样缓冲液，混合均匀后煮沸十分钟变性，-20 °(：冻存待用。进行Western Blot检测时，每组样品取20yg蛋白溶液，使用12%聚丙烯酰胺凝 胶进行电泳。电泳结束后，进行半干法转膜将蛋白转印到PVDF膜上。在室温条件下，使用 5%脱脂奶粉(指lOOmllXTBS溶液中加入溶解5g脱脂奶粉)进行封闭，在水平摇床上封闭4 小时。用TBST溶液(含0 · 1 %吐温20(指100ml 1 X TBS溶液中加入0 · lml吐温20)的TBS溶液)洗 净膜后，将膜置于用TBST溶液稀释的一抗中，稀释倍数根据抗体的说明书要求(BTG3-抗购 自Abcan^GAFOH-抗购自Cell Signaling Technology)。静置于4°C冰箱过夜。第二天取出 用TBST溶液洗净膜，置于暗盒中并加入相应的荧光二抗。在室温避光的条件下，水平摇床上 放置45分钟，TBST溶液洗净膜并使用双色红外激光成像系统(Odyssey)进行扫描成像。 [0037] Realtime PCR检测:使用Paris Kit试剂盒(Ambion)从6孔板的细胞中提取总RNA。 经过紫外分光光度计进行定量后，使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa)进行反转录反应，使用SYBR Premix DimerEraser?试剂盒（TaKaRa)进行 Realtime PCR反应，检测转染antago34后细胞内ASBEL和BTG3的mRNA水平的变化。所用仪器 为ABI ViiA? 7实时荧光定量PCR仪。
[0038] 结果见图2A、B。结果显示转染antago34后，BTG3的mRNA和蛋白的表达量均有所增 尚。
[0039] 实施例4: ASBEL抑制剂对人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响
[0040]用同样的转染方法分别将antag〇34和antagoNC转染进人乳腺癌细胞MDA-MB-231。 转染48小时后，使用AnnexinV，FITC凋亡检测试剂盒(东仁化学科技(上海)有限公司）进行 处理，并使用流式细胞仪(BD)进行检测。
[0041 ]结果见图3A、B。结果显示转染随着转染antag〇34的浓度升高，人乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡比例逐渐升高。
[0042] 实施例5 :ASBEL抑制剂对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迀移能力的影响
[0043]用同样的转染方法分别以100nM的浓度将antag〇34和antagoNC转染进人乳腺癌细 胞MDA-MB-231，24小时后收取细胞，加入无血清DMEM培养基(Gibco)进行重悬并调整细胞浓 度至5 X 105个/ml的浓度，使用Transwell (Corning)进行细胞迀移能力检测。在Transwell 小室内加入细胞上述细胞悬液200μ1，在外室内加入700μ1含10 %FBS(Gibco)的DMEM培养 基。在条件为37 °C、5 % C02的细胞培养箱中进行培养24小时后取出，用PBS清洗并用棉签擦 去小室内层细胞，用4 %多聚甲醛室温固定15分钟后用PBS洗净，再在室温下用0.025 %结晶 紫（指100ml水中溶解0.025g结晶紫）染色10分钟，弃染液用PBS洗净，在显微镜下用明场进 行观察。
[0044] 结果如图4。结果显示在转染antag〇34后，人乳腺癌细胞MDA-MB-231的迀移能力得 到了明显抑制。
【主权项】
1. 一种ASBEL抑制剂，其特征在于，所述ASBEL抑制剂具有与天然反义转录物ASBEL有16 个连续的核苷酸互补的序列。2. 如权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷 酸或者肽核酸。3. 如权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为脱氧核糖核苷酸时，序列为 5 ' -CGGTCTGGGCCGCCGA-3 ' ；所述抑制剂为核糖核苷酸时，序列为5 ' -CGGUCUGGGCCGCCGA-3 '。4. 如权利要求1~3中任一项所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂进一步被修饰。5. 如权利要求4所述的抑制剂，其特征在于所述修饰选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨 架修饰中的一种或几种的组合。6. 如权利要求5所述的抑制剂，其特征在于，所述修饰选自硫代修饰、2 甲氧基修饰、 锁核酸修饰和胆固醇修饰中的一种或几种。7. 如权利要求1~6中任一项所述的抑制剂用于制备治疗与BTG3低表达相关疾病的药 物的用途。8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸与其他治疗药物联合施 用。9. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述BTG3低表达相关疾病为乳腺癌。10. -种药物组合物，其特征在于权利要求1~6中任一项所述的抑制剂以及药学上可 接受的载体。
【文档编号】A61K31/7088GK105969770SQ201610320390
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月15日
【发明人】盛望, 夏阳, 邓雄威, 肖向茜, 张芳, 周韶梅, 曾毅
【申请人】北京工业大学