针对组织因子途径抑制剂的前体药物抗体的制作方法
【专利说明】
[0001] 背景 根据37 C.F.R. 1.821 (C)，随同提交作为ASCII标准文本文件的序列表，所述ASCII 标准文本文件命名为"BAYRP0004W0_ST25.txt"，于2014年3月14日创建，并且具有~312 千字节的大小。前述文件的内容在此整体引入作为参考。
[0002] 本申请要求于2013年3月15提交的美国临时申请序列号61/794, 024的优先权 利益，所述美国临时申请的完整内容在此引入作为参考。
[0003] I.技术领域
技术领域涉及血友病及其他凝血病的治疗。
[0004] II.相关技术 血液凝固是通过其血液形成稳定血块以止血的过程。该过程涉及在血液中循环的许多 酶原和促辅因子（procofactor)(或"凝血因子")。这些酶原和前辅因子通过几种途径相互 作用，它们通过所述途径相继或同时转换为活化形式。最终，该过程导致在因子Va、离子钙 和血小板的存在下，凝血酶原通过活化因子X (FXa)活化为凝血酶。活化凝血酶进而诱导 血小板聚集，并且将纤维蛋白原转换成纤维蛋白，其随后通过活化因子XIII (FXIIIa)交联 以形成血块。
[0005] 导致因子X活化的过程可以通过两个不同途径进行：接触活化途径（以前称为内 源性途径）和组织因子途径（以前称为外源性途径)。先前认为凝血级联由与共同途径连接 的具有相等重要性的两个途径组成。目前已知用于起始血液凝固的主要途径是组织因子途 径。因子X可以被与活化因子VII (FVIIa)组合的组织因子（TF)活化。因子Vila及其必 需辅因子TF的复合物是凝血级联的有力引发剂。
[0006] 凝血的组织因子途径受组织因子途径抑制剂（〃TFPI〃）负面控制。TFPI是FVIIa/ TF复合物的天然FXa依赖性反馈抑制剂。它是多价Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的成员。 生理学上，TFPI与活化因子X (FXa)结合，以形成异二聚复合物，其随后与FVIIa/TF复合 物相互作用，以抑制其活性，因此关闭凝血的组织因子途径。原则上，阻断TFPI活性可以恢 复FXa和FVIIa/TF活性，因此延长组织因子途径的作用持续时间且扩大FXa的生成，所述 FXa是血友病A和B中的共同缺陷。
[0007] 事实上，一些初步实验证据已指示通过针对TFPI的抗体阻断TFPI活性使延长的 凝血时间标准化或缩短出血时间。例如，Nordfang等人显示在用针对TFPI的抗体处理血 衆后，血友病血衆的延长稀释凝血酶原时间被标准化//aewosi·，1991，66 (4): 464-467)。类似地，Erhardtsen等人显示血友病A兔模型中的出血时间被抗TFPI抗体显 著缩短（扮ooi/ 388-394)。这些研究提不通过抗 TFPI抗体抑制TFPI可以用于治疗血友病A或B。仅多克隆抗TFPI抗体用于这些研究中。
[0008] 使用杂交瘤技术，制备且鉴定针对重组人TFPKrhTFPI)的单克隆抗体。参见Yang 等人，Oi/?. ifeoi ^，1998,111(8): 718-721。测试单克隆抗体对稀释凝血酶原时间（PT) 和活化部分促凝血酶原时间（APTT)的作用。实验显示抗TFPI单克隆抗体缩短因子IX缺 乏血浆的稀释凝血酶凝血时间。提示组织因子途径不仅在生理学凝血中，还在血友病的出 血中起重要作用（Yang 等人，及《a/? /i 心 /? Λ/e Λ/e 你〇，1997,22 (4) : 297-300)。
[0009] 授予Kjalke等人的美国专利号7, 015, 194公开了包含FVIIa和TFPI抑制剂的组 合物，所述TFPI抑制剂包括多克隆或单克隆抗体或其片段，用于治疗或预防出血发作或凝 血治疗。还公开了此类组合物降低正常哺乳动物血浆中的凝血时间的用途。进一步提出因 子VIII或其变体可以包括在公开的FVIIa和TFPI抑制剂的组合物中。未提出FVIII或因 子IX与TFPI单克隆抗体的组合。除用于血友病的治疗之外，还已提出TFPI抑制剂包括多 克隆或单克隆抗体可以用于癌症治疗(参见授予Hung的美国专利号5, 902, 582)。
[0010] 相应地，需要对于TFPI特异性的改善抗体用于治疗血液学疾病和癌症。
[0011] 公开内容概述 因此，依照本公开内容，提供了包含下述的抗体：（a)含有第一轻链可变区和第一重链 可变区的第一可变结构域，所述第一可变结构域与组织因子途径抑制剂（TFPI)免疫学结 合；（b)与第一轻链可变区和/或第一重链可变区的氨基末端连接的掩蔽结构域；和（C)介 于第一轻链可变区和/或第一重链可变区和掩蔽结构域之间的蛋白酶可切割接头。蛋白酶 可切割结构域可以是凝血酶、纤溶酶、因子Vila或因子Xa切割位点。掩蔽结构域可以包含 第二可变结构域，其包含第二轻链可变区和第二重链可变区。抗体可以是IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgM、IgAU IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗体。抗体可以是人或人源化抗体，和/或 单链抗体。抗体可以是：二价的且包含两个掩蔽结构域，一个连接至每个第一轻链可变区的 氨基末端；或二价的且包含两个掩蔽结构域，一个连接至每个第一重链可变区的氨基末端； 或二价的且包含四个掩蔽结构域，一个连接至每个第一轻链可变区和每个第一重链可变区 的氨基末端，例如其中掩蔽结构域中的两个是第二轻链可变区，并且掩蔽结构域中的两个 是第二重链可变区，其中第二轻链可变区和第二重链可变区形成第二可变结构域。第二可 变结构域可以与组织因子（TF)、红细胞或白蛋白结合。掩蔽结构域可以是白蛋白结合蛋白。 抗体可以与人组织因子途径抑制剂的Kunitz结构域2结合。
[0012] 还提供的是包含处于启动子的控制下的关于如上所述的抗体的编码区的表达载 体，以及包含此类表达载体的细胞。还提供的是包含用药学可接受的缓冲液、载体或稀释剂 配制的如上所述的抗体的药物制剂。
[0013] 在另一个实施方案中，提供的是治疗对象中的凝血障碍的方法，其包括以有效促 进对象中的凝血的量给对象施用包含下述的抗体：（a)含有第一轻链可变区和第一重链可 变区的第一可变结构域，所述第一可变结构域与组织因子途径抑制剂（TFPI)免疫学结合； (b)与第一轻链可变区和/或第一重链可变区的氨基末端连接的掩蔽结构域；和（C)介于 第一轻链可变区和/或第一重链可变区和掩蔽结构域之间的蛋白酶可切割接头。蛋白酶可 切割结构域可以是凝血酶、纤溶酶、因子Vila或因子Xa切割位点。掩蔽结构域可以包含第 二可变结构域，其包含第二轻链可变区和第二重链可变区。抗体可以是IgGU IgG2、IgG3、 IgG4、IgM、IgAU IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗体。抗体可以是人或人源化抗体，和/或 单链抗体。抗体可以是：二价的且包含两个掩蔽结构域，一个连接至每个第一轻链可变区的 氨基末端；或二价的且包含两个掩蔽结构域，一个连接至每个第一重链可变区的氨基末端； 或二价的且包含四个掩蔽结构域，一个连接至每个第一轻链可变区和每个第一重链可变区 的氨基末端，例如其中两个掩蔽结构域是第二轻链可变区，并且两个掩蔽结构域是第二重 链可变区，其中第二轻链可变区和第二重链可变区形成第二可变结构域。第二可变结构域 可以与组织因子（TF)、红细胞或白蛋白结合。掩蔽结构域可以是白蛋白结合蛋白。对象可 以是人或非人哺乳动物。对象可以患有创伤、血友病(例如血友病A或B)或癌症。抗体可 以全身施用，或者局部或区域性施用于出血部位。抗体可以皮下、静脉内或动脉内施用。抗 体可以与人组织因子途径抑制剂的Kunitz结构域2结合。
[0014] 考虑本文描述的任何方法或组合物可以对本文描述的任何其他方法或组合物而 言应用。
[0015] 当与术语"包含"结合用于权利要求和/或说明书中时，单词"一个"或"一种"的 使用可以意指"一个/种"，但它还与"一个或多个/ 一种或多种"、"至少一个/种"和"一个 或超过一个/ 一种或超过一种"的含义一致。
[0016] 考虑在本说明书中讨论的任何实施方案均可对本发明的任何方法或组合物而言 应用，并且反之亦然。此外，本发明的组合物和试剂盒可以用于实现本发明的方法。
[0017] 本申请自始至终，术语"约"用于指示，该值包括关于装置、用于测定值的方法的固 有误差变异，或在研究对象中存在的变异。
[0018] 附图简述 下述附图构成本说明书的部分，并且包括以进一步证实本公开内容的某些方面。通过 参考与本文呈现的具体实施方案的详细描述组合的这些附图中的一个或多个，公开内容可 以得到更好理解。
[0019] 图1.抗TFPI前体药物抗体及其如何在体内起作用的实施方案的举例说明。
[0020] 图2.抗TFPI前体药物抗体的潜在掩蔽策略的举例说明。
[0021] 图3A-B. TF结合前体药物的载体图，其中针对TFPI和TF的可变区是串联连接 的。（图3A)HCl-pTTF5 gA200抗TFPI前体药物抗体片段的载体图。（图3B)LCl-pTTF 641 抗TFPI前体药物抗体片段的载体图。
[0022] 图4A-C. TF结合前体药物和RBC结合前体药物的载体图，其中针对TF或RBC的 scFv在抗TFPI抗体的重链的氨基末端上连接。（图4A)pQMl-3E10sc-gA200HC抗TFPI前 体药物抗体片段的载体图。（图4B) pQMl-T119sC-gA200HC抗TFPI前体药物抗体片段的载 体图。（图4C) pQMl/gA200LC抗TFPI前体药物抗体片段的载体图。
[0023] 图5A-B.白蛋白结合前体药物的载体图。（图5A)pQMl-56E4-gA200H抗TFPI前体 药物抗体片段的载体图。（图5B) pQMl-56E4-gA200L抗TFPI前体药物抗体片段的载体图。
[0024] 图6.使用考马斯染色，以及在不含二硫苏糖醇（DTT)的非还原条件和含DTT的还 原条件下，3E10-scFv-gA200 和 Terll9-scFv-gA200 抗 TFPI IgG 的 SDS-PAGE0
[0025] 图7.相对于天然gA200,测定56E4-gA200的结合亲和力的TFPI结合ELISA的曲 线。
[0026] 图8.作为抗体浓度的函数，与RBC结合的Terll9sc_gA200的曲线。
[0027] 图9.在人血清白蛋白（HSA)的存在或不存在下，关于不同抗TFPI前体药物抗体 和未经修饰的抗TFPI抗体gA200与TFPI的相对结合百分比的BIAC0RE?测量结果的曲线。
[0028] 图10A-G.(图10A)作为抗TFPI前体药物抗体、56E4-gA200和抗TFPI抗体gA200 的抗体浓度的函数的峰凝血酶曲线。（图10B)作为抗TFPI前体药物抗体、56E4-gA200和 抗TFPI抗体gA200的不同浓度的函数的凝血酶生成曲线，显示在每个抗体浓度产生的凝血 酶浓度。（图10C)前体药物TPP-2654与其亲本抗体gA200的凝血酶生成概况的比较，所 述TPP-2654可以通过凝血酶和FXa活化两者进行活化。通过添加外源凝血酶，随后添加水 蛭素以使加入的凝血酶失活，来评价凝血酶活化ΤΡΡ-2654的能力。对照包括其中加入缓冲 液代替凝血酶的反应。（图10D)显示了活化前体药物ΤΡΡ-2654所需的凝血酶的滴定。测 试的凝血酶浓度为在生理学上潜在可达到的范围内。（图10Ε)间接评价FXa活化前体药物 ΤΡΡ-2654的能力。FXa和凝血酶水平通过增加用于起始TGA反应的TF浓度得到增加。通 过比较外源凝血酶增强ΤΡΡ-2654应答的能力与通过FXa和凝血酶活化两者实现的那些，可 以衡量FXa活化前体药物的相对贡献。（图10F)显示了通过单独的凝血酶活化的前体药物 ΤΡΡ-2654的凝血酶生成。此处，滴定研究指示前体药物ΤΡΡ-2654需要~2. 5 U/mL凝血酶， 以转换为活性TFPI Ab。（图10G)在TF滴定实验结果中，可以观察到TPP-2652对FXa的相 对不敏感性。与设计为通过FXa和凝血酶活化两者活化的ΤΡΡ-2654形成对比，TPP-2652显 示在使用的更高TF剂量下在凝血酶生成中的更少增加（比较图IOG与图10Ε)。
[0029] 图11.不同浓度的白蛋白对抗TFPI前体药物抗体和未经修饰的抗TFPI抗体的作 用的曲线。
[0030] 图12.可以组合以制备根据本公开内容的抗TFPI前体药物抗体的重链和轻链的 序列。
[0031] 图13.根据本公开内容的抗TFPI前体药物抗体的重链和轻链的序列。
[0032] 图14Α-Β.根据本公开内容的抗TFPI前体药物抗体的所选重链（图14Α)，以及重 链和轻链（图14Β)的氨基末端序列。
[0033] 图15Α.在人或猴白蛋白的不存在或存在下，白蛋白结合抗TFPI前体药物的TFPI 结合(表面等离子体共振-