抗lag-3结合蛋白的制作方法
【专利说明】抗LAG-3结合蛋白 发明领域
[0001] 本发明涉及结合淋巴细胞活化基因（LAG-3)且引起表达LAG-3的活化的T细胞的 耗竭的抗原结合蛋白，特别是抗体，编码此类抗原结合蛋白的多核苷酸，含有所述抗原结合 蛋白的药物组合物，和所述抗原结合蛋白在治疗和/或预防与致病性T细胞的参与相关的 疾病中的用途。
[0002] 发明背景 淋巴细胞活化基因-3 (LAG-3)是调节T细胞稳态、增殖和活化的负共刺激受体（Sierro S等人；Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15:91-101)。免疫球蛋白超家族成员，LAG-3 是⑶4样蛋白，其，像⑶4,结合至MHC II类分子，但与⑶4相比亲和力高两倍且位点不同 (Huard B 等人，（1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:5744-9)。除了施加非常不同的 功能（CD4是正共刺激分子）以外，两种受体也被差异调节。CD4在所有成熟CD4+ T细胞 的表面上组成型表达，其中仅小部分驻留于细胞内，而大部分LAG-3分子保留于细胞中接 近于微管组织中心，且仅诱导随后抗原特异性T细胞活化（Woo SR等人，（2010) Eur J Immunol 40:1768-77)。LAG-3作为T-细胞应答的负调节剂的作用基于用LAG-3敲除小鼠的 研究和在体外和体内系统模型中使用阻断性抗LAG-3抗体（Sierro S等人，Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101; Hannier S 等人（1998)，J Tmmunol 161: 4058-65; Macon-Lemaitre L等人（2005)，Immunology 115: 170-8; Workman CJ等人（2003)，Eur J Tmmunol 33:970-9)。
[0003] 在细胞表面，LAG-3被表达为二聚体，这对于形成稳定的MHC II类结合位点是 需要的（Huard B 等人（1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 5744-9)。可溶形式的 LAG-3也存在于健康供体和结核病和癌症患者的血清中（Lienhardt C等人（2002)，Eur J Immunol 32: 1605-13; Triebel F 等人（2006) .Cancer Lett 235: 147-53)，且该形式可 以与 LAG-3+ T 细胞的数目相关（Siawaya J 等人（2008). J of Infection 56: 340-7)。 LAG-3作为增强的淋巴细胞耗竭剂的目标抗原的关键属性是其当与目前在临床上的其他药 剂（即，Campath? (T/B 细胞）、Amevive (最多 CD45R0+ T-细胞）或 Rituxan (B-细胞）） 相比时的相对选择性表达概况。很少分子已经被鉴定为人中的体内T细胞活化的持续标 志物。这些包括 LAG-3、0X40、MHC II 类、CD69、CD38、ICOS 和 CD40L。然而，除了 LAG-3 和 0X40以外，这些分子中的大多数也在人天然T regs或其他细胞类型上组成型表达。LAG-3 表达于健康人中的小比例的T细胞（约1-4%)和类似比例的NK细胞中（Baixeras E等人 (1992)，J Exp Med 176: 327-37; Huard B 等人（1994)，Immunogenetics 39: 213-7)〇用抗⑶3活化后，约30-80%的⑶4+和⑶8+ T细胞在24至48小时之内表达LAG-3 ;该百分 比在 IL2、IL7 和 IL12 存在的情况下增加 （Sierro S 等人，Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101; Bruniquel D 等人（1998)，Immunogenetics 48: 116-24)。用回忆 抗原（即，CMV或破伤风类毒素）抗原特异性刺激之后，大多数活化的T细胞是LAG-3+。此 外，在人中，LAG-3表达于健康人血液中的CD4+ CD25+ FoxP3+ T regs的亚群（1-10%)上。 该群体似乎在体外通过细胞接触和ILlO依赖性机制是功能抑制的，因此，可以代表最近活 化的天然或诱导的 T regs 的群体[Camisaschi C, Casati C, Rini F 等人（2010) .LAG-3 expression defines a subset of CD4+CD25highFox3P + regulatory T cells that are expanded at tumour sites. J. Immunol 184: 6545-51)。LAG-3 已经在造血谱系的其他细 胞类型（诸如浆细胞样树突细胞、B细胞和NKT细胞）上，但仅在小鼠中，且主要在活化之 后，被检测到（Sierro S, Romero P & Speiser D; Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101)。
[0004] LAG-3+ T细胞的耗竭可用于治疗或预防T细胞驱动的免疫炎性病症。在其中 大多数自体反应细胞在疾病部位被自身抗原长期活化和/或在外周重新循环的自身免疫 疾病中，耗竭性抗原结合蛋白的短时程可以选择性耗竭该自身免疫性T细胞库，提供长期 缓解。该方法的优先性已经用泛淋巴细胞耗竭性抗体Campath?得到证明，其中在多发性 硬化症试验中，单一 12mg注射与标准治疗相比使复发率降低74% (The CAMMS223 Trial Investigators (2008)，N Engl JMed. 359:1786-801)。由于 LAG-3 与 CD52 (Campath? 的目标）相比更选择性的表达，所以对幼稚和静息记忆性T细胞和自然T regs库的影响应 当减少。预计这导致改善的治疗指数、维持效力，但感染和恶性肿瘤以及与Campath?相关 的自身免疫的发生的风险降低。此外，在狒狒结核菌素皮肤攻击模型中，LAG-3靶向嵌合抗 体IMP731在外周中和皮肤攻击部位处均介导LAG-3+ T-细胞的耗竭，导致结核菌素皮肤攻 击响应的降低（Poirier N 等人（2011)，Clin Exp Tmmunol 164: 265-74)。在进一步研 究中，LAG-3多克隆抗体从大鼠心脏同种异体移植物中耗竭LAG-3+浸润性T细胞且延长这 些移植物的存活（Haudebourg T 等人（2007)，Transplantation 84: 1500-1506)。
[0005] 本领域需要结合LAG-3且引起LAG-3+活化的T细胞的耗竭的抗原结合蛋白，特别 是人源化抗体，其可用于治疗自身免疫疾病，诸如银肩病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发 性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮（SLE)、SjSgren氏综合征、多发性硬化、溃疡性结肠炎和 自身免疫性肝炎；感染性疾病、过敏性疾病和癌症。
[0006] 发明概述 本发明广泛涉及抗原结合蛋白，诸如人源化的抗体，其结合淋巴细胞活化基因 3(LAG-3)，且能够引起LAG-3+活化的T细胞的耗竭。更具体地，本发明的抗原结合蛋白可 以包含 SEQ ID No. 5 的 CDRL1、CDRL2 和 CDRL3。
[0007] 本文描述的抗原结合蛋白可以用于治疗或预防与致病性T细胞的参与相关的疾 病，例如自身免疫疾病，诸如银肩病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系 统性红斑狼疮（SLE)、SjSgren氏综合征、多发性硬化、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎；感 染性疾病、过敏性疾病和癌症。因此，本发明进一步涉及包含根据本发明的抗原结合蛋白和 任选一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物。
【附图说明】
[0008] 图1 :抗体与表达LAG-3的EL4 (A)和活化的人⑶3+ T细胞⑶的结合。Synagis， 针对无关目标的单克隆抗体，用作阴性对照。
[0009] 图2 :腹膜内施用的无岩藻糖基化的抗体H5L7BW对注射后24小时从腹膜腔取回 的共同施用的活化的人PBMC的影响。A)共同施用I X IO7个活化的人PBMC和5mg/kg对照 抗体（H5L7BW或Campath?)之后24小时的人CD4+LAG-3+和CD8 +LAG-3+ T细胞的定量（供体 A :对照 n=2 ;H5L7BW n=2，MabCampath n=l ;供体 B :对照 n=2 ;H5L7BW n=3，Campath? n=2)。 B)总 CD4+和 CD8+T 细胞的定量。（*ρ〈0·001)。
[0010] 图3 :无岩藻糖基化的抗体H5L7BW及其非ADCC增强的变体H5L7对腹膜内共同施 用且在注射后5小时从腹膜腔取回的活化的人PBMC的影响。Α)共同施用I X IO7个活化 的人PBMC和5mg/kg对照抗体（H5L7BW或H5L7)之后5小时的人CD4+LAG-3+和CD8 +LAG-3+T细胞的定量（n=3/组）。抝总⑶4+和⑶8+T细胞的定量。（*p〈0. 001)。
[0011] 图4 :将人活化的PBMC施用于SCID小鼠的腹膜中之前18小时静脉内施用的无 岩藻糖基化的抗体H5L7BW的影响。A) i.p.注射5 X IO6个（n=l/组）或I X IO7个0/N (n=4/组）活化的人PBMC之后5小时的人⑶4+LAG-3+和⑶8 +LAG-3+T细胞的定量。B)总 CD4+和CD8+ T细胞的定量。注射活化的人PBMC之前18小时静脉内注射5mg/kg H5L7BW或 对照抗体。（*Ρ〈〇· 001，# Ρ=〇· 0052)。
[0012] 图5 :将活化的人PBMC施用于SCID小鼠的腹膜中之前18小时静脉内施用的 H5L7BW、H5L7 或頂 Ρ731 (5mg/kg)的影响。A) i.p.注射 I X IO7 个（η=4/组）活化的人 PBMC之后5小时的人⑶4+LAG-3+和⑶8 +LAG-3+T细胞的定量。注射人PBMC之前18小时静脉 内注射5mg/kg H5L7BW、H5L7、頂P731或对照抗体。B)总CD4+和CD8+ T细胞的定量。注射 活化的人PBMC之前18小时静脉内注射5mg/kg LAG-3耗竭性抗体或对照抗体。（*p〈0. 001)。
[0013] 发明详述 本发明广泛涉及结合淋巴细胞活化基因3(LAG-3)的抗原结合蛋白，且更具体地，可以 引起LAG-3+活化的T细胞的耗竭的抗原结合蛋白。
[0014] 如本文所使用的术语"抗原结合蛋白"是指能够结合LAG-3的抗体及其片段。除 非另外指明，如本文所使用的术语"LAG-3"是指淋巴细胞活化基因3。术语"LAG-3"在其 范围内包括，但不限于作为例如活化的T细胞、NK细胞和B细胞的表面上的二聚物表达的 LAG-3(在本领域中也已知为，例如，CD223)，和例如人血清中发现的LAG-3的可溶形式，在 本文中称为"sLAG-3"。除非另外指明，本文提及"sLAG-3"和"LAG-3"是人多肽。在一个具 体实施方案中，本发明提供了能够结合作为例如活化的T细胞、NK细胞和B细胞的表面上 的二聚物表达的LAG-3的形式（在本领域中也已知为，例如，CD223)的抗原结合蛋白。更 具体地，本发明涉及能够结合活化的T细胞上表达的LAG-3且能够引起所述活化的T细胞 的耗竭的抗原结合蛋白。
[0015] 在一个方面，本发明提供了能够结合LAG-3且包含来自SEQ ID No. 5的⑶RLl (其 中位置27E是脯氨酸）的抗原结合蛋白。
[0016] 在一个进一步方面，本发明提供了包含SEQ ID NO. 1的⑶RLl的抗原结合蛋白。
[0017] 在一个进一步方面，本发明提供了能够结合LAG-3且包含来自SEQ ID No. 5的 ⑶RLl的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包含来自SEQ ID NO. 5的⑶RL2和 /或⑶RL3或其⑶R变体。
[0018] 在一个进一步方面，本发明提供了进一步包含SEQ ID NO. 2的⑶RL2和/或SEQ ID NO. 3的⑶RL3或其⑶R变体的抗原结合蛋白。
[0019] 在一个进一步方面，本发明提供了能够结合LAG-3且包含来自SEQ ID No. 5的 ⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3的抗原结合蛋白。
[0020] 在一个进一步方面，本发明提供了包含来自SEQ ID NO 10的⑶RH1、⑶RH2和 CDRH3或其CDR变体中的一种或多种的抗原结合蛋白。
[0021] 在另一个方面，本发明提供了包含来自SEQ ID NO. 5的⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3和 来自SEQ ID NO: 10的CDRH1、CDRH2和CDRH3的抗原结合蛋白。
[0022] 在一个进一步方面，本发明提供了包含选自SEQ ID NO. 6的CDRH1、SEQ ID NO. 7的⑶RH2和SEQ ID NO. 8的⑶RH3的一个或多个⑶R或其⑶R变体的抗原结合蛋白。
[0023] 在一个进一步方面，本发明提供了包含以下CDR的抗原结合蛋白： CDRLl: SEQ ID NO. 1 CDRL2: SEQ ID NO. 2 CDRL3: SEQ ID NO. 3 CDRHl: SEQ ID NO. 6 CDRH2: SEQ ID NO. 7 CDRH3: SEQ ID NO. 8。
[0024] 在另一个方面，本发明提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含来自SEQ ID NO. 5的⑶RLl、⑶RL2和⑶RL3的可变轻链，和包含来自SEQ ID NO: 10的⑶RHl、⑶RH2和 ⑶RH3的可变重链。
[0025] 在一个具体方面，所述抗原结合蛋白是人源化抗体，任选为IgG。
[0026] 如本文所使用，术语"⑶R"是指抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些 是免疫球蛋白重和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链 CDRs (或 CDR 区）。
[0027] 对于本领域技术人员显而易见的是，存在⑶R序列的多种编号常规；Chothia (Chothia 等人（1989) Nature 342: 877-883)、Kabat (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed. , U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987))、AbM (University of Bath) 和 Contact (University College London)。用 Kabat、Chothia、AbM 和接触方法中的至少 两种可以测定最小重叠区，以提供"最小结合单元〃。最小结合单元可以是CDR的亚部分。 抗体的结构和蛋白折叠可以意指其他残基是CDR序列的考虑部分，并且将由技术人员理解 为这样。
[0028] 除非另有说明和/或不存在具体鉴定的序列，本文提及"⑶R"、"⑶RL1"、"⑶RL2"、 " CDRL3 "、" CDRH1"、" CDRH2 "、" CDRH3 "是指根据表1中鉴定的任何已知规则编号的氨基酸序 列。在一个具体实施方案中，利用的编号规则是Kabat规则。本文提及"位置27E"是指使 用Kabat编号规则定义的轻链可变结构域中的位置27E存在的氨基酸。技术人员将理解， 该位置具有根据其他已知规则（诸如，例如，Chothia)的等效物，其中位置27E等效于位置 30B〇
[0029] 下表1代表使用每种编号规则对每个CDR或结合单元的一种定义。应该注意，一 些CDR定义可以根据所用的单独出版物而变化。
[0030] 轰1
[0031] 如本文使用的术语"⑶R变体"是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取 代、缺失或添加的CDR，其中修饰的包含CDR变体的抗原结合蛋白基本上保留了抗原结合蛋 白修饰前的生物学特性。应当理解的是，可以单独或与另一个CDR组合修饰可以修饰的每 个CDR。在一个方面，所述修饰是取代，特别是保守取代，例如如表2中显示。
[0033] 例如，在变体⑶R中，最小结合单位的氨基酸残基可以维持相同，但包含⑶R作为 Kabat或Chothia定义的部分的侧翼残基可以被保守的氨基酸残基取代。
[0034] 包含如上所述的修饰的CDR或最小结合单位的此类抗原结合蛋白在本文中可以 被称为"功能性CDR变体"或"功能性结合单位变体"。
[0035] 本发明的抗原结合蛋白能够结合sLAG-3。在一个方面，抗原结合蛋白-sLAG-3相 互作用的平衡解离常数（KD)为IOnM或更小，诸如InM或更小，例如IpM至300、400、500pM 或500pM至InM。技术人员将理解KD数值越小，结合就越强。KD的倒数（8卩，1/KD)是具有 单位M1的平衡结合常数（KA)。技术人员将理解，KA数值越大，则结合越强。
[0036] 在一个方面，本发明提供了能够以小于InM、例如IpM至300pM的KD (当分别使用 SEQ ID N0:51和52的重组人或食蟹猴LAG-3细胞外结构域（E⑶）通过Biacore?表面等 离子共振分析来测定时）结合重组LAG-3的抗