的试剂盒根据各制造商 的具体说明从在实验的第5天制备的PBMC纯化自体供体NK细胞。将纯化的NK细胞计数 且在培养基中稀释至I. 3xl06/mL的密度。
[0193] 将已经用抗原刺激5天的细胞洗涤，计数且在培养基中稀释至2x106/活细胞/mL 的密度。
[0194] 将自体供体NK细胞（80 μ L)和抗原活化的细胞（100 μ L)移取至具有测试抗体或 培养基（20 μ L)的圆底5mL聚苯乙烯FACS管中。测试的抗LAG-3抗体的最终浓度范围为 1000至0. 015ng/mL。将样品在5% C02润湿培养箱中在37°C孵育18小时。18小时之后， 使用流式细胞术分析ADCC测定样品的抗原特异性LAG-3阳性T细胞的存在。简而言之，将 样品在FACS缓冲液中洗涤，用人IgG(3 μ g/管）封闭，且与小鼠抗人CD4、CD8、CD337、CD25 和LAG-3荧光染料（flurochrome)缀合的抗体在黑暗中在室温孵育30分钟。在PBS中进一 步洗涤步骤之后，将细胞在可固定绿色死细胞存在的情况下在黑暗中在室温孵育30分钟。 将样品最终用PBS洗涤，固定，且通过流式细胞术使用60秒采集时间以1 μ L/秒的流速进 行分析。
[0195] 使用具有FACS Diva软件6. 1. 3版本的BD FACSCanto II流式细胞仪（BD BioSciences采集所有样品数据。活/死可固定绿色死细胞染色用作死细胞排除标志物， 且适当的同种型和FM0-1对照用于定义阴性群体。简而言之，使用前向散射（FSC-A)针对 FLl (绿色死细胞染色）中的荧光的图从分析省略死细胞。然后使用FSC-W针对FSC-H的图 从分析中排除双重峰。随后使用前向散射（FSC-A)针对侧向散射（SSC-A)的图鉴定和门控 活单淋巴细胞。分别使用⑶4荧光针对SSC-A和Violet Dye荧光针对⑶4荧光的图从该 门控的细胞群体鉴定CD4抗原特异性T细胞。通过Violet Dye荧光的降低鉴定抗原特异 性CD4 T细胞。绘制CD25荧光针对LAG-3荧光的进一步图以证实该细胞群体的活化状态 和它们表达LAG-3。绘制类似的图以鉴定抗原特异性⑶8 T细胞。
[0196] 记录每种样品中存在的抗原特异性⑶4和⑶8 T细胞的百分比（作为活淋巴细胞 群体的百分比）。绘制这些数据的非线性可变斜率曲线-拟合，且使用GraphPad Prism软 件（v5. 03)生成EC50值。
[0197] 为了计算测定中观察到的耗竭的最高水平，以测试的抗体的最高浓度，使用下式： (1-(%抗体处理之后剩余的抗原特异性T细胞）八％在抗体不存在的情况下剩余的抗原特 异性T细胞））*100。
[0198] 使用上面详述的体外测定系统生成H5L7BW和H5L7耗竭LAG3阳性抗原特异性 CD8和CD4 T细胞的功效数据。H5L7BW在针对各细胞类型的消失研究的七个供体中的六个 中诱导了 ADCC对LAG3阳性抗原特异性⑶4和⑶8 T细胞的耗竭。H5L7BW在抗原特异性 ⑶4 T细胞中的功效，如EC50值所定量，范围为14pg/mL至3. 4ng/mL，其中最高耗竭水平范 围为44至78%。该抗体在抗原特异性LAG-3阳性⑶8 T细胞中的功效范围为122pg/mL至 17. 5ng/mL，其中最高耗竭水平范围为39至87%。在研究的供体中，H5L7介导低耗竭水平， 或者是无活性的。
[0199] 实施例7:在体内人PBMC/小鼠 SCID异种務棺樽铟中评价H5L7BW和H5L7的耗竭 活件 该测定描述了使用人PBMC /小鼠 SCID异种移植模型以评价单克隆、完全人源化、无岩 藻糖基化的LAG-3耗竭性抗体H5L7BW对活化的人T细胞的体内耗竭效力。分离健康志愿 者外周血单核细胞（PBMC)且刺激过夜（抗⑶3, IL-12)，以诱导LAG-3表达，然后注射至免 疫受损的SCID小鼠的腹膜中。将LAG-3耗竭性或对照抗体共同施用至腹膜中或静脉内注 射。
[0200] 在细胞注射后5或24小时通过流式细胞术评价腹膜灌洗液样品中的LAG-3阳性 细胞的耗竭。
[0201] 通过腹膜内途径用活化的huPBMC(0. 4ml PBS中的4 X 106- 2 X 107个细胞）注 射小鼠。根据具体的研究途径，LAG-3抗体或huIgGl BioWa对照用huPBMC i.p.共同施用， 或将小鼠静脉内预处理，18小时之后注射huPBMC。细胞注射后5或24小时，使小鼠安乐死， 进行腹膜灌洗，且通过流式细胞术分析灌洗缓冲液的细胞含量。简而言之，腹腔灌洗涉及使 用含有3mM EDTA的冷PBS 3 X 5ml洗涤完整腹腔。
[0202] 使用具有FACS Diva软件6. L 3版本的BD FACSCanto II流式细胞仪（BD BioSciences采集所有样品数据。每个FACS管添加近似I X 106个细胞（在可能的情况 下），将细胞悬浮液以1500rpm离心10分钟，且然后将沉淀再悬浮于3ml PBS中。然后小 心地倾析上清液，且将细胞沉淀再悬浮于100 μ 1冷FACS洗涤缓冲液中。然后每个管添加 15 μ I FcR阻断剂，且将细胞在室温孵育10分钟。然后分别添加5 μ 1各染色抗体（10 μ 1 1:100预稀释的抗LAG-3阻断/检测抗体17Β4-ΡΕ)或同种型对照，且在室温在避光下孵育 20分钟。随后通过每个管添加4ml FACS缓冲液洗涤细胞，且以1500rpm离心5分钟，其后 小心地倾析上清液。重复该洗涤步骤。最后，将细胞再悬浮于300 μ I FACS缓冲液中，且通 过流式细胞术分析。除了通过使用荧光标记的LAG-3阻断性抗体17Β4-ΡΕ检测LAG-3,以下 T细胞和活化标志物用于分析T细胞表型：⑶45、⑶4、⑶8和⑶25。⑶4和⑶8 T细胞的百 分比表示为⑶45阳性细胞的百分比。LAG-3阳性T细胞群体表示为其亲本群体⑶4和⑶8 的百分比。
[0203] FACS Diva软件版本6. 1. 3用于生成单个细胞计数/事件和细胞群体的百分比的 批次分析。用SAS版本9. 2. 2软件使用用于二项式数据的广义线性模型分析数据。该分析 将细胞计数直接模拟为亲本群体的比例。以该方式，在分析过程中考虑亲本群体的大小。对 于各处理的目标细胞类型的比例计算平均值，连同95%置信区间。这些表示为百分比。
[0204] 使用几率比（odds ratios)进行处理相比于对照的计划比较。这将一种处理中具 有目标细胞类型的几率表示为与在对照处理上具有目标细胞类型的几率的比率。〈1的几率 比（odds ratio)将表明目标处理中与对照相比具有细胞类型的降低的几率。〈1的几率比 将表明目标处理中与对照相比具有细胞类型的降低的几率。
[0205] 所有实验使用来自个体健康供体的PBMC进行，并且由于每次实验需要大血液体 积，所以多于一次不使用供体。过夜刺激后的LAG-3表达水平在供体之间变化很大（范围 为2-73 %细胞表面表达），但这些表达水平的差异对测试抗体的高度显著的耗竭效力没有 影响。
[0206] 人PBMC/小鼠 SCID体内模型成功地用于显示免疫受损的SCID小鼠的腹膜中 的活化的人表达LAG-3的T细胞的耗竭。根据供体、施用途径和分析的时间点，耗竭了 84. 22-99. 71% 的 LAG-3 阳性人 CD4 T 细胞和 84. 64-99. 62% 的 LAG-3 阳性人 CD8 T 细胞。 如图2中所示，与对照IgG注射的动物相比，将5mg/kg H5L7BW共同施用于SCID小鼠的腹 膜中的活化的人PBMC导致注射后24小时LAG-3阳性的CD4和CD8阳性T细胞的高度显著 耗竭。
[0207] 图3突出共同i. p.施用于活化的人PBMC之后5小时5mg/kg H5L7BW和H5L7之 间的比较，如前所述。两种抗体诱导了 LAG-3阳性CD4和CD8 T细胞的高度显著耗竭（图 3A) 〇
[0208] 如图4中所示，经由静脉内途径施用5mg/kg H5L7BW导致5小时之后LAG-3阳性T 细胞的高度统计显著的耗竭（图4A)，其类似于在用i. p.共同施用的LAG-3耗竭抗体的实 验中观察到的结果。i. P.施用活化的人PBMC之后5小时的i. V.施用的H5L7BW、H5L7和 頂P731 (所有均为5mg/kg)之间的比较揭示与对照处理的动物相比3种分子之间非常类似 的耗竭效力（图5)。3种测试的LAG-3耗竭性抗体中的每种引起LAG-3阳性CD4和CD8 T 细胞的数目的高度显著降低（图5A)，其中H5L7BW与H5L7或頂P731相比表明更大的耗竭 能力。
[0209] 实施例8 :使用ProteOn ?分析抗LAG-3人源化抗体与重组可溶性人Fc γ受体的 结合 研究人Fc γ RIIIa结合，以评价H5L7和H5L7BW诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC)的能力。使用ProteOn? XPR36 (BioRad?)生物传感器机器评价H5L7和H5L7BW抗 LAG-3抗体与除了 Fc γ RI和Fc γ RII受体以外的重组可溶性人Fc γ RIIIa的结合，并且针 对嵌合抗体ΜΡ731进行比较。
[0210] 通过伯胺偶联将山羊抗多组氨酸IgG固定在GLM生物传感器芯片上。该表面用 作用于多组氨酸标记的人Fcy受体的捕获表面。待测试的抗体用作分析物且以2048ηΜ、 512ηΜ、128ηΜ、32ηΜ和8ηΜ通过，其中OnM的注射（即，单独的缓冲液）用于双重参考结合曲 线。在相互作用之间用IOOmM磷酸再生山羊抗多组氨酸IgG表面。在25°C且使用HBS-EP 作为运行缓冲液在ProteOn XPR36蛋白阵列相互作用系统上实施运行。设置总体R-max且 使用ProteOn的分析软件固有的平衡模型，分别分析每种受体的数据。在待测试的样品集 合的开始和结束时运行对照分子，以确保结果的可比性。比较来自两次实验和在实验之间 用作对照的杂交对照抗体的数据。
[0211] 结果显示，H5L7BW以与H5L7相比改善近似10倍的亲和力结合至Fc γ RIIIa的两 种多态型（缬氨酸V158和苯丙氨酸F158)(参见表6)。岩藻糖基化抗体H5L7以与嵌合抗 体頂Ρ731类似的亲和力结合至Fc γ Rllla。
[0212] 人源化的岩藻糖基化和无岩藻糖基化的抗LAG-3抗体对于Fe γ RI或Fe γ RIIa受 体的结合之间没有观察到显著变化。
[0213] 表6: H5L7和H5L7BW与人Fe Y夸体的结合
【主权项】
1. 抗原结合蛋白，其能够结合淋巴细胞活化基因3 (LAG-3)且包含来自SEQIDNo. 5 的CDRL1、CDRL2 和CDRL3。2. 根据权利要求1的抗原结合蛋白，其包含SEQIDNO. 1的⑶RLl。3. 根据权利要求1或2的抗原结合蛋白，其包含SEQIDNO. 2的⑶RL2和/或SEQID NO. 3的⑶RL3，或其⑶R变体。4. 根据权利要求1至3中任一项的抗原结合蛋白，其包含来自SEQIDNO. 10的 ⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3中的一者或多者。5. 根据权利要求1至4中任一项的抗原结合蛋白，其包含选自SEQIDNO. 6的⑶RH1、 SEQIDNO. 7 的CDRH2 和SEQIDNO. 8 的CDRH3 的一个或多个CDR。6. 根据权利要求1至5中任一项的抗原结合蛋白，其包含以下CDR: CDRLl: SEQIDNO. 1 CDRL2: SEQIDNO. 2 CDRL3: SEQIDNO. 3 CDRHl: SEQIDNO. 6 CDRH2: SEQIDNO. 7 CDRH3: SEQIDNO. 8。7. 根据权利要求1至6中任一项的抗原结合蛋白，其包含a)SEQIDNO. 4的可变轻 链（VL)和b)SEQIDNo. 9的可变重链（VH)。8. 根据权利要求1至7中任一项的抗原结合蛋白，当通过Biacore?表面等离子共振 分析来测定时，其能够以小于InM的KD结合SEQIDNO. 51的重组人LAG-3His。9. 抗原结合蛋白，当通过Biacore?表面等离子共振分析来测定时，其能够以小于InM 的KD结合SEQIDNO. 51的重组人LAG-3His。10. 根据权利要求1至9中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白能够结合活 化的T细胞上表达的LAG-3。11. 根据权利要求1至10中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白能够耗竭 LAG-3+活化的人T细胞。12. 根据权利要求11的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白能够在使用原代人T细 胞的体外测定中通过ADCC引起抗原特异性⑶4和/或⑶8LAG-3+人T细胞的大于40%耗 竭。13. 根据权利要求1至12中任一项的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人源化 抗体。14. 根据权利要求13的人源化抗体，其中所述人源化抗体包含人IgGl恒定区。15. 根据权利要求14的人源化抗体，其包含a)与SEQIDNO. 5具有至少97%同一性 的轻链序列，和b)与SEQIDNO. 10具有至少97 %同一性的重链序列。16. 根据权利要求15的人源化抗体，其包含a)SEQIDNO. 5的轻链序列，和b)SEQ IDN0. 10的重链序列。17. 根据权利要求14至16中任一项的人源化抗体，其为非岩藻糖基化的。18. 人源化抗体，其包含SEQIDNO. 4的可变轻链（VL)和SEQIDNO. 9的可变重链 (VH)，其中所述抗体在连接至Asn297的核心碳水化合物结构上不包含岩藻糖。19. 分离的核酸分子，其编码根据权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白或根据权 利要求14至18中任一项的人源化抗体。20. 表达载体，其包含根据权利要求19的核酸分子。21. 宿主细胞，其包含根据权利要求20的表达载体。22. 宿主细胞，其包含根据权利要求20的表达载体，其中编码a-1，6-岩藻糖基转移酶 的FUT8基因在宿主细胞中已经失活。23. 抗原结合蛋白，其由权利要求21或22的宿主细胞产生。24. 产生根据权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白或根据权利要求14至16中任 一项的人源化抗体的方法，其包括a)在适合于表达所述抗原结合蛋白或抗体的条件下培 养根据权利要求21的宿主细胞和b)分离所述抗原结合蛋白或抗体。25. 产生根据权利要求17或18的人源化抗体的方法，其包括a)在适合于表达所述抗 原结合蛋白或抗体的条件下培养根据权利要求22的宿主细胞，其中编码a-1，6-岩藻糖基 转移酶的FUT8基因在重组宿主细胞中已经失活，和b)分离所述抗体。26. 药物组合物，其包含a)根据权利要求1至13中任一项的抗原结合蛋白或根据权 利要求14至18中任一项的抗体，和b)药学上可接受的载体。27. 权利要求1至13中任一项中定义的抗原结合蛋白或权利要求14至18中任一项中 定义的人源化抗体在治疗中的用途。28. 权利要求1至13中任一项中定义的抗原结合蛋白或权利要求14至18中任一项中 定义的人源化抗体在治疗与致病性T细胞的参与相关的疾病中的用途。29. 根据权利要求28的抗原结合蛋白的用途，其中所述疾病是自身免疫疾病、感染性 疾病、过敏性疾病或癌症。30. 根据权利要求29的用途，其中所述自身免疫疾病选自银肩病、克罗恩病、类风湿性 关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮（SLE)、Sjogren氏综合征、多发性硬化症、 溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎。31. 治疗人或动物主体方法，其包括施用治疗有效量的权利要求1至13中任一项中定 义的抗原结合蛋白或权利要求14至18中任一项中定义的人源化抗体。32. 治疗人或动物主体中的与致病性T细胞的参与相关的疾病的方法，其包括施用治 疗有效量的权利要求1至13中任一项中定义的抗原结合蛋白或权利要求14至18中任一 项中定义的人源化抗体。33. 根据权利要求32的治疗方法，其中所述疾病是自身免疫疾病、感染性疾病、过敏性 疾病或癌症。34. 根据权利要求33的治疗方法，其中所述自身免疫疾病选自银肩病、克罗恩病、类风 湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮（SLE)、Sjogren氏综合征、多发性硬化 症、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎。
【专利摘要】结合淋巴细胞活化基因3(LAG-3)的抗原结合蛋白，和更具体地，引起LAG-3+活化的T细胞的耗竭的抗原结合蛋白。
【IPC分类】C07K16/28
【公开号】CN105209494
【申请号】CN201480028079
【发明人】P.A.汉布林, A.P.路易斯, T.M.韦布
【申请人】葛兰素史克知识产权开发有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年3月13日
【公告号】CA2902831A1, EP2970464A1, US20140286935, US20160017037, WO2014140180A1