原结合蛋白。
[0037] 此外，本发明的抗原结合蛋白还能够结合例如EL4细胞或活化的人CD3+ T细胞上 表达的LAG-3。
[0038] 本发明的抗原结合蛋白也能够耗竭LAG-3+活化的T细胞，特别是⑶4+LAG-3+和 ⑶8+LAG-3+ T细胞。LAG-3+ T细胞的耗竭可以通过，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒活 性（ADCC)和/或补体依赖性细胞毒活性（CDC)而发生。
[0039] 在一个方面，本发明提供了能够在使用原代人T细胞的体外测定中通过ADCC引起 抗原特异性〇04和/或008 1^6-3+人1'细胞的大于40%耗竭的抗原结合蛋白。
[0040] 在一个进一步方面，本发明提供了在0. lKg/mL的浓度能够在使用铕标记的表 达LAG-3的EL4细胞作为目标细胞和人PBMC作为效应物细胞的体外ADCC测定中引起大 于50%耗竭的抗原结合蛋白，其中效应物：目标比率不大于50:1且测定运行2小时的期 间。％细胞裂解基于从表达LAG-3的EL4细胞的铕释放来计算。
[0041] 在抗原结合蛋白的恒定区和多种Fc受体（FcR)(包括Fc γ RI (CD64)、Fc γ RII (CD32)和Fcy RIII (CD16))之间的相互作用被认为介导抗原结合蛋白的效应子功能诸如 ADCC和CDC。显著的生物学效应可以是效应子功能性的结果。通常，介导效应子功能的能 力要求抗原结合蛋白与抗原的结合，并且并非所有抗原结合蛋白都介导每种效应子功能。 [0042] 效应子功能可以以许多方法进行测量，包括例如经由本发明的抗原结合蛋白例 如抗体经由Fc γ RIII与天然杀伤细胞的结合或经由Fc γ RI与单核细胞/巨噬细胞的结 合，以测量ADCC效应子功能。例如，本发明的抗原结合蛋白可以在天然杀伤细胞测定中针 对ADCC效应子功能进行评价。此类测定的实例可见于Shields等人，2001 The Journal of Biological Chemistry，第 276 卷，第 6591-6604 页；Chappel 等人，1993 The Journal of Biological Chemistry，第 268 卷，第 25124-25131 页；Lazar 等人，2006 PNAS, 103; 4005-4010。
[0043] 测定⑶C功能的测定的实例包括在1995 J Imm Meth 184:29-38中所述的那些。
[0044] 在本发明的一个方面，所述抗原结合蛋白是抗体。
[0045] 如本文所使用的术语"抗体"是指具有免疫球蛋白样结构域的分子且包括单克隆 (例如，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)、重组、多克隆、嵌合、人源化、双特异性和异源缀合物抗 体；单一可变结构域（例如，VL)、结构域抗体（dAb?)、抗原结合片段、免疫学有效片段、Fab、 F(ab'）2、Fv、二硫键（disulphide)连接的Fv、单链Fv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连 接的scFv、双体、TANDABS ?等和任何前述的修饰版本（关于替代"抗体"形式的概述，参见 Holliger 和 Hudson, Nature Biotechnology, 2005，Vol 23，No. 9，1126-1136)。替代 抗体形式包括替代支架，其中根据本公开的任何分子的一个或多个CDR可以被布置至合适 的非免疫球蛋白蛋白支架或骨架（诸如亲和体（affibody)、SpA支架、LDL受体A类结构 域、亲合体（avimer))上（参见，例如，美国专利申请公开号2005/0053973、2005/0089932、 2005/0164301)或 EGF 结构域。
[0046] 在一个进一步方面，所述抗原结合蛋白是人源化抗体。
[0047] 〃人源化抗体〃是指工程改造的抗体类型，其具有源自非人供体免疫球蛋白的 CDR，所述分子剩余的源自免疫球蛋白的部分源自一个（或多个）人免疫球蛋白。此外，可 改变构架支持残基以保留结合亲和力（参见例如，Queen等人，Proc. Natl Acad Sci USA， 86:10029-10032 (1989)，Hodgson 等人，Bio/Technology, 9:421 (1991))。合适的人受 体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性选自以下常规数据库的抗 体：例如KABAT?数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库。特征为与供体抗体 构架区的同源性（基于氨基酸）的人抗体，可适于提供重链恒定区和/或重链可变构架区 用于插入供体CDR。可以相似的方式选择能够贡献轻链恒定区或可变构架区的合适的受体 抗体。应该注意，受体抗体重链和轻链不必源自相同受体抗体。现有技术描述了产生所述 人源化抗体的几种方式，参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。
[0048] 在又一个进一步方面，人源化抗体具有人抗体恒定区，其是IgGl，例如，SEQ ID No. 46的重链恒定区。
[0049] 应当理解的是，本发明进一步提供了人源化抗体，其包含a) SEQ ID NO. 5的轻链 序列或与任何 SEQ ID NO. 5 具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性 的轻链序列，和b) SEQ ID NO. 10的重链序列或与任何SEQ ID NO. 10具有至少75%、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性的重链序列。
[0050] 在一个进一步方面，本发明提供了人源化抗体，其包含a)与SEQ ID NO. 5具有至 少90%同一性的轻链序列，和b)与SEQ ID NO. 10具有至少90%同一性的重链序列。
[0051] 在一个进一步方面，本发明提供了人源化抗体，其包含a)与SEQ ID NO. 5具有至 少95%同一性的轻链序列，和b)与SEQ ID NO. 10具有至少95%同一性的重链序列。
[0052] 在又一个进一步方面，本发明提供了人源化抗体，其包含a)与SEQ ID NO. 5具有 至少97%同一性的轻链序列，和b)与SEQ ID NO. 10具有至少97%同一性的重链序列。
[0053] 在又一个进一步方面，本发明提供了人源化抗体，其包含a) SEQ ID NO. 5的轻链 序列，和b) SEQ ID NO. 10的重链序列。
[0054] 应当理解的是，本发明进一步提供了人源化抗体，其包含a) SEQ ID NO. 35的轻 链序列或与任何 SEQ ID NO. 35 具有至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一 性的轻链序列，和b) SEQ ID NO. 36的重链序列或与任何SEQ ID NO. 36具有至少75%、 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同一性的重链序列。
[0055] 在一个进一步方面，本发明提供了包含分别SEQ ID NO:35和36的CDRL1-L3和 CDRH1-H3的抗原结合蛋白。
[0056] 对于核苷酸和氨基酸序列，术语"相同的"或"同一性"表明当具有适当的插入或 缺失的情况下最佳比对和比较时两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。
[0057] 两条序列之间的同一性百分比是由序列共享的相同位置数目的函数（即％同一性 =相同位置数目/位置总数目乘以1〇〇)，考虑到缺口数目和每个缺口的长度，其需要被引 入用于两条序列的最佳比对。在两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以使用如 下文描述的数学算法完成。
[0058] 查询核酸序列和主题核酸序列之间的百分比同一性是表示为百分比的"同一性" 值，当主题核酸序列在进行成对BLASTN比对之后与查询核酸序列具有100%查询覆盖率 时，所述百分比通过BLASTN算法来计算。此类查询核酸序列和主题核酸序列之间的成对 BLASTN比对通过使用低复杂度区域的过滤器关闭的National Center for Biotechnology Institute网站上可得的BLASTN算法的默认设置来进行。重要地，查询核酸序列可以通过 本文的一个或多个权利要求中鉴定的核酸序列来描述。
[0059] 查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的百分比同一性是表示为百分比的"同 一性"值，当主题氨基酸序列在进行成对BLASTP比对之后与查询氨基酸序列具有100%查 询覆盖率时，所述百分比通过BLASTP算法来计算。此类查询氨基酸序列和主题氨基酸序 列之间的成对BLASTP比对通过使用低复杂度区域的过滤器关闭的National Center for Biotechnology Institute网站上可得的BLASTP算法的默认设置来进行。重要地，查询氨 基酸序列可以通过本文的一个或多个权利要求中鉴定的氨基酸序列来描述。
[0060] 产牛 通过用包含本发明的抗原结合蛋白的编码序列的表达载体转染宿主细胞，可以产生本 发明的抗原结合蛋白，例如抗体，诸如人源化抗体。通过将抗原结合蛋白的这些编码序列置 于与常规的调节控制序列的可操作关联下，产生表达载体或重组质粒，所述调节控制序列 能够控制在宿主细胞中的复制和表达和/或从宿主细胞的分泌。调节序列包括启动子序 列，例如CMV启动子和可以源自其他已知的抗体的信号序列。类似地，可以产生具有DNA序 列的第二表达载体，所述DNA序列编码互补的抗原结合蛋白轻链或重链。在某些实施方案 中，除了所涉及的编码序列和选择标记之外，这种第二表达载体与第一表达载体相同，以确 保尽可能地有功能地表达每条多肽链。或者，抗原结合蛋白的重链和轻链编码序列可以存 在于单一载体上。
[0061] 通过常规技术，用第一载体和第二载体共转染选定的宿主细胞（或仅用单一载体 转染），以生成包含重组的或合成的轻链和重链的本发明的转染的宿主细胞。然后通过常规 技术，培养转染的细胞，以产生本发明的工程改造的抗原结合蛋白。通过合适的测定，诸如 ELISA或RIA，从培养物筛选包括重组重链和/或轻链的结合体的抗原结合蛋白。可以采用 相似的常规技术，构建其他抗原结合蛋白。
[0062] 本领域技术人员可以选择适用于在本发明的方法和组合物构建中采用的克隆和 亚克隆步骤的载体。例如，可以使用常规的PUC克隆载体系列。一种载体pUC19可从供应点 商业获得，诸如 Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom)或 Pharmacia (Uppsala, Sweden)。另外，能够容易地复制的、具有丰富的克隆位点和选择基因（例如，抗生素抗性） 并且易于操作的任何载体，可以用于克隆。因而，克隆载体的选择不是本发明的限制因素。 [0063] 通过适用于扩增异源DNA序列的表达的基因，例如，哺乳动物二氢叶酸还原酶基 因（DHFR)，也可以表征表达载体。其他优选载体序列包括：聚腺苷酸（poly A)信号序列， 诸如来自牛生长激素（BGH)以及β珠蛋白启动子序列（betaglopro)。通过本领域技术人 员众所周知的技术，可以合成在本文中有用的表达载体。
[0064] 这些载体的组件，例如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等，可以从商 业来源或天然来源获得，或通过已知程序合成，用于指导重组DNA的产物在选定的宿主中 的表达和/或分泌。为了这个目的，也可以选择其他合适的表达载体，其中许多类型在本领 域已知用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达。
[0065] 本发明还涵盖用含有本发明的抗原结合蛋白的编码序列的重组质粒转染的细胞 系。对于这些克隆载体的克隆和其他操作而言有用的宿主细胞也是常规的。然而，来自各 种大肠杆菌菌株的细胞可以用于克隆载体的复制和本发明的抗原结合蛋白的构建中的其 他步骤。
[0066] 适用于表达本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞或细胞系包括：哺乳动物细胞诸如 NSO、Sp2/0、CHO (例如DG44)、COS、HEK、成纤维细胞（例如，3T3)和骨髓瘤细胞，例如它可 以在CHO或骨髓瘤细胞中表达。可以使用人细胞，因而允许分子用人糖基化模式来修饰。 或者，可以采用其他真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择，以及用于转化、培养、扩 增、筛选和产物产生和纯化的方法，是本领域已知的。参见，例如，以上引述的Sambrook等 人。
[0067] 可以证明，细菌细胞可用作宿主细胞，其适合表达本发明的重组Fab或其他实施 方案（参见，例如，PlUckthun, A.，Immunol. Rev.，130: 151-188 (1992))。但是，由于在 细菌细胞中表达的蛋白倾向于未折叠的形式或不正确地折叠的形式或非糖基化形式，必须 筛选在细菌细胞中产生的任何重组Fab，以保留抗原结合能力。如果细菌细胞表达的分子以 适当地折叠的形式产生，该细菌细胞将是期望的宿主，或者，在可替代的实施方案中，可以 在细菌宿主中表达分子，然后随后进行重新折叠。例如，用于表达的各种大肠杆菌菌株，是 生物技术领域中众所周知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、链霉菌属、其他芽孢杆菌属等的各种 菌株，也可以用于该方法中。
[0068] 如果需要，本领域技术人员已知的酵母细胞菌株以及昆虫细胞，例如果蝇和 鳞翅目昆虫和病毒表达系统，也可用作宿主细胞。参见例如，Miller等人，Genetic Engineering, 8:277-298，Plenum Press (1986)和其中引用的参考文献。
[0069] 可通过其构建载体的一般方法、产生本发明宿主细胞所需要的转染方法和从所述 宿主细胞产生本发明抗原结合蛋白必需的培养方法，可以全部是常规技术。本发明培养方 法通常是无血清培养方法，通常通过无血清悬浮培养细胞。同样地，一旦产生本发明抗原结 合蛋白，可将其根据本领域标准程序从细胞培养内容物纯化出，所述标准程序包括硫酸铵 沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。这类技术在本领域技术范围内，不限定本发明。例如， 在TO 99/58679和WO 96/16990中描述了改变的抗体的制备。
[0070] 表达抗原结合蛋白的又另一种方法可以利用在转基因动物中的表达，诸如美国专 利号4, 873, 316中所述。这涉及利用动物酪蛋白启动子的表达系统，当其被转基因地并入 哺乳动物中时，允许雌性动物在其奶中产生希望的重组蛋白。
[0071] 在本发明的进一步方面，提供了产生本发明的抗原结合蛋白（例如人源化抗体） 的方法，所述方法包括培养用编码本发明抗体的轻链和/或重链的载体转化或转染的宿主 细胞和回收由此产生的抗原结合蛋白的步骤。
[0072] 根据本发明，提供了产生本发明的抗LAG-3抗原结合蛋白（例如人源化抗体）的 方法，所述抗LAG-3抗原结合蛋白与人LAG-3结合，所述方法包括以下步骤； (a) 提供编码抗体的重链的第一载体； (b) 提供编码抗体的轻链的第二载体； (c) 用所述第一载体和第二载体转化哺乳动物宿主细胞（例如CH0); (d) 在有助于所述抗体从所述宿主细胞分泌进所述培养基中的条件下，培养步骤（C) 的宿主细胞； (e) 回收步骤（d)的分泌的抗体。
[0073] 抗原结合蛋白一旦通过所需方法表达，就可以通过利用适当的测定检查其体外活 性，诸如Biacore?表面等离子共振分析，以评价抗原结合蛋白与LAG-3的结合。此外，其他 体外和体内测定也可以用于测定抗原结合蛋白引起表达LAG-3的细胞（诸如活化的人T细 胞群体）的耗竭的能力。
[0074] 技术人员将理解，在产生抗原结合蛋白诸如抗体（特别是根据使用的细胞系和抗 原结合蛋白的具体氨基酸序列）之后，翻译后修饰可发生。例如，这可以包括某些前导序 列的切割、在多种糖基化和磷酸化模式中的多种糖部分的添加、脱酰胺、氧化、二硫键混杂 (disulfide bond scrambling)、异构化、C末端赖氨酸剪切和N末端谷氨酰胺环化。本发 明涵盖已实施或已经历一种或多种翻译后修饰的抗原结合蛋白的用途。因此，本发明的"抗 原结合蛋白"或"抗体"分别包括"抗原结合蛋白"或"抗体"，如先前所定义，其已经经历翻 译后修饰，诸如如本文所述。
[0075] 在其恒定区中的保守位置处的抗体糖基化已知对抗体功能特别是效应子功能具 有深远作用，参见例如Boyd等人（1996)Mol. Immunol. 32:1311-1318。考虑了本发明的 抗原结合蛋白的糖基化变体，其中添加、取代、缺失或修饰一个或多个碳水化合物部分。天 冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸基序的引入产生用于碳水化合物部分的酶促连接 的潜在位点，并且因此可以用于操纵抗体的糖基化。在Raju等人（2001)Biochemistry 40 : 8868-8876 中，通过使用 β _1，4_ 半乳糖转移酶（galactosyltransferace)和 / 或 α，2, 3 唾液酸转移酶的再半乳糖化（regalactosylation)和/或再唾液酸化（resialylation)处 理，增加 TNFR-IgG免疫粘附的末端唾液酸化。增加末端唾液酸化被认为增加免疫球蛋白的 半衰期。抗体和大多数糖蛋白一样，通常作为糖形混合物产生。当抗体在真核细胞、特别是 哺乳动物细胞中生产时，这种混合物是特别明显的。已开发了制造确定糖形的多种方法，参 见 Zhang 等人（2004) Science 303 :371 :Sears 等人（2001) S