与肝细胞生长因子结合的设计锚蛋白重复蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对肝细胞生长因子（HGF)具有结合特异性的设计锚蛋白重复蛋 白，以及编码该HGF结合蛋白的核酸，包含该蛋白的药物组合物，以及该蛋白用于治疗疾病 的用途。
【背景技术】
[0002] MET原癌基因编码受体酪氨酸激酶（MET或c-Met的），也称为肝细胞生长因子受 体（HGFR ;人HGFR具有UniProtKB/SWISS-PROT编号P08581)，其对于胚胎发育和伤口愈合 必不可少。肝细胞生长因子（HGF，也称为分散因子；人类HGF具有UniProtKB/SWISS-PROT 编号P14210)是c-Met的唯一已知配位体。该受体通常由上皮来源细胞表达，而HGF的表 达仅限于间质来源的细胞。当受到HGF刺激时，c-Met诱发多种生物反应，它们共同引发 被称为浸润性生长的程序。癌症中的异常c-Met激活与不良预后具有相关性，其中异常活 性的c-Met触发肿瘤生长，肿瘤细胞存活，血管生成和转移。在许多类型的人恶性肿瘤中， c-Met失控，导致肾癌，肝癌，胃癌，乳房癌，脑癌，它同时也是抵抗其他靶向疗法的主要因 ^ (Bottaro, D. P. , Rubin, J. S. , Faletto, D. L. , Chan, A. Μ. , Kmiecik, Τ. Ε. , Vande ffoude, G. F. and Aaronson, S. A. , Science 251 (4995), 802-804, 1991 ；Comoglio, Ρ. Μ, Giordano, S. and Trusolino, L. , Nat. Rev. Drug Discov. 7 (6), 504-516, 2008)〇
[0003] HGF被分泌为单个无活性单链前体多肽（SC-HGF，有时也称为前-HGF)，并由丝氨 酸蛋白酶剪切为69kDa的α链和34kDa的β链。活性HGF是由所述α链和β链组成 的二硫键连接的异二聚体。HGF与凝血因子具有高度同源性，因为其α链包含了纤溶酶 原状的"环形结构域（Kringle) "结构基序，并且所述β链包含丝氨酸蛋白酶的同源结构 域，但缺乏酶活性（Naldini, L.，Weidner, Κ. Μ.，Vigna, Ε.，Gaudino, G.，Bardelli, A.，Ponz etto, C. , Narsimhan, R. P. , Hartmann, G. , Zarnegar, R. , Michalopoulos, G. K. , et al. , EMBO J. 10, 2867-2878, 1991) 〇
[0004] HGF通过与其受体结合，介导若干细胞反应，包括各种细胞类型的分散，细管和腔 的形成，上皮间质转变，血管生成，肝再生，伤口愈合和胚胎发育。HGF/c-Met的信号传导 通路也已知在各种疾病中，包括许多人实体瘤中，参与肿瘤发展，侵袭和转移。在人类癌症 中，HGF对c-Met的旁分泌和自分泌的激活，这些分子在肿瘤中的表达，以及HGF流通浓度 升高的循环，均与预后不良相关联，并增加肿瘤转移的风险（Comoglio et al.，2008, Ioc. cit.) 〇
[0005] 由于HGF在癌症和其他疾病的进程中的活跃作用，阻断HGF活性的药剂可以有利 于消除其影响。各种抗HGF(aHGF)的单克隆抗体（mAb)正在临床开发中，包括AMG102(即 rilotumumab，一种来自安进（Amgen)公司的人源化抗人HGF IgG2)，来自先灵/乐聘 (Schering/Aveo)的 AV 299,和来自千年（Millennium)公司的 TAK-701。
[0006] 除抗体外，还有可用于特异性结合靶分子，由此充当拮抗剂的新型 结合蛋白或结合域（e. g. Binz, Η. K.，Amstutz, P. and PlUckthun, A.，Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005)。此类不具有Fe的新型结合蛋白或结合域是基于设计 重复蛋白或设计重复域（冊2002/020565出11^，札1(.，厶1118七1^2，？.，1(〇111，厶.，5加11^^，]\1 T. , Briand, C. , Forrer, P. , Griltter, M. G. , and Plilckthun, A. , Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004 ；Stumpp, M. T. , Binz, H. K and Amstutz, P. , Drug Discov. Today 13, 695-701，2008)。WO 2002/020565描述了如何构建重复蛋白的大型文库及其常见 应用。然而，WO 2002/020565既没有公开具有HGF结合特异性的重复域的筛选，也没有公 开特异性结合HGF的重复域的具体重复模块或重复序列基序。此外，WO 2002/020565没有 暗示具有HGF结合特异性的重复域可以用来调节HGF介导的信号传导通路，从而成功地治 疗疾病。这些设计重复域利用重复蛋白的模块化性质，并且可以具有N端和C端加帽模块， 以防止设计重复域通过屏蔽结构域的疏水核心而聚集（Forrer, P.，Stumpp, Μ. T.，Binz, H. K. and Plilckthun, A. , FEBS letters 539, 2-6, 2003) 〇
[0007] 本发明解决的技术问题在于，鉴定具有HGF结合特异性的新型结合蛋白，例如锚 蛋白重复蛋白或结构域，用于调节HGF介导的信号传导通路，以改进对某些癌症，血管疾 病，血管发生相关疾病和其他病理学病症的治疗。本发明通过提供权利要求中所表述的实 施方式来解决该技术问题。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及一种重组结合蛋白，包括至少一个锚蛋白重复域，其中所述锚蛋白重 复域与PBS (磷酸盐缓冲液）中的HGF结合的Kd低于10 7M。
[0009] 更具体而言，本发明涉及一种重组结合蛋白，其包括至少一个锚蛋白重复域，所述 锚蛋白重复域与选自SEQ ID NOs: 33至61的锚蛋白重复域竞争与HGF的结合。
[0010] 本发明还涉及一种重组结合蛋白，其包括至少一个锚蛋白重复域，所述锚蛋白重 复域对HGF具有结合特异性，且包括锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块具有选自SEQ ID N0:12至25的氨基酸序列以及如下序列：在该序列中，SEQ ID N0:12至25中的最多9个氨 基酸被任意氨基酸替代。
[0011] 特别地，本发明涉及一种重组结合蛋白，其包括至少一个锚蛋白重复域，所述锚蛋 白重复域包含至少一个与选自SEQ ID N0s:33至61的任一锚蛋白重复域具有至少90%氨 基酸序列一致性的氨基酸序列，其中所述锚蛋白重复域的位置1上的G和/或位置2上的 S可选缺失；且所述锚蛋白重复域的倒数第二个位置上的L和/或最后一个位置上的N可 选地替代为A。
[0012] 特别地，本发明涉及一种HGF结合重组蛋白，其包含序列SEQ ID NO: 1至25和33 至62中任一种肽。
[0013] 本发明还涉及编码本发明所述的结合蛋白的核酸，且包含一种或多种上述结合蛋 白或核酸分子的药物组合物。
[0014] 本发明还涉及一种使用本发明的结合蛋白治疗病理症状的方法。
【附图说明】
[0015] 图1.选定DARPin的表面等离子体共振分析。
[0016] DARPin结合HGF的表面等离子体共振（SPR)分析（以DARPin#51为例）。各种浓 度（1.6, 3. 1，6. 3,12. 5和25nM)的DARPin被添加到固定有人HGF的流动池中120秒，接着 用缓冲液流洗。所得到的迹线在全局拟合后得到DARPin#51与人类HGF的相互作用的Kd 值为51PM。RU，共振单位；s，时间（秒）。请参阅下面对DARPin#51的定义。
[0017] RUjResonance Units ；s, time in seconds ；D1, DARPin#51 ；D2, DARPin#57 ； D3, DARPin#33. See below for the definition of DARPin#51, DARPin#57and DARPin#43.
[0018] 图2.竞争表面等离子体共振分析。
[0019] 对 DARPin 结合人 HGF 的 SPR 分析（以 DARPin#51，DARPin#57 和 DARPin#43 为 例）。取IOOnM的DARPin#51 (即Dl)添加到固定有人HGF的流动池中120秒，接着注入第 二种 DARPin 100nm(DARPin#57 或 DARPin#33 ;即分别为 D2 或 D3)60 秒。因此，Dl 和 D3 竞 争结合HGF而Dl和D2不竞争结合HGF。
[0020] RU，共振单位；s，时间（秒）；Dl，DARPin#5l ;D2，DARPin#57 ;D3，DARPin#33。请参 阅下面对 DARPin#51，DARPin#57 和 DARPin#43 的定义。
[0021] 图3.抑制HGF刺激的c-Met磷酸化
[0022] 如图所示为，各种浓度的具有对人HGF(以DARPin#42和#48为例）特异性的 DARPin，在A549细胞中对HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制作用，以及对应的拟合抑制曲线 (以 DARPin#42 和 #48 为例）。测得 DARPin#42 和 #48 的 IC5。值分别为 0. 32 和 0.1 nM。
[0023] 0D，450-620nm 下的光密度；C，DARPin 浓度（nM) ;D1，DARPin#48 ;D2, DARPin#42 ; MA，最大激活；MI，最小激活。X轴所示为对数标度。请参阅下面对DARPin#52和DARPin#48 的定义。
[0024] 图4.对U87细胞增殖的抑制。
[0025] 如图所示为各种浓度的对HGF具有特异性抑制的DARPins对U87恶性胶质瘤细胞 增殖的抑制和对应的拟合抑制曲线（以DARPin#51和#43为例）。测得的DARPin#51和#43 的IC5。值分别为72和116nM。
[0026] 0D，450-620nm 下的光密度；C，DARPin 浓度（nM) ;DlDARPin#51 ;D2，DARPin#43。X 轴所示为在对数标度。请参阅下面对DARPin#51和DARPin#43的定义。
[0027] 图5. c-Met克争实验。
[0028] 如图所示为一个不同的单一实验中，各种浓度的人HGF特异性DARPin对HGF与 c-Met结合的抑制和相应的拟合抑制曲线。DARPin#43和#51的IC5。计算值分别为约1. 36 和0.6211]\1。00,450-62011111下的光密度；(：，0厶1?^11浓度（11]\1);01，0厶1?^11#51 ;02,0厶1?^11#43。 X轴所示为对数标度。请参阅下面对DARPin#51和43的定义。
[0029] 图6.抗HGF DARPin vs.载体在U87肿瘤异种移植模型中的效力。
[0030] 将U87-MG肿瘤细胞皮下注射到裸鼠中。长有肿瘤动的物随机分为4组，并用不同 浓度的聚乙二醇（PEG)化DARPin处理（每周静脉注射三次，动物总共给药七次）。PEG化 DARPin的生成如实施例6所述。
[0031] T，肿瘤体积（mm3) ;d，时间（天）；V，载体（即 PBS) ;D 1，PEG 化的 DARPin#62,每 次注射的剂量为0. llmg/kg ;D2，PEG化DARPin#62每次注射的剂量为I. lmg/kg ;D3，PEG化 DARPin#62每次注射的剂量为llmg/kg。
[0032] 图7. SEQ ID NOs :12至28的多序列比对。SEQ ID NOS :12至28根据残基位置对 齐进行多重序列比对。所述锚蛋白重复残基位置编号表示在顶部。残基位置2,5,7-13和 16-33对应于通常含有骨架残基的位置。残基位置1，3,4,6,14和15对应于其中可能包含 目标相互作用残基的位置。
【具体实施方式】
[0033] 本发明所述的重组结合蛋白或结构域具有哺乳类HGF特异性。优选地，本发明所 述重组结合蛋白对小鼠、大鼠、犬、兔、猴或人源的HGF具有特异性。更优选地，本发明所述 重组结合蛋白对人源的HGF具有特异性。
[0034] 术语"蛋白"指的是多肽，其中所述多肽至少部分具有确定的三维结构，或能够通 过在其多肽链之内和/或之间形成二级，三级或四级结构来取得确定的三维结构。如果一 个蛋白包含两种或更多种多肽，其个体多肽链可以非共价或共价连接，例如两个多肽之间 形成二硫键。蛋白的部分，若能够单独具有，或能够通过形成二级或三级结构取得，确定的 三维结构，则将其称为"蛋白结构域"。所述蛋白或蛋白结构域是本领域技术人员所熟知的。
[0035] 如在重组蛋白、重组蛋白结构域、重组结合蛋白等中所用的术语"重组"，指的是， 所述多肽通过使用相关领域技术人员所熟知的重组DNA技术产生。例如，编码多肽的重组 DNA分子（例如，通过基因合成产生）可以被克隆到细菌表达质粒（如pQE30, Qiagen)，酵 母表达质粒或哺乳动物表达质粒中。例如，当所述构建重组细菌表达质粒插入到合适的细 菌（如大肠杆菌）中时，所述细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。相应产生的多肽被称 为重组多肽。
[0036] 在本发明的上下文中，术语"多肽"涉及一种由一条或多条由多个（即两个或更多 个）通过肽键连接的氨基酸组成的链组成。优选地，多肽由通过肽键连接的八个以上氨基 酸组成。
[0037] 术语"多肽标记"指的是连接到多肽/蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列用 于所述多肽/蛋白的纯化、检测或靶定，或其中所述氨基酸序列增强所述多肽/蛋白的物 理化学行为，或其中所述氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的各多肽标记、部分和/或 结构域可直接或通过多肽接头彼此连接。这些多肽标记都是本领域熟知的，并且完全是本 领域技术人员可获得的。多肽标记的例子包括小多肽序列，例如，组氨酸（His)(例如，所述 SEQ ID NO :9的His标记），原癌基因（myc)和FLAG，或链球菌（Str印）标记或部分，如酶 (例如内切酶样碱性磷酸酶），其允许对所述多肽/蛋白或部分进行检测，可用于靶向（如 免疫球蛋白或其片段）和/或作为效应分子。
[0038] 术语"多肽接头"是指一种氨基酸序列，其能够连接，例如，两个蛋白结构域，多肽 标记和蛋白结构域，蛋白结构域和非多肽部分（如聚乙二醇）或两个序列标记。所述附加 域、标记、非多肽部分和接头是相关领域技术人员已知的。在专利申请WO 2002/020565的 说明书中提供了示例列表。此类接头的具体例子包括可变长度的甘氨酸-丝氨酸接头及 脯氨酸-苏氨酸-接头；优选地，所述接头的长度在2至24个氨基酸之间；更优选地，所述 接头的长度在2至16个氨基酸之间。甘氨酸-丝氨酸接头的例子如SEQ ID NO: 10所示， 脯氨酸-苏氨酸-接头的例子如SEQ ID NO :11所示。优选地，SEQ ID NO : 11所示的脯氨 酸-苏氨酸-接头之前和/或之后连接有GS。
[0039] 术语"聚合物部分"指的是蛋白聚合物部分或非蛋白聚合物部分。"蛋白聚合物部 分"优选是不形成稳定三级结构的多肽。蛋白聚合物部分的例子包括XTEN? (Amunix的 注册商标；WO 2007/10351)多肽，或如WO 2008/155134所述的包含脯氨酸、丙氨酸和丝氨 酸残基的多肽。所述蛋白聚合物部分可以过使用标准DNA克隆技术产生基因融合多肽，随 后通过标准的表达和纯化，从而共价连接于例如本发明的结合域。"非蛋白聚合物部分"是 不由多肽构建的聚合物部分。非蛋白聚合物部分的例子包括羟乙基淀粉（HES)，聚乙二醇 (PEG)，聚丙二醇，或聚氧化烯。术语"聚乙二醇化"（PEG化）是指PEG部分共价连接至，例 如，本发明的多肽。本发明的聚合物部分的分子量可以广泛地变化。优选地，所述聚合物部 分由多肽接头连接至结合域。
[0040] 在一个具体实施例中，PEG部分或任何其它非蛋白聚合物可以，例如，通过马来酰 亚胺接头连接到半胱氨酸硫醇，其中该半胱氨酸经由肽接头与本文所述的结合域的N端或 C端结合。
[0041] 术语"结合蛋白"是指包含一个或多个结合域、一种或多种生物活性化合物和一种 或多种聚合物部分的蛋白，下文将进一步解释。优选地，所述结合蛋白包含最多四个结合 域。更优选地，所述结合蛋白包含最多两个结合域。最优选地，所述结合蛋白只包含一个结 合域。此外，任何所述结合蛋白均可以包括不是结合域的附加蛋白结构域、多聚化结构部 分、多肽标记、多肽接头和/或一个或多个Cys残基。多聚化部分的示例包括配对提供功能 性免疫球蛋白Fc结构域的免疫球蛋白重链恒定区，以及亮氨酸拉链或多肽，其包括在两个 所述多肽之间形成分子间二硫键的游离硫醇。Cys残基可用于将其它部分连接到多肽上，例 如，通过使用本领域技术人员所熟知的马来酰亚胺化学。优选地，所述结合蛋白是重组结合 蛋白。同样优选地，结合蛋白的结合域具有不同的靶向特异性。
[0042] 术语"生物活性化合物"指的是，当用于患有所述疾病的哺乳动物时，能够进行疾 病调节的化合物。生物活性化合物可以具有拮抗性质或激动性质，并且可以是蛋白质生物 活性化合物或非蛋白质生物活性化合物。所述蛋白的生物活性化合物可以，例如，通过使 用标准DNA克隆技术产生基因融合多肽，随后通过标准的表达和纯化，从而共价连接于例 如本发明的结合域。可以通过化学方法，例如通过马来酰亚胺接头连接到半胱氨酸硫醇， 其中该半胱氨酸经由肽接头与本文所述的结合域的