纯化肝细胞生长因子的n－端片段的方法

专利名称：纯化肝细胞生长因子的n－端片段的方法
技术领域：
本发明涉及纯化肝细胞生长因子的包含N-端4个三环的片段(NK4)的方法。
背景技术：
肝细胞生长因子(HGF/SF)是由Nakamura，T.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.22(1984)1450-1459鉴定和纯化的多肽。还发现肝细胞生长因子与分散因子(scatter factor)(SF)相同，Weidner，K.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)7001-7005。HGF是涉及许多细胞表型的发展的糖蛋白，所述细胞表型包括增殖、细胞分裂发生、分支小管的形成并且在肿瘤细胞的情形中，包括侵入和转移。对于情况综述，见Stuart，K.A.，et al.，Int.J.Exp.Pathol.81(2000)17-30。
已经对于大鼠HGF和人HGF进行了测序和克隆(Miyazawa，K.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.163(1989)967-973；Nakamura，T.，et al.，Nature 342(1989)440-443；Seki，T.，et al.，Biochem.and Biophys.Res.Comm.172(1990)321-327；Tashiro，K.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)3200-3204；Okajima，A.，et al.，Eur.J.Biochem.193(1990)375-381)。
还发现由HGF/SF的N-端发夹序列结构域和四个三环结构域组成的称为NK4的HGF/SF片段具有完全不同于HGF/SF的那些的药理学性质，是HGF/SF影响结肠癌细胞的运动性和侵入的拮抗剂，并且此外，是抑制肿瘤生长和转移的血管发生抑制剂(Parr，C.，et al.，Int.J.Cancer 85(2000)563-570；Kuba，K.，et al.，Cancer Res.60(2000)6737-6743；Date，K.，et al.，FEBS Lett.420(1997)1-6；Date，K.，et al.，Oncogene 17(1989)3045-3054)。
按照现有技术(Date，K.，et al.，FEBS Lett.420(1997)1-6)通过HGFcDNA在CHO细胞中的重组表达和随后用胰腺弹性蛋白酶进行消化来制备NK4。通过内含体路径在大肠杆菌中产生分别编码N-端结构域和三环1，和N-端结构域和三环1和2的HGF的两种其它的同种型(NK1和NK2)(Stahl，S.J.，Biochem.J.326(1997)763-772)。按照Stahl，在包含2.5M尿素，5mM还原的谷胱甘肽(GSH)和1mM氧化谷胱甘肽(GSSG)的100mMTRIS/HCl pH 7.5中进行NK1或NK2的复性(naturation)。还使用TRIS缓冲液随后在SuperdexTM 75柱上进行纯化。在溶解和复性过程中，按照现有技术应用TRIS缓冲液导致本发明人对相当大量(约50％)的副产物的研究，所述副产物由本发明人鉴定为主要由GSH-修饰的NK4组成。
因此，该方法不是用于重组制备相当大量和足够纯度(对于治疗应用)的NK4。
发明概述本发明提供制备NK4的方法，其通过在微生物宿主细胞中表达编码所述NK4的核酸，分离包含以变性形式存在的所述NK4的内含体，在存在GSH和GSSG的情况下溶解内含体并且使变性的NK4复性来进行，所述方法特征在于溶解和复性在磷酸缓冲溶液中以pH 7-9来进行。
令人惊奇地发现使用在介于7和9之间的pH范围，优选地介于pH 8和9之间pH范围的磷酸钾缓冲液，导致在NK4的产量和纯度的相当大的提高。
优选地，在复性后，用pH 7-9的磷酸缓冲液对NK4进行透析达至少24小时。在存在pH 7-9的磷酸缓冲液的情况下，优选地通过疏水相互作用层析来进行纯化，由此特别优选将丁基-或苯基琼脂糖用作层析材料。
发明详述人HGF是二硫键连接的杂二聚体，其可以通过在氨基酸R494和V495之间的裂解，在463个氨基酸的α-亚基和234个氨基酸的β-亚基中裂解。α-链的N-端的前面是以甲硫氨酸基团开始的31个氨基酸。该片段包括31个氨基酸的信号序列，α-链开始于氨基酸32，并包含四个三环结构域。所谓的“发夹序列结构域”由氨基酸70-96组成。三环1结构域由氨基酸128-206组成。大致上，三环2结构域由α-链的氨基酸211-288组成，三环3结构域由α-链的氨基酸305-383组成，且三环4结构域由α-链的氨基酸391-469组成。
按照本发明的NK4优选地由氨基酸(aa)32-494或其N-端片段(总是以aa32开始)组成，最小的片段是aa 32-478。NK4的长度可以在该范围内变化，只要其生物学性质未受影响。此外，存在这些序列的各种变化，本质上不影响NK4的生物学性质(特别是不影响其对HGF的拮抗的活性和其抗生血管的活性)，其变化描述在，例如WO 93/23541中。NK4的活性通过按照实施例4的分散测定来进行测量。
NK4可以通过制备重组人HGF/SF和用弹性蛋白酶消化(Date，K.，FEBS Lett.420(1997)1-6)或通过如下所述的将NK4编码核酸在适合的宿主细胞中重组表达来重组地进行制备。NK4糖蛋白具有约57kDa的分子量(对于单独的多肽部分是52kDa)，并且具有导致对肿瘤生长、血管发生和/或转移的抑制的体内生物学活性。
可以在原核生物中通过重组方式来制备NK4多肽。对于在原核宿主细胞中的表达，按照本领域技术人员熟悉的方法来将核酸整合到适合的表达载体中。这样的表达载体优选地包含可调节的/可诱导的启动子。接着将重组载体引入以在适合的宿主细胞诸如，例如大肠杆菌中进行表达，并且将被转化的细胞在容许异源基因表达的条件下进行培养。在发酵后，分离包含变性的NK4的内含体。
例如，埃希氏菌属(Escherichia)，沙门氏菌属(Salmonella)，链霉菌属(Streptomyces)或芽孢杆菌属(Bacillus)适合作为原核宿主生物。对于NK4多肽的制备，将包含编码NK4的DNA的载体以常规方式转化原核生物，并且随后以常规方式进行发酵。然而，使用最初的NK4 DNA序列(GenBankM73239)在大肠杆菌中的表达产量非常低。令人惊奇的是，发现编码氨基酸位点33到36的DNA序列的密码子的至少一个的修饰(密码子33编码精氨酸，编号按照M73239)导致20％多肽或更多的表达产量的增加。因此，本发明的另一个目标是在原核生物中通过可复制的表达载体的表达来重组制备NK4的方法，所述可复制的表达载体包含编码NK4的DNA，其特征在于，在所述DNA中，选自由位点33，34，35和36密码子组成的组的氨基酸的密码子的至少一个从AGG改变到CGT(位点33)，从AAA改变到AAA(位点34)，从AGA改变到CGT(位点35)，和/或从AGA改变到CGT(位点36)。还优选的是，氨基酸32的密码子从编码Gln改变为编码Ser从而提高分离N-端精氨酸。
在细胞质中发现内含体，因为待表达的基因不包含信号序列。这些内含体在细胞裂解后，例如通过离心分离自其它的细胞成分。
通过在pH 7-9的磷酸缓冲液中，加入变性剂如6M的盐酸胍或8M的尿素(优选地以0.1-1.0M的浓度，例如0.4M)，优选地在DTT(二硫-1，4-苏糖醇)存在的情况下来溶解内含体。将溶解物(solubilisate)在存在GSH/GSSG(优选地2-20mM的谷胱甘肽)和以非变性浓度存在的变性剂(例如，2M的盐酸胍或4M的尿素)，或优选地取代盐酸胍或尿素，以约0.3到1.0M浓度存在的精氨酸，优选地以约0.7M的浓度存在的精氨酸的情况下稀释于磷酸缓冲液pH 7-9中。复性优选地在约4℃的温度下进行，并且进行约48到160小时。
在复性终止后，将所述溶液优选地针对磷酸缓冲液pH 7-9(优选地以0.1-1.0M的浓度，例如0.3M)进行透析达至少24小时，优选地达24-120小时。
NK4多肽或其片段可以在重组制备和水不溶性的变性多肽(内含体)的复性后，按照本发明的方法，优选地通过层析法方法，例如通过亲和层析法，疏水相互层析法，免疫沉淀法，凝胶过滤，离子交换层析法，层析聚焦，等电聚焦，选择性沉淀，电泳等进行纯化。优选通过疏水相互作用层析法，优选地在pH 7-9，在存在磷酸缓冲液的情况下和/或优选通过使用丁基或苯基琼脂糖来纯化NK4多肽。
按照本发明的方法，仅通过形成GSH加合物来修饰小量的NK4多肽。在NK4多肽的总量中，即从其它细胞成分中分离的内含体的量(对应于100％)，GSH-修饰的NK4的量介于0％和50％之间，优选地介于0％和35％之间，并且更优选地介于0％和20％之间。
提供下面的实施例，参考文献，序列表和图来协助理解本发明，在后附的权利要求中提出的真正范围。要理解的是可以在不背离本发明的精神的前体下，在提出的方法中进行改进。
附图描述

图1 复性动力学，肝素柱，在280nm检测图2 复性有效性序列的描述SEQ ID NO1编码NK4的DNASEQ ID NO2 NK4的多肽序列实施例1NK4的重组表达将来自HGF的氨基酸位点32到478的NK4结构域用于克隆并且在大肠杆菌中重组表达。描述用作DNA源的最初的DNA序列(数据库标识符“gbM73239”)。进行PCR从而扩增和同时修饰编码NK4(Seq ID No1)的DNA。所有的方法在标准条件下进行。
与NK4的最初的DNA序列相比，引入下列变化-去除真核信号肽序列并且融合邻近NK4的氨基酸位点32的ATG起始密码子-将氨基酸位点32从Gln改变到Ser从而改变蛋白质产物的同质性(无Met)-改变在位点33(AGG到CGT)，35(AGA到CGT)，和36(AGA到CGT)的氨基酸的密码子的DNA序列，从而提高在大肠杆菌中的基因表达。
-改变在位点477(ATA到ATC)和478(GTC到GTT)的密码子的DNA序列，从而有利于PCR产物向载体插入-将两个翻译终止密码子引入位点479(TAA)和480(TGA)从而在等价于NK4蛋白质结构域的末端的位点来终止翻译。
用限制性内切核酸酶NdeI和BanII来处理PCR-扩增的DNA片段，并且连接于修饰的pQE载体(Qiagen)(消除His-标记以及DHFR编码区域)，所述pQE载体用NdeI和BanII进行适当地处理。表达质粒pQE-NK4-Ser(质粒大小4447bp)的元件是T5启动子/lac操纵子元件，NK4编码区域，λ到转录终止区域，rrnB T1转录终止区域，复制的ColE1起点和β-内酰胺酶编码序列。
将连接反应用于转化大肠杆菌感受态细胞，例如具有表达辅助质粒pUBS520的大肠杆菌菌株C600(Brinkmann，U.，et al.，Gene 85(1989)109-114)。分离大肠杆菌菌落并且关于它们的质粒的限制性和序列分析进行特征鉴定。在存在适当的抗生素情况下，于LB培养基中培养重组细胞后，且在通过添加IPTG(1mM)诱导基因表达后，通过NK4蛋白质含量的分析来进行克隆的选择。通过PAGE来比较细胞裂解物的蛋白质图谱。选择显示最高比例的NK4蛋白质的重组大肠杆菌克隆来进行生产过程。在标准条件下进行发酵并且分离内含体。
实施例2使用优化条件来溶解和复性将内含体在缓冲液中溶解过夜，所述缓冲液包含6M的盐酸胍，0.1M的磷酸钾pH 8.5(用10M KOH来滴定)，1mM EDTA，0.01mM DTT。通过Biuret测定来确定溶解的蛋白质的浓度并且最终在室温调节到25mg总蛋白/ml的浓度。
将该NK4-溶解物在缓冲液中稀释到0.4mg/ml的浓度，所述缓冲液包含0.7M的精氨酸，0.1M的磷酸钾pH 8.5(用浓HCl滴定)，10mM GSH，5mM GSSG和1mM EDTA。于4℃，将该复性测定温育介于2和8天之间。使用1ml的肝素琼脂糖柱通过分析亲和层析法来测量复性有效性(复性动力学，见图1)。
缓冲液条件缓冲液A50mM Tris pH 8.0缓冲液B50mM Tris pH 8.0，2M NaCl梯度5-25％ 缓冲液B，2柱体积25-60％ 缓冲液B，16柱体积60-100％ 缓冲液B，0.7柱体积100％缓冲液B，2柱体积在获得最大复性有效性后，使用切向流(tangential flow)过滤装置(MW截留值10kDa，Sartorius)来将复性测定的15升体积浓缩到3升。随后，对着包含0.3M的磷酸钾缓冲液的pH 8.0的50升缓冲液将其透析3次达至少3×24小时，最优共进行5天。
通过肝素-琼脂糖层析法(条件见上)来进行纯化。将在0.1M的磷酸钾pH 8.0中的1M硫酸铵加入洗脱物质中，并且于4℃温育过夜。将样品进行离心并且将上清液上载到苯基琼脂糖柱(150ml)上。用1柱体积的在50mM的磷酸钾pH 8.0中的1M硫酸铵来洗涤所述柱。
洗脱条件缓冲液A1M硫酸铵，50mM磷酸钾pH 8.0缓冲液B50mM磷酸钾pH 8.0，40％乙二醇0-100％缓冲液B，20柱体积实施例3使用磷酸钾和Tris的复性的比较使用pH 7.5和pH 8.5的磷酸钾或TRIS(都用浓HCl进行滴定)作为缓冲剂，来分析复性条件。溶解和复性条件如在实施例2中所述，但是在复性缓冲液中有0.1M TRIS或0.1M的磷酸钾。还如在实施例2中所述进行透析，但是在0.1M TRIS或0.1M磷酸钾中。磷酸钾缓冲液(K-P)如TRIS缓冲液一样导致显著更高的复性产量，所述复性产量通过分散测定测量为活性NK4的量(见，图2)。
实施例4活性的确定a)分散测定将MDCK细胞亚汇合地(subconfluently)培养在组织培养板中。用HGF(10ng/ml)或用HGF和NK4的组合处理细胞。在这些实验中，通过加入10到1000倍摩尔过量的NK4来抑制所述HGF-诱导的细胞分散至少达90％及更多，显示功能活性。
b)增殖测定如在Nakamura，T.，et al.，Nature 342(1989)440-443中所述，通过在原初培养物中测量成年大鼠肝细胞的DNA合成来确定NK4对HGF的促有丝分裂活性的抑制。在这些实验中，通过添加10-1000倍摩尔过量的NK4来抑制HGF-诱导的细胞增殖至少达90％及更多，显示功能活性。
c)侵入测定在该测定中，分析了肿瘤细胞的侵入潜能。使用HT115细胞，基本上如在Albini，A.，et al.，Cancer Res.47(1987)3239-3245中所述进行该测定。此外，HGF-诱导(10ng/ml)的细胞侵入可以被10-1000倍摩尔过量的NK4抑制至少90％及更多，显示功能活性。
实施例5体内活性模型Lewis肺癌裸鼠肿瘤模型将1×106Lewis肺癌细胞皮下(s.c.)植入雄性裸鼠中(BALB/cnu/nu)。
处理4天后，在2-4周时期内，每日施用pegylated的NK4一次剂量1000μg/小鼠/日300μg/小鼠/日100μg/小鼠/日安慰剂结果用NK4进行的处理显示对原发肿瘤生长和转移的剂量依赖型的抑制，而在安慰剂处理组中没有观察到作用。
参考文献列表Albini，A.，et al.，Cancer Res.47(1987)3239-3245Brinkmann，U.，et al.，Gene 85(1989)109-114Date，K.，et al.，FEBS Lett.420(1997)1-6Date，K.，et al.，Oncogene 17(1989)3045-3054Kuba，K.，et al.，Cancer Res.60(2000)6737-6743Miyazawa，K.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.163(1989)967-973Nakamura，T.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.22(1984)1450-1459Nakamura，T.，et al.，Nature 342(1989)440-443Okajima，A.，et al.，Eur.J.Biochem.193(1990)375-381Parr，C.，et al.，Int.J.Cancer 85(2000)563-570Seki，T.，et al.，Biochem.and Biophys.Res.Comm.172(1990)321-327Stahl，S.J.，Biochem.J.326(1997)763-772Stuart，K.A.，et al.，Int.J.Exp.Pathol.81(2000)17-30Tashiro，K.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)3200-3204美国专利号5,977,310Weidner，K.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)7001-7005WO 93/23541
序列表<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司<120>纯化肝细胞生长因子的N-端片段的方法<130>22389 WO<150>EP 04004950.4<151>2004-03-03<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1350<212>DNA<213>人工的<220>
<223>编码NK4的dna<220>
<221>CDS<222>(1)..(1350)<400>1atg tct cgt aaa cgt cgt aat act att cat gaa ttc aaa aaa tca gca48Met Ser Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala1 5 10 15aag act acc cta atc aaa ata gat cca gca ctg aag ata aaa acc aaa96Lys Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys20 25 30aaa gtg aat act gca gac caa tgt gct aat aga tgt act agg aat aaa 144Lys Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys35 40 45gga ctt cca ttc act tgc aag gct ttt gtt ttt gat aaa gca aga aaa 192Gly Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys50 55 60caa tgc ctc tgg ttc ccc ttc aat agc atg tca agt gga gtg aaa aaa 240Gln Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys65 70 75 80gaa ttt ggc cat gaa ttt gac ctc tat gaa aac aaa gac tac att aga 288Glu Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg85 90 95aac tgc atc att ggt aaa gga cgc agc tac aag gga aca gta tct atc 336Asn Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile100 105 110
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<223>NK4的蛋白质序列<400>2Met Ser Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala1 5 10 15Lys Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys20 25 30Lys Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys35 40 45Gly Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys50 55 60
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1.制备肝细胞生长因子的包含N-端四个三环的片段(NK4)的方法，所述方法通过在微生物宿主细胞中表达编码所述NK4的核酸，分离包含以变性形式存在的所述NK4的内含体，溶解内含体并且使变性的NK4复性来进行，其特征在于溶解和复性在磷酸缓冲溶液中在pH 7-9下进行。
2.按照权利要求1的方法，其中在复性后，用磷酸缓冲液pH 7-9来对NK4进行透析达至少24小时。
3.按照权利要求1或2的方法，其特征在于在复性后，在pH 7-9的磷酸缓冲液存在的情况下，通过疏水相互作用层析法来纯化NK4。
4.按照权利要求3的方法，其特征在于层析法在丁基-或苯基琼脂糖上进行。
5.按照权利要求1-4任一项的方法，其特征在于GSH-修饰的NK4的量介于总NK4的0％和50％之间。
6.按照权利要求5的方法，其特征在于GSH-修饰的NK4的量在总的NK4的0％和20％之间。
全文摘要
一种制备肝细胞生长因子的包含N－端4个三环的片段(NK4)的方法提供了高纯度和高产量的NK4，所述方法通过在微生物宿主细胞中表达编码所述NK4的核酸，分离包含以变性形式存在的所述NK4的内含体，溶解内含体并且使变性的NK4复性来进行，其特征在于溶解和复性在磷酸缓冲溶液中在pH7－9下进行。
文档编号C07K1/14GK1926150SQ200580006676
公开日2007年3月7日 申请日期2005年3月2日 优先权日2004年3月3日
发明者F·黑塞, M·兰岑德费尔, A·帕帕季米特里乌, J·施特拉克 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司