一种表皮细胞大规模培养方法与流程

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种表皮细胞大规模培养方法。

背景技术：

表皮细胞是生物医学和组织工程领域常用的原材料和研究工具，其中药品和化妆品开发中原料的筛选、效价的评估、安全性评价等均涉及到表皮细胞的应用。例如，在组织工程领域各种组织工程体外检测皮肤模型的构建，用于烧烫伤等疾病治疗的组织工程皮肤的构建，细胞膜片的培养等。以上应用均需大量状态一致性好，细胞纯度高，质量稳定的表皮细胞。

目前针对表皮细胞的大规模培养方法鲜有报道，细胞的大规模培养首先应防止污染，获得足够数量细胞，保证细胞质量稳定、状态一致是得到可靠实验数据和产品的前提。目前传统细胞培养方法有以下几种：

（1）微载体培养方式：需采用反应器等成套设备，成本高，建设周期长，不利于放大，由实验室瓶养转大规模生产操作过程复杂，技术要求高，参数确定时间长。

（2）采用滋养层培养：在细胞获取过程中难免混入较多杂细胞，无法得到纯度高的表皮细胞，不能用于针对性研究，大规模生产中各种细胞混杂，细胞比例不一致，无法得到某种细胞的明确数量。在采用丝裂霉素处理抑制滋养层细胞增殖过程中，由于该抑制作用无选择性，故残留丝裂霉素对增殖同样会有影响；若采用辐照，剂量波动无法精确控制，如果致死的fb数量不够或过量，会直接影响表皮细胞生长所需的营养成分、因子浓度，表皮细胞有接触抑制特性，若滋养层细胞过量增殖，直接影响表皮细胞的获取数量，而且，辐照过程的无菌难以保证；活细胞在辐照时一般单位无法满足时效性要求。例如，在中国专利cn200910155159采用微载体加滋养层的含血清培养方法，该方法培养液成分复杂，滋养层细胞种类多，处理工艺繁琐或不易量化，血清中钙离子会明显促进表皮细胞分化。

（3）含血清培养基：血清中的钙离子是促使表皮细胞分化的一个重要因素，同时细胞分化也限制的细胞的后续扩增次数。例如，在中国专利cn201610364492中主要是通过培养基的开发来降低成本，从而使大规模培养从成本考虑角度变得可行，但未涉及具体细胞质量提高或状态稳定或纯度方面内容。

按照上述传统培养方法，在大规模培养中接种密度太低，细胞很难存活，也难以获得质量稳定、状态一致性好、纯度高的表皮细胞。

技术实现要素：

为了解决上述缺陷，本发明能够提供一种表皮细胞大规模培养方法，可短时间内在体外获得大量质量稳定、状态一致性好、纯度高的表皮细胞，解决了现有技术难以在大规模的获取状态一致性好、纯度高的表皮细胞的问题。

本发明所采用的技术方案是，集约化的细胞体外培养方式，通过控制接种密度、培养液加入量、增加气体强制交换、改变细胞消化方式等，为细胞提供离体培养所需的ph、渗透压、营养物质、调节物质等，从而获得大量质量一致的细胞。该表皮细胞大规模培养方法具体包括以下步骤：

步骤1，接种

将表皮种子细胞与培养液混匀重悬后，均匀接种于细胞工厂中，保证每层接种细胞数量一致；

步骤2，培养

将接种好的表皮细胞放入co2培养箱，在37℃、5%co2浓度条件下进行培养，根据传代需求培养一段时间后收获细胞；

步骤3，消化

向细胞工厂加入消化液，co2培养箱37℃孵育，待大部分细胞不再贴壁时，立即将工厂内液体转移到装有终止液的容器中终止消化；然后向细胞工厂继续加入相同体积的消化液，co2培养箱37℃孵育至所有细胞不再贴壁时，再向细胞工厂中加入相同体积的的终止液终止消化；

步骤4，离心

收集两次终止后的所有液体，离心弃上清，用pbs平衡盐溶液重悬，再次离心弃上清，得到大规模培养好的表皮细胞。

本发明的特点还在于：

进一步地，步骤1所述接种的接种量为：按每细胞工厂0.25l～1.25l的加液量将细胞按1.6×10⁴/ml～4×10⁴/ml重悬后接种。在体外培养细胞中，细胞接种数对细胞的生长有影响，适宜的接种密度，可以促使细胞增殖，接种密度太低或太高都不利于细胞的生长增殖。如果培养基与细胞的容积比例大于2000：1，生长物质弥散到细胞外过多，将使细胞内浓度低于最小限度的浓度，此时细胞不能再增殖，培养基的ph值变碱，抑制细胞生长，细胞变圆不能贴壁，甚至引起细胞死亡等。如果接种密度太高，每个细胞周围培养基的容积降至0.007mm³以下，由于弥散率降低，细胞内生物质的浓度增加，容易使代谢产物达到饱和，能量来源也很快耗尽，防碍细胞的增殖。因此选择适宜的接种浓度要根据细胞的代谢和生长繁殖速度以及工作的需要而确定。一般代谢旺盛、生长速度快的细胞（如肿瘤细胞），接种浓度宜偏低；而正常组织细胞生长较慢，代谢不够旺盛，接种浓度可偏高。

进一步地，步骤2所述接种好的表皮细胞在co2培养箱中培养时，向细胞工厂中通入空气和co2，使细胞工厂内保持5%co2。细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不断释放co2，使培养基变酸，ph发生变化。细胞工厂环境相对密闭，二氧化碳难溢出，所以，为了维持培养环境恒定的ph，同时满足细胞代谢对氧气的需要，采用气泵增加细胞工厂内气体的对流交换，保证细胞生长环境稳定。

进一步地，步骤3所述消化液为tryple消化液，两次加入的消化液体积相等，两次加入的消化液总量为50~250ml。相应的，所述终止液为无血清培养液，每次加入的终止液体积与每次加入的消化液体积相等。细胞在消化过程中接触消化液时间不同、细胞状态差异会导致被消化下来的时间存在差异，消化下来的细胞长时间继续与消化液接触会导致细胞膜表面蛋白大量被分解，导致细胞死亡或结成絮状物，而絮状物对细胞的吸附作用极强，大量细胞被吸附导致细胞收获量减少，而吸附的细胞在后期接种后由于无法贴壁伸展，也会死亡。因此，本发明采用两次消化法，避免先被消化下来的细胞长时间再与消化液接触而影响细胞质量。

进一步地，步骤3所述离心为每分钟800转离心6分钟。

本发明方法适用于所有表皮细胞的大规模培养，如人表皮细胞、小鼠表皮细胞、大鼠表皮细胞、猪表皮细胞和牛表皮细胞等。同时，本发明可根据传代需求选择初始接种的表皮细胞代数和接种浓度。

本发明的有益效果包括以下几点：

（1）一次培养可以获取大量状态一致性好，杂细胞含量非常少或无杂细胞，质量稳定的表皮细胞。

（2）节约培养时间，减少污染风险。用传统培养瓶进行培养，由于大部分细胞在体外培养的密度依赖和接触抑制现象，细胞接种密度不能太低，细胞接入量大，达到传代密度的时间短，在达到传代密度就需要进行传代，否则细胞就开始分化或凋亡，这在细胞在未达到使用数量前是不希望出现的。而采用本发明细胞接种量约为传统方法的1/3～1/6，在培养容器中生长2-4天，从收获细胞数量和接种量的比较细胞增殖了约3代。传统方法则需要至少6天，而且至少每2天需要传代一次，操作繁琐，增加细胞污染的概率。并且减少了在传代消化过程中人员操作对细胞造成的机械损伤和消化液的细胞的损伤。

（3）前期投入少，节约了设备建设和培养条件摸索时间。

附图说明

图1是本发明实施例1中的传代操作前的细胞状态图；

图2是传统方法与本发明所述方法的细胞形态对比图；其中，a为传统方法的p7细胞形态图，b为传统方法的p14细胞形态图，c为本发明所述方法的p7细胞形态图，d为本发明所述方法的p14细胞形态图；

图3为传统方法与本发明所述方法的细胞增殖曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于这些实施方式。

本发明方法适用于所有表皮细胞的大规模培养，如人表皮细胞、小鼠表皮细胞、大鼠表皮细胞、猪表皮细胞和牛表皮细胞等。

实施例1

本实施例以培养人表皮细胞为例，进行说明。

1、种子表皮细胞的获取

取8岁以下男童手术后健康组织约2cm²，2小时内送达无菌室，用75%酒精浸泡2-3进行，pbs溶液中浸洗，用剪刀去除皮下结缔组织，将切割组织为3mm×9mm大小的皮条，按每条1ml消化液tryple加入1.2u/mldispase，避光4℃消化16-17小时。

分离表皮与真皮：无菌操作将表皮撕下。

收集表皮细胞：将撕下的表皮收集于容器中，用25~65mltryple在36-37℃消化10min，每2min震荡3下，消化结束加入与消化液等体积终止液（无血清培养液），轻柔吹打，过滤后将液体转入离心管，分别取10ul悬液计数，离心，每分钟800转，离心6分钟。离心结束按每瓶4×10⁴～7×10⁴个/ml接种。

细胞接种培养：用表皮细胞培养液（kcgrowth2500）按每个瓶中4×10⁴～7×10⁴个/ml重悬细胞，共加入悬液10ml，使细胞均匀分散。将培养瓶置于37℃、5%co2培养箱中进行培养，24h更换培养液，此时细胞标记为p0代。

2、表皮扩增

待种子细胞融合度达到50-65％，弃掉培养液；在培养瓶中加入消化液tryple，消化液最低用量为覆盖整个细胞培养面，将细胞转移至co2培养箱37℃孵育5min，待80-90％的细胞不再贴壁，加入终止液（无血清培养液），终止消化，消化操作过程中不能大力晃动培养瓶，以免对细胞造成机械损伤，或细胞结絮影响细胞收获量。用弯头吸管反复吹打6-8次，收集，吹打时应按由上至下依次进行，避免气泡产生，800rpm/min离心6min；离心结束后，弃上清，用无血清培养基重悬细胞沉淀，混匀，取2个10μl细胞悬液分别用细胞计数仪计数，计数时可用5ml无血清培养基吹散沉淀后再补加剩余液体，取样时分别从混匀的细胞悬液上、下段各取两个样进行计数求平均值，减少因取操作造成计数结果的不准确。

3、细胞培养

按照步骤2每传代一次细胞增殖约1倍，将细胞传至p4代，在p4代细胞重悬接种时，按每细胞工厂0.25l的加液量将细胞按2×10⁴/ml重悬后，接种于细胞工厂中。接种前用pbs或培养液将细胞贴壁面润湿，有利于细胞接种均匀。接种前应将悬液摇晃均匀，将液体均匀分至各层，保证接种至每层细胞数量一致。

将接种好的细胞放入co2培养箱，37℃、5%二氧化碳浓度进行培养24小时；培养24小时后拧松培养容器一端的盖子，将气泵放入co2培养箱中另外一层，在培养容器另一端接空气过滤滤器，将气泵与滤器进气端连接，调节输气参数，避免因输气过快造成容器内压力上升而损坏容器，造成污染。在培养4-5天后细胞融合度达到50～60%收获细胞。

无菌操作向细胞工厂中加入tryple消化液25ml（也可用体积比4:1的质量分数为0.25%胰蛋白酶和0.1%edta自行配制的消化液），迅速将消化液均分至隔层，摇晃使消化液覆盖整个细胞培养面；转移至co2培养箱37℃孵育4min，待60-70％的细胞不再贴壁，移入预先加有25ml终止液（优选无血清培养液，也可使用含血清的dmem培养液）的离心管。再向细胞工厂中加入tryple消化液25ml，孵育1～2min，再加入25ml相同终止液，并迅速将终止液均分至隔层，摇晃与消化液混匀。收集两次终止后的所有液体，每分钟800转离心6分钟；离心结束弃上清，用pbs平衡盐溶液重悬计数，离心后可重复步骤3连续进行培养，依次获取p7、p14代细胞人表皮细胞。

按照传统方法也对获取到的人表皮细胞进行大规模培养，步骤如下：在种子细胞获取后按照步骤2每传代一次细胞增殖约1倍，将细胞传至p7、p14代，同样获取p7、p14代细胞人表皮细胞。将两种方法培养时间和细胞收获量进行统计如表1。

表1本发明和传统方法细胞收获量比较

计数结果显示，收获相同代次的细胞，本方法比传统培养方法节约时间约2-3天，相同培养时间本方法细胞获取量比传统方法多2-4倍，同时减少了细胞传代、消化操作大大降低了污染风险。收获的细胞可直接用于后续皮肤构建生产或细胞检测试验中。

将传代操作前（p4代）的细胞在显微镜下拍照（图1），按传统方法和本发明所述方法进行正常传代至p7、p14代细胞状态如（图2），结果表明，相同的细胞采用传统方法和本发明所述方法进行培养，传统方法细胞形态比本发明方法差，细胞边缘摊开，细胞核弥散，核仁不明显，且衰老细胞占比较大，本发明所述方法p14代的细胞边缘清晰，衰老细胞占比明显较传统方法小。

取本发明第2步扩增方法扩增的融合度约60%的p7细胞，分别用传统方法和本发明方法按1.6e5/cm²接种进行培养，传统组按照48小时消化收集一次细胞，本发明方法按照相同培养条件接种2个容器，每24小时消化收集一个，计数，48收集的全部按照相同培养条件接种2个容器，每24小时消化收集一个，计数，根据容器内细胞使用比例，计算出一个工厂细胞扩增量，如此传代至p14。计算每次传代细胞计数总量，绘制细胞增殖图。从图3细胞增殖曲线看，同样的接种密度，在相同时间里，本发明方法细胞获取量明显比传统方法多。随着细胞衰老或分化，细胞增殖能力逐渐减弱。结合图2结果说明采用本发明培养方法表皮细胞能明显延长其传代次数，有利于获取更多细胞。

实施例2

本实施例以培养小鼠表皮细胞为例，进行说明。

1、小鼠种子表皮细胞的获取

取新生小鼠，颈椎脱臼处死，浸入70％乙醇溶液消毒；除去皮肤基底的筋膜和脂肪；中性蛋白酶，4℃孵育12h左右；分离真皮和表皮，收集表皮用0.25%的胰蛋白酶消化8min，消化结束加入等体积终止液（含血清的dmem培养液），pbs溶液悬液计数，1000转/分钟，离心10分钟。离心结束用k-sfm培养基按每瓶4×10⁴～5×10⁴个/cm²接种37℃、5％co2条件下培养，每2～3d换液；在细胞融合之前进行传代，大约为接种细胞后1周左右。24h更换培养液，此时细胞标记为p0代。

2、细胞扩增

待细胞融合度达到60-70％，弃培养液；加入消化液（0.25%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸混合液），消化液最低用量为覆盖整个细胞培养面，37℃孵育4min，待80-90％的细胞不再贴壁，加入终止液（含血清的dmem培养液），终止消化，收集悬液，1000转/分钟，离心10min；弃上清，用k-sfm培养基重悬细胞沉淀，取样计数，

3、细胞培养

按照步骤2每传代一次细胞增殖约1倍，将细胞传至p2代，在p2代细胞重悬接种时，按每细胞工厂1.25l的加液量将细胞按1.5×10⁴/ml重悬后，接种于细胞工厂中。接种前用pbs或培养液将细胞贴壁面润湿，有利于细胞接种均匀。接种前应将悬液摇晃均匀，将液体均匀分至各层，保证接种至每层细胞数量一致。

将接种好的细胞放入co2培养箱，37℃、5%二氧化碳浓度进行培养24小时，拧松培养容器一端的盖子，将气泵放入co2培养箱中另外一层，在培养容器另一端接空气过滤滤器，将气泵与滤器进气端连接，调节输气参数，避免因输气过快造成容器内压力上升而损坏容器，造成污染。在培养3-6天后细胞融合度达到50～70%收获细胞。

无菌操作向细胞工厂中加入消化液125ml（体积比9:1的胰蛋白酶和edta，胰蛋白酶质量浓度为0.25%，edta质量浓度为0.1%），迅速将消化液均分至隔层，摇晃使消化液覆盖整个细胞培养面；转移至co2培养箱37℃孵育4min，待60-70％的细胞不再贴壁，移入预先加有125ml终止液（优选无血清培养液，也可使用含血清的dmem培养液）的离心管。再向细胞工厂中加入同样的消化液125ml，孵育2min，再加入125ml相同终止液，并迅速将终止液均分至隔层，摇晃与消化液混匀。收集两次终止后的所有液体，1000转/分钟，离心10min；离心结束弃上清，用pbs平衡盐溶液重悬计数，离心后可重复步骤3连续进行培养，获取大规模培养的小鼠表皮细胞。

实施例3

本实施例以培养牛表皮细胞为例，进行说明。

1、牛种子表皮细胞的获取

取牛耳内部皮肤1cm²左右，用75%酒精浸泡1min，用pbs冲洗3遍，将组织进入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜，揭下表皮，以0.25%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸混合液将收集的表皮消化成单个细胞悬液，200目过滤，离心，计数，按3×10⁶/瓶接种，共加入添加有egf、牛血清白蛋白、氢化可的松等添加剂的mcdb153培养液10ml，将培养瓶置于37℃、5%co2培养箱中进行培养，24h更换培养液，此时细胞标记为p0代。

2、细胞扩增

待种子细胞融合度达到50-65％，弃掉培养液；在培养瓶中加入消化液（0.25%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸混合液），培养箱37℃孵育6min，待大部分细胞不再贴壁，终止消化，收集终止后悬液，800rpm/min离心6min；弃上清，用mcdb153培养液重悬计数。

3、细胞培养

按照步骤2每传代一次细胞增殖约1倍，将细胞传至p6代，在p6代细胞重悬接种时，按每细胞工厂0.5l的加液量将细胞按2.8×10⁴/ml重接种细胞工厂。接种前培养液将细胞贴壁面润湿，有利于细胞接种均匀。接种前应将悬液摇晃均匀，将液体均匀分至各层，保证接种至每层细胞数量一致。

将接种好的细胞放入co2培养箱，37℃、5%二氧化碳浓度进行培养24小时拧松培养容器一端的盖子，将气泵放入co2培养箱中另外一层，在培养容器另一端接空气过滤滤器，将气泵与滤器进气端连接，调节输气参数，避免因输气过快造成容器内压力上升而损坏容器，造成污染。在培养4-7天后细胞融合度达到50～60%收获细胞。

无菌操作向细胞工厂中加入50ml消化液（体积比2:1的质量分数为0.25%胰蛋白酶和0.1%edta）（体积比2:1的胰蛋白酶和edta，胰蛋白酶质量浓度为0.25%，edta质量浓度为0.1%），迅速将消化液均分至隔层，摇晃使消化液覆盖整个细胞培养面；转移至co2培养箱37℃孵育6min，待60-70％的细胞不再贴壁，移入预先加有50ml终止液（优选无血清培养液，也可使用含血清的dmem培养液）的离心管。再向细胞工厂中加入同样的消化液50ml，孵育3min，再加入50ml相同终止液，并迅速将终止液均分至隔层，摇晃与消化液混匀。收集两次终止后的所有液体，每分钟800转离心6分钟；离心结束弃上清，用pbs平衡盐溶液重悬计数，离心后可重复步骤3连续进行培养，获取大规模培养的牛表皮细胞。

同时，本发明可在确定目标细胞代次的情况下通过在一定范围内改变细胞接种量和细胞生长时间来达到所需细胞代次，例如需要p7代细胞，可以按9×10⁶个/工厂接种p5代细胞培养3天，也可以按5×10⁶个/工厂接种p4代细胞培养4天。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。