本发明涉及一种生产3-羟基丙酸共聚物的重组菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
3-羟基丙酸(3-hydroxypropionate,3-hp)是美国能源部公布的未来全球最具开发潜力的12种高附加值生物基化工产品之一，具有广阔的应用前景和很高的经济价值。以3-羟基丙酸为原料，可以生产多种具有商业价值的化合物，如丙烯酸、1,3-丙二醇、丙二酸、丙内酯等。此外，它还可以通过聚合生成聚3-羟基丙酸。
聚3-羟基丙酸(p3hp)是一种新型生物可降解性塑料，具有优异的生物材料性质和机械性能，比如具有高机械强度和拉伸强度(>400mpa)、高断裂伸长量(>300％)、生物降解性、生物兼容性、不溶于水、无毒、压电性、热塑性等。相对于其它两种研究较多的可生物降解塑料聚3-羟基丁酸(phb)和聚乳酸(pla)来说，p3hp具有更优越的性能：它比pla具有更好的稳定性不会水解，又由于碳链骨架中没有甲基而比phb更易被微生物降解。作为新型功能材料，p3hp可广泛应用于地膜、矫形外科、个人卫生用品、药物控释、包装等领域。但是，p3hp在性质上还存在一定缺陷，如熔点只有76℃，在一定程度上限制了工业化应用。
现有技术中，中国专利cn102174542b中在制备3-羟基丙酸均聚物或共聚物时，需要加入昂贵的1,3-丙二醇或1,4-丁二醇等这些结构类似物质来合成聚合物的单体，会大大增加生产成本。中国专利cn104046659b中，通过加入3-羟基戊酸单体合成3-羟基丙酸的共聚物，使原有物质的熔点得到提高，但是所使用的的代谢途径比较复杂，引入了比较多的外源基因，加重了代谢负担。
技术实现要素：
为解决现有技术中使用昂贵前体物质增加了生产成本、代谢途径过于复杂加重代谢负担等问题，本发明首先提供了一种生产3-羟基丙酸共聚物的重组菌，所使用的代谢途径更为简单，可以利用简单的廉价碳源作为发酵底物。
所述重组菌是以大肠杆菌为出发菌株，导入甘油脱水酶基因dhab123、甘油脱水酶激活因子基因gdrab、丙醛脱氢酶的基因pdup、丙酰辅酶a转移酶基因pct和聚羟基脂肪酸合成酶的基因phac，得到重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述编码甘油脱水酶的基因dhab123的三个亚基在ncbi的基因id分别为dhab1-7947197、dhab2-7947198、dhab3-7947200，编码甘油脱水酶激活因子的基因gdrab的两个亚基在ncbi的基因id为gdra-6936977、gdrb-6938011，编码丙醛脱氢酶的基因pdup在ncbi的基因id为4716036，丙酰辅酶a转移酶pct在ncbi的基因编号为11185364，编码聚羟基脂肪酸合成酶的基因phac在ncbi的基因id为1041855。
本发明还提供一种构建所述重组菌的方法，包括以下步骤：
1)克隆甘油脱水酶基因dhab123，将所得基因与质粒pacycduet-1进行酶切、连接，并转入e.colidh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pacycduet-dhab123；
2)克隆甘油脱水酶激活因子的基因gdrab，将所得基因与步骤1)所得载体pacycduet-dhab123进行酶切、连接，并转入e.colidh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pacycduet-dhab123-gdrab；
3)克隆丙醛脱氢酶的基因pdup，将所得基因与步骤2)所得载体pacycduet-dhab123-gdrab进行酶切、连接，并转入e.colidh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体pacycduet-dhab123-gdrab-pdup；
4)克隆丙酰辅酶a转移酶的基因pct，将所得基因与质粒petduet进行酶切、连接，并转入e.colidh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体petduet-pct；
5)克隆聚羟基脂肪酸合成酶的基因phac，将所得基因与步骤4)所得petduet-pct进行酶切、连接，并转入e.colidh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，获得重组载体petduet-pct-phac；
6)将步骤3)与步骤5)所获得的重组载体，转化到宿主escherichiacolijm109(de3)感受态细胞中，获得大肠杆菌重组菌。
所述甘油脱水酶基因dhab123在ncbi的基因id分别为dhab1-7947197、dhab2-7947198、dhab3-7947200，甘油脱水酶激活因子基因gdrab在ncbi的基因id为gdra-6936977、gdrb-6938011，丙醛脱氢酶基因pdup在ncbi的基因id为4716036，丙酰辅酶a转移酶基因pct在ncbi的基因编号为11185364，编码聚羟基脂肪酸合成酶的基因phac在ncbi的基因id为1041855。
本发明还提供一种应用所述重组菌发酵生产3-羟基丙酸共聚物的方法，步骤如下：
1)在lb培养基中活化重组菌，培养10h获得种子液；
2)将步骤1)所得的种子液，与含有氨苄青霉素与氯霉素的发酵培养基，按照体积比种子液：发酵培养基＝(1～2):(100～130)的比例接种后，35℃～37℃，180～220rpm条件下培养至od600在0.6～0.8，获得培养液；
3)向所得的培养液中加入诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.01～0.1mm，然后转入30～33℃，180～220rpm条件下继续培养24～48小时。
优选的，步骤4)所述分离提纯的具体操作为：
发酵结束后，收集菌体，15000rpm离心10min，水洗两遍，无水乙醇洗一遍。将菌体放置于冻干机中冻干，干燥后的菌体通过索氏提取仪利用60℃的氯仿进行萃取，萃取6h后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得产品。
在本发明的一种实施方式中，步骤2)所述培养条件为：37℃，180rpm。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的碳源为甘油，氮源为无机氮源，如氯化铵或硫酸铵等，其他成分为无机盐。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基的配方为：20g/l甘油，1.5g/l三水合磷酸氢二钾，3g/l硫酸铵，1.9g/l氯化钾，1.09g/l一水合柠檬酸，1.14g/l二水合柠檬酸钠，0.138g/l七水合硫酸亚铁，0.24g/l硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素。
在本发明的一种实施方式中，微量元素母液的配方为：6.0g/l七水合硫酸亚铁，2.0g/l硼酸，2.0g/l四水合氯化锰，0.8g/l四水合钼酸铵，0.2g/l五水合硫酸铜。
在本发明的一种实施方式中，将重组菌活化后，按1％的接种量接种到含100μg·ml-1氨苄青霉素和100μg·ml-1氯霉素的发酵培养基中，37℃、180rpm条件下振荡培养，待od600达到0.6时，温度调节至30℃，并加入0.05mmiptg进行诱导，每隔12h用氨水调节ph至7，初次诱导后48h终止发酵。
本发明所获得的的有益效果如下：
为了解决现有技术需要加入昂贵的前体物质作为原料导致生产成本偏高、代谢途径复杂加重代谢负担、3-羟基丙酸均聚物熔点偏低等问题，本发明以escherichiacolijm109(de3)为宿主菌株，通过过表达关键合成酶基因，构建获得工程菌，以廉价甘油为碳源，在较短的代谢路径下，实现了3-羟基丙酸共聚物(聚3-羟基丙酸-co-乳酸，p(3hp-co-lac))的首次合成。本发明所构建的重组菌具有利用甘油为唯一碳源合成3-羟基丙酸共聚物的特点，发酵48h，可以得到1.6g/l的p(3hp-co-lac)，比较3-羟基丙酸均聚物，熔点提高了39℃。
定义和缩写
在本文中使用下列的缩写或简称：
甘油脱水酶基因：dhab123
甘油脱水酶激活因子基因：gdrab
丙醛脱氢酶基因：pdup
丙酰辅酶a转移酶基因：pct
聚羟基脂肪酸合成酶基因：phac
大肠杆菌(escherichiacoli):e.coli
肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)：k.pneumoniae
沙门氏菌(salmonellatyphimurium)：s.typhimurium
埃氏巨型球菌(megasphaeraelsdenii)：m.elsdenii
恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)：p.putida
聚3-羟基丙酸：p3hp
聚3-羟基丙酸-co-乳酸：p(3hp-co-lac)
“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。
具体实施方式
下面通过实例来进一步阐明本发明。但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等若无特殊说明，均可从商业途径获得。
所用酶试剂购自mbifermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收dna片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
培养基配方：
1)种子液摇瓶培养基
lb培养基：5g/l酵母粉，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。
2)摇瓶发酵培养基
基本改良培养基：20g/l甘油，1.5g/l三水合磷酸氢二钾，3g/l硫酸铵，1.9g/l氯化钾，1.09g/l一水合柠檬酸，1.14g/l二水合柠檬酸钠，0.138g/l七水合硫酸亚铁，0.24g/l硫酸镁，0.1％(v/v)微量元素。
微量元素母液的配方：6.0g/l七水合硫酸亚铁，2.0g/l硼酸，2.0g/l四水合氯化锰，0.8g/l四水合钼酸铵，0.2g/l五水合硫酸铜。
在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100mg/l的氨苄青霉素和100μg·ml-1氯霉素。
实施例1合成3-羟基丙酸共聚物的重组菌构建
1)-3)载体pacycduet-dhab123-gdrab-pdup的构建
1)获取来源于k.pneumoniae的甘油脱水酶基因dhab123(三个亚基在ncbi的基因id分别为dhab1-7947197、dhab2-7947198、dhab3-7947200)，是以k.pneumoniae基因组为模板，通过pcr扩增获得(引物：5'-cgccatatgaaaagatcaaaacgatttg-3'和5'-cacggtaccgcttagcttcctttacgcag-3')，具体扩增程序如下：
pcr结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收大小为2700bp左右的目的片段。
将获得的dhab123基因片段和质粒pacycduet-1用ndei和kpni在37℃水浴锅中酶切3.5h，酶切产物进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收酶切产物。将载体与mcr基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氯霉素的lb固体平板上，pcr(同扩增程序)筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pacycduet-dhab123后，再通过限制性酶酶切和测序(华大基因)鉴定，确认已将基因正确插入载体中。
2)获取来源于k.pneumoniae的甘油脱水酶激活因子的基因gdrab(两个亚基在ncbi的基因id为gdra-6936977、gdrb-6938011)，是以k.pneumoniae基因组为模板，通过pcr扩增分别获得gdra和gdrb(gdra扩增引物：5'-gagaattcgtgagcggaggtcagcatgc-3'和5'-cagaagcttcagtttctctcacttaacg-3'；gdrb扩增引物：5'-cagctttggtcagtgggagatctaaaacgaggggaccgtcatgtc-3'和5'-ttagatctcccactgaccaaagctg-3')，扩增程序如下：
pcr结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收片段gdra和gdrb。再以gdra和gdrb为模板，通过搭桥pcr扩增获得gdrab(引物：5'-gagaattcgtgagcggaggtcagcatgc-3'和5'-ttagatctcccactgaccaaagctg-3')。扩增程序如下
pcr结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收片段gdrab基因片段，将获得的gdrab基因片段和质粒pacycduet-dhab123用ecori和hindiii在37℃条件下酶切3.5h，回收酶切产物，再进行连接，载体与gdrab基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氯霉素的lb固体平板上，pcr筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pacycduet-dhab123-gdrab后，再通过限制性酶(ecori和hindiii)酶切和测序(华大基因)鉴定，确认基因片段已经正确插入到载体中。
3)获取来源于s.typhimurium的丙醛脱氢酶的基因pdup(在ncbi的基因id为4716036)，是以s.typhimurium的基因组为模板，通过pcr扩增获得(引物：5'-caggatccgatgaatacttctgaactcg-3'和5'-cagaatccttacgctttagctttaacg-3')，扩增程序如下
pcr结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收大小为1500bp左右的目的片段。
将获得的pdup基因片段和质粒pacycduet-dhab123-gdrab用bamhi和ecori在37℃水浴锅中酶切3.5h，利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收酶切产物。将回收的载体与pdup基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氯霉素的lb固体平板上，pcr筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒pacycduet-dhab123-gdrab-pdup后，再通过限制性酶(bamhi和ecori)酶切和测序(华大基因)鉴定，确认基因片段已经正确插入到载体中。
4)-5)载体petduet-pct-phac的构建
4)获取来源于m.elsdenii的丙酰辅酶a转移酶基因pct(丙酰辅酶a转移酶pct在ncbi的基因编号为11185364)，是以m.elsdenii基因组为模板，通过pcr扩增获得(引物：5'-ccatatgatgcgtaaagttgaaatcatc-3'和5'-ccctcgagttattttttcagacccatcggac-3')，扩增程序如下
pcr结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收大小为1600bp左右的目的片段。
将获得的pct基因片段和质粒petduet用ndei和xhoi在37℃水浴锅中酶切3.5h，利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收酶切产物。将回收后的载体与pct基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氨苄青霉素的lb固体平板上，pcr筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒petduet-pct后，再通过限制性酶(ndei和xhoi)酶切和测序鉴定，确认基因片段已经正确插入到载体中。
5)获取来源于p.putida的聚羟基脂肪酸合成酶的基因phac(在ncbi的基因id为1041855)，是以p.putida基因组为模板，通过pcr扩增获得(引物：5'-cgggatccgatgagtaacaagaacaacgatg-3'和5'-acggagctctcaacgctcgtgaacgtaggtg-3')，扩增程序如下
pcr结束后，进行1％(wt/v)琼脂糖凝胶电泳，再利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收大小1800bp左右的目的片段。
将获得的phac基因片段和质粒petduet-pct用bamhi和saci在37℃水浴锅中酶切3.5h，利用回收试剂盒(omegagelextractionkit)回收酶切产物。将回收得到的载体与phac基因片段按照摩尔比1:5的比例，16℃连接6h以上，连接产物转化e.colidh5α，然后涂布在加有100μg·ml-1氨苄青霉素的lb固体平板上，pcr筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒petduet-pct-phac后，再通过限制性酶(bamhi和saci)酶切和测序鉴定，确认基因片段已经正确插入到载体中。
6)将pacycduet-dhab123-gdrab-pdup和petduet-pct-phac导入e.colijm109(de3)合成p(3hp-co-lac)
将步骤3)获得的载体pacycduet-dhab123-gdrab-pdup与步骤5)获得的载体petduet-pct-phac导入e.colijm109(de3)感受态细胞，涂布在含有100μg·ml-1氨苄青霉素和100μg·ml-1氯霉素的lb固体平板；涂布后的平板置于37℃恒温培养箱，继续培养至长出单克隆。
实施例2发酵生产3-羟基丙酸共聚物
将实施例1获得的工程菌株单克隆在lb培养基中进行活化，培养10h获得种子液，种子液按种子液：基本改良液体培养基体积比1:100的体积比例接种到含有100ml的基本改良液体培养基的500ml挡板摇瓶中(内含100μg·ml-1氨苄青霉素和100μg·ml-1氯霉素)，37℃、180rpm条件下振荡培养。od600达到0.6左右时，温度调节至30℃，并加入0.05mmiptg进行诱导。每隔12h用氨水调节ph至7左右，初次诱导后48h终止发酵。
发酵结束后，收集菌体，15000rpm离心10min，水洗两遍，无水乙醇洗一遍。将菌体放置于冻干机中冻干，干燥后的菌体通过索氏提取仪利用60℃的氯仿进行萃取，萃取6h后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得产品。将得到的产品通过核磁共振(avanceiii600,bruker,switzerland)对其进行定性分析，核磁图谱证实确实获得了产物p(3hp-co-lac)，产量1.6g/l。
利用差示扫描量热仪(diamonddsc)对产物的熔点进行检测，所得p(3hp-co-lac)的熔点为115℃，比原有材料p3hp的熔点提高了39℃。
实施例3发酵生产3-羟基丙酸共聚物
将实施例1获得的工程菌株单克隆在lb培养基中进行活化，培养10h获得种子液，种子液按种子液：基本改良液体培养基体积比2:100的体积比例接种到含有100ml的基本改良液体培养基的500ml挡板摇瓶中(内含100μg·ml-1氨苄青霉素和100μg·ml-1氯霉素)，37℃、220rpm条件下振荡培养。od600达到0.8左右时，温度调节至33℃，并加入0.1mmiptg进行诱导。每隔12h用氨水调节ph至7左右，初次诱导后24h终止发酵。
发酵结束后，收集菌体，15000rpm离心10min，水洗两遍，无水乙醇洗一遍。将菌体放置于冻干机中冻干，干燥后的菌体通过索氏提取仪利用60℃的氯仿进行萃取，萃取6h后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得产品。将得到的产品通过核磁共振(avanceiii600,bruker,switzerland)对其进行定性分析，核磁图谱证实确实获得了产物p(3hp-co-lac)，产量0.9g/l。
利用差示扫描量热仪(diamonddsc)对产物的熔点进行检测，所得p(3hp-co-lac)的熔点为115℃，比原有材料p3hp的熔点提高了39℃。
实施例4发酵生产3-羟基丙酸共聚物
将实施例1获得的工程菌株单克隆在lb培养基中进行活化，培养10h获得种子液，种子液按种子液：基本改良液体培养基体积比1:130的体积比例接种到含有100ml的基本改良液体培养基的500ml挡板摇瓶中(内含100μg·ml-1氨苄青霉素和100μg·ml-1氯霉素)，35℃、180rpm条件下振荡培养。od600达到0.6左右时，温度调节至30℃，并加入0.01mmiptg进行诱导。每隔12h用氨水调节ph至7左右，初次诱导后48h终止发酵。
发酵结束后，收集菌体，15000rpm离心10min，水洗两遍，无水乙醇洗一遍。将菌体放置于冻干机中冻干，干燥后的菌体通过索氏提取仪利用60℃的氯仿进行萃取，萃取6h后，利用旋转蒸发仪除去氯仿，获得产品。将得到的产品通过核磁共振(avanceiii600,bruker,switzerland)对其进行定性分析，核磁图谱证实确实获得了产物p(3hp-co-lac)，产量1.1g/l。
利用差示扫描量热仪(diamonddsc)对产物的熔点进行检测，所得p(3hp-co-lac)的熔点为115℃，比原有材料p3hp的熔点提高了39℃。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
sequencelisting
<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所
<120>一种生产3-羟基丙酸共聚物的重组菌及其构建方法和应用
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