一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种3-羟基丙酸的制备方法，特别涉及一种生产3-羟基丙酸的重组大 肠杆菌及其制备方法和应用。 (二)
【背景技术】
[0002] 纵观世界经济发展，以石油为基础的化石能源起到了功不可没的作用，但随着化 石能源日益枯竭、全球油价不断飙升、环境污染日趋严重等问题的出现，许多国家都更加重 视对可再生能源、环保能源以及新型能源的开发与研究；同时随着人类科学技术的不断进 步，通过不断开发新型化学、生物方法，将使以生物资源为基础的生物加工过程替代传统化 学工业成为可能。因此，从化石经济向生物经济过渡，由生物基原料代替石油基原料生产化 工原料，是社会经济发展的必然趋势。
[0003] 近年来，生物柴油作为一种极具发展前景的生物资源得到了快速的发展，而在此 过程中，每生产10吨生物柴油就会产生1吨甘油，这不可避免地造成了市场上廉价甘油的过 剩，因此，加快甘油下游产品开发的基础研究迫在眉睫。为了解决这一问题，业界兴起了以 甘油为原料生产其他化学品的热潮，当前利用甘油的有效途径包括:生产乙醇，制备1，3_丙 二醇，合成环氧氯丙烷，生产乙二醇，生产乳酸，合成二羟基丙酮等。研发甘油的革新用途， 建立其下游化学品开发利用的有效途径，降低生物柴油生产成本，提高资源利用率成为这 一新兴能源产业面临的巨大挑战，也是科学家们不断探索的新问题。
[0004] 3-羟基丙酸（3-HP)是一种三碳无手性有机酸，与乳酸是同分异构体，可与水、醇、 醚等多种有机溶剂互溶。其性质较为活泼，工业上可以用来合成很多重要的化工产品，如脱 水生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，与醇发生酯化作用生成酯，还可通过还原作用生成1，3-丙 二醇等。另外，还可用于生产涂料、胶黏剂、水处理化学品和个人护理用品等。鉴于3-HP在商 业上的重大开发价值，2004年，美国能源部也将3-HP列为当前世界上12中最具开发潜力的 化工产品之一。因此，以甘油为原料生物合成3-羟基丙酸的研究有望成为甘油下游产品开 发的另一个具有重要价值的新途径。
[0005] 3-HP的合成方法大致可分为化学合成法和生物合成法两大类。目前，3-HP的制备 主要依靠化学法，即将邻卤代醇与氰化钾作用生成的3-羟基丙腈进行水解或通过Reformat sky反应来制备3-HP。此外，将丙烯酸催化水解也可得到3-HP，这是市场上3-HP的主要来源。 然而由于丙烯酸和丙烯腈易燃，且工艺需高温操作，故化学合成法的安全性较低、对设备的 要求也较高。同时，由于丙烯酸的原料来源限制，该方法生产的3-HP已经远不能满足市场的 需求，这在很大程度上限制了 3-HP化学合成技术的发展，并且导致了 3-HP的价格高居不下， 目前3-HP的国内市场售价高达8.5万元/吨，这也进一步阻碍了其下游产品的开发利用。与 之相反，以甘油为原料采用生物合成法生产3-HP不但可以有效利用生物柴油生产过程中产 生的大量副产物，延伸生物柴油产业链，还能有效降低3-HP的生产成本，加快其工业化应用 的进程。
[0006] 生物合成法合成3-HP包括两种方法：（1)采用野生菌株；（2)构建基因工程菌株。早 在1962年就有通过微生物直接发酵合成3-HP的报道，然而接下来却长期处于实验室研究当 中，并没有大规模生产。随着基因工程技术的发展，构建基因工程菌株生产3-HP，提高3-HP 的产量，已经成为现在研究的热点。目前，按照利用底物不同的所构建的基因工程菌有两 种：
[0007] A.以葡萄糖为底物
[0008] 美国Cargill公司与陶氏公司开展了 "以谷物类碳水化合物生产3-HP的发酵新工 艺"这一合作项目。该公司利用玉米制得葡萄糖，然后通过构建基因工程菌来发酵制得3-HP，其路径主要包括:从橙色绿曲挠菌中克隆乳酰辅酶A脱水酶活性的多肽编码基因，从人 类细胞中克隆有羟基丙酰辅酶A脱水酶活性的酶编码基因，前者将乳酰辅酶A脱水生成丙烯 酰辅酶A，后者可催化丙烯酰辅酶A水合生成羟基丙酰辅酶A。羟基丙酰辅酶A在一定条件下 脱去辅酶A生成羟基丙酸。
[0009] B.以甘油为底物
[0010] 重组菌株催化甘油合成3-HP需要甘油脱水酶和醛脱氢酶的共同作用。第一步是甘 油脱水酶在辅酶维生素 B12的作用下，将甘油脱水转化成3-羟基丙醛(3-HPA);第二步是3-HPA在醛脱氢酶的氧化作用下生成3-HP，在此过程中生成还原当量NADH，产生的3-HP是细胞 代谢的终产物，可在发酵液中高度聚集，其主要代谢反应路径如图1所示。其中编码甘油脱 水酶的基因为dhaB基因，主要存在于克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、乳酸杆菌 (Lactobacillus reuteri)、弗氏朽1 檬菌（Citrobacter freundii)、巴氏梭状芽抱杆菌 (Clostridium pasteuianu)中，而醛脱氢酶则负责将3-HPA转化成3-HP，编码醛脱氢酶的基 因有四种，分别为:aldh4、ald2、aldA和aldB，前两种来源于酵母菌，后两种则来源于大肠杆 菌。
[0011] 迄今为止，构建基因工程菌制备3-HP的研究取得了一定的进展，但是还存在诸多 问题：（1)以大肠杆菌为宿主，3-HP产量相对较高，但由于其自身不具有甘油脱水酶活性，构 建过程复杂，并且大肠杆菌自身不能生成甘油脱水酶的辅酶维生素 B12，需要在发酵体系中 额外加入，因其价格昂贵，从而使发酵成本大增；（2)代谢过程中会产生各种副产物，分离纯 化困难；（3)重组菌中甘油脱水酶和醛脱氢酶的活性不平衡，且辅酶NAD+再生困难也是制约 3-HP产量的重要原因。 (三)
【发明内容】
[0012] 本发明目的是针对现有问题，提供了一株敲除菌，用于降低副产物1，3_丙二醇（1， 3-PD0)的产量，同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD+的菌株。
[0013] 本发明采用的技术方案是：
[0014] 本发明提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是将甘油脱水酶基因 dhaB123、 甘油脱水酶再激活因子基因 gdrA(甘油脱水酶基因 dhaB123和甘油脱水酶再激活因子基因 gdrA的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示）、α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体编码基因 TUkgsadh (核苷酸序列为SEQ ID N0.3所示）和甘油三磷酸脱氢酶编码基因 gpdl(核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示）导入宿主菌中构建而成;所述宿主菌为敲除乙醛还原酶/醇脱氢酶基因 yqhD (Gene ID:947493)的大肠杆菌，所述α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体是将α-酮戊二酸半醛脱 氢酶KGSADH(核苷酸序列为SEQ ID Ν0.2所示）的120位谷氨酸突变为天冬氨酸，219位脯氨 酸突变为丙氨酸获得的。
[0015] 进一步，所述甘油脱水酶基因 dhaB123和甘油脱水酶再激活因子基因 gdrA通过重 组载体pACYCDuet-tac-dhaBl 23-gdrA导入宿主菌中。
[0016] 进一步，所述α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体基因 TUkgsadh通过重组载体 pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh 导入宿主菌中。
[0017] 进一步，所述甘油三磷酸脱氢酶编码基因 gpdl通过重组载体pCDFDuet-tac-gpdl-TUkgsadh导入宿主菌中。
[0018] 进一步，所述大肠杆菌为E.coli W3110。
[0019] 本发明还提供一种所述重组大肠杆菌在合成3-羟基丙酸中的应用，具体所述的应 用：将重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的发酵培养基中（以甘油 为底物），在37°C、150rpm条件下振荡培养至OD600达到0.4~0.8时，向发酵液中加入终浓度 0.01~0.5mM的IPTG，同时加入终浓度5g/L的VB 12(维生素 B12)，在28°C、150rpm条件下诱导 发酵，发酵结束获得含3-羟基丙酸的发酵液，将发酵液分离纯化，获得3-羟基丙酸;所述发 酵培养基浓度组成为：甘油 10_30g/L(优选30g/L)，NaCl lg/L，MgS〇4 · 7H20 0.25g/L， Na2HP〇4 · 12H20 22.7g/L，KH2P〇43g/L，酵母膏4g/L，（NH4)2S〇43.2g/L，溶剂为去离子水，pH 值为7.0。
[0020] 进一步，优选所述IPTG终浓度为0 · OlmM。
[0021] 进一步，所述重组大肠杆菌在发酵培养前先进行斜面活化和种子培养，所述斜面 活化为:将重组大肠杆菌接种至含50mg/L氯霉素和50mg/L硫酸链霉素的LB固体培养基培养 基，在37°C培养16h，获得活化后的重组大肠杆菌;所述种子培养为:将活化后的重组大肠杆