一种利用重组大肠杆菌合成聚3-羟基丙酸的方法
【专利摘要】一种利用重组大肠杆菌合成聚3-羟基丙酸的方法。本发明保护了一种重组大肠杆菌菌株，以及所述重组大肠杆菌菌株的构建方法，和使用该重组大肠杆菌菌株进行生物法合成聚3-羟基丙酸的方法。本发明的有益效果是：以甘油为底物生物合成P3HP的代谢途径中，NAD+作为辅酶在催化3-羟基丙醛生产3HP的同时会产生大量的NADH。NADH的升高所造成的重组菌体内氧化还原平衡失调是限制P3HP产量进一步提高，本发明所述重组大肠杆菌菌株代谢甘油生成1,3-PDO的过程会消耗NADH，因此在P3HP的合成途径中引入1,3-PDO的合成，可以平衡菌体内还原力。有效的降低质粒的丢失率，保持质粒稳定性。
【专利说明】一种利用重组大肠杆菌合成聚3-羟基丙酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体的涉及一种利用重组大肠杆菌合成聚3-羟 基丙酸的方法。
【背景技术】
[0002] 随着人民生活水平的不断提高，关于生物可降解和绿色环保材料的研宄倍受关 注。这类材料不仅可降解，且具有良好的生物相容性，因此在环境、生物医药等领域具有 广泛应用前景。聚3-羟基丙酸[P-(3_HP)]是一种新型生物可降解高分子，它不但具有良 好的生物降解性和生物相容性，而且高分子量的P (3-HP)具有很高的机械强度和拉伸强度 (MOOMPa)以及较大的断裂伸长率等优异性能。从而引起世界上一些发达国家的研宄人员 的重视，但至今国际上关于P(3-HP)的合成研宄报道仍然较少。
[0003] 聚轻基脂肪酸醋（Polyhydroxyalkanoates，PHAs)是近二十多年迅速发展 起来的生物可降解材料，是微生物体内合成的一类由3-羟基脂肪酸组成的线性聚 酯的总称，是在细胞内碳氮源不平衡时作为碳源和能源的贮藏物质形成的高分子聚 醋。自Lemoigne在巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium)中首次发现聚轻基丁酸醋 (Poly-hydroxybutyricacid，PHB)后，已有超过150种单体被确定可用来聚合生成PHA。聚 3-轻基丙酸[Poly(3-hydroxypropionate)，P3HP是一种新型的生物可降解塑料，具有优异 的生物材料性质和机械性能，如高机械强度和拉伸强度、高断裂伸长量、生物降解性、生物 相容性、不溶于水、无毒、压电性、热塑性等。目前，聚3-羟基丙酸的化学合成方法以β-丙 内酯开环聚合为主，但丙内酯价格昂贵且为致癌物质，限制了该方法的应用。生物合成 Ρ3ΗΡ的研宄还刚刚起步。在绝大多数生物中3-轻基丙酸（3-Hydroxypropionate，3HP)不 是天然代谢途径产生的化合物，因此合成P3HP需要向培养基中添加与3HP结构相关的化合 物，如3-HP、丙烯酸等。这些前体物质具有细胞毒性，会抑制细胞的生长且价格昂贵，不适用 于大规模工业化生产。为解决这一问题，研宄者构建了分别以廉价碳源（葡萄糖和甘油） 为底物合成P3HP的代谢途径，发酵结束后，利用丙酮-氯仿抽提法得到P3HP，并通过核磁共 振法测定聚合物纯度。同时，利用凝胶渗透色谱法测得P3HP的数均分子量（Mn)和重均分 子量（Mw)分别为1.2X10 5Da和1.78X 105Da。但以葡萄糖为底物的P3HP的合成途径，产 量仅有13mg/L，而以甘油为底物的合成途径，虽然经过发酵条件的优化，产量也远没有达到 工业化生产的要求。这一方面是由于以甘油为底物生产P3HP的过程中，3-羟基丙醛被还原 为3-羟基丙酰辅酶A的过程中产生的NADH无法及时再生成NAD+，导致细胞内NAD+不足， 最终影响了 P3HP的合成。同时，也与发酵过程中携带合成基因的质粒大量丢失有关。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决上述技术问题，在大肠杆菌菌株中整合甘油脱水酶及其激活因子 的合成基因，以及dhaT基因，使重组后的大肠杆菌菌株具有生物合成聚3-羟基丙酸与 1，3_丙二醇的能力，采用的技术方案如下：
[0005] -种重组大肠杆菌菌株，在大肠杆菌基因组上整合甘油脱水酶及其激活因子的合 成基因，以及dhaT基因，重组后的大肠杆菌菌株具有生物合成聚3-羟基丙酸与1，3-丙二 醇的能力。
[0006] 所述dhaT基因是以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为模板，用引物ZG-440和ZG-441 克隆得到的。
[0007] 一种利用所述重组大肠杆菌菌株的构建方法，步骤如下：
[0008] 步骤1 :质粒pET21 (A)的构建：以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为模板，用引物 ZG-440和ZG-441克隆dhaT基因，dhaT片段与质粒pWQ02经HindIII、XhoI酶切后连接； [0009] 步骤2:质粒pRE112(B)的构建：以E. coliBL21的基因组为模板，分别利用引物 ZG-268和ZG-269、引物ZG-270和ZG-271扩增出片段prpR基因两侧同源片段，再以两个扩 增片段为模板，利用引物ZG-268和ZG-271扩增出片段prpR ;限制性内切酶Sac I和Nhe I酶 切PrpR后，将其连接到经过限制性内切酶SacI和XbaI酶切后的质粒pRE112,构建成重组 质粒pRE112(A);再利用限制性内切酶XhoI和XbaI酶切重组质粒pRE112(A)和pWQ04,切 胶回收质粒pRE112(A)和dhaB-gdrAB片段，进行酶连后，构建完成重组质粒pRE112(B);
[0010] 步骤3 :第一次重组：以E. coli/pRE112 (B)为质粒供体菌，以待突变菌种 E. coliBL21 (DE3)作质粒受体菌；将供体菌和受体菌进行活化后，各取I. 5mL，离心后用无 菌水重悬洗2次，以除去抗生素，再用500 μ L的无菌水重悬菌体沉淀后各取100 μ L并混 匀，离心后用50 μ L的1 % DAP重悬菌体，涂布于无抗性平板，于37°C培养12h ;收集平板上 的菌体重悬到无菌水中；将重悬菌液稀释KT1-KT4倍，各倍数均取30 μ L涂布于氯霉素平 板上，于37°C培养24h ;PCR验证单克隆菌落，标记阳性菌；
[0011] 步骤4 :第二次重组：将标记的一次重组阳性单克隆接入无抗性LB试管，于37°C 培养15h ;将菌液稀释KT1-KT6倍，各倍数均取20 μ L涂布于10 %蔗糖平板上，37°C培养 12h ;挑选蔗糖板上的单克隆菌落，分别划到氯霉素平板和10%蔗糖平板，37°C培养IOh ;选 取蔗糖平板上生长而氯霉素平板未生长的菌做PCR验证，标记阳性菌；划蔗糖平板分离单 克隆2次，确保二次重组菌纯净；最终将PCR验证正确、并在氯霉素 LB试管中检测不生长的 菌，于-80°C保存。
[0012] 一种利用所述重组大肠杆菌菌株合成聚3-羟基丙酸的方法，其特征在于，步骤如 下：
[0013] 步骤1 :将所述重组大肠杆菌菌株在LB培养基中活化；
[0014] 步骤2 :活化后，转入1/5装液量的500mL带挡板的三角摇瓶中进行培养基发酵， 接种量1 %，同时加入l〇〇mg/L氨苄青霉素钠和34mg/L氯霉素，37°C、200r/min培养，0D600 达到 0· 6-1. 0 时加入 IPTG (Isopropyl β -D-1-Thiogalactopyranoside)，以及 0· 03g/L维生 素 B12并将培养温度调整到30°C ;培养72h ;
[0015] 步骤3 :72h后，离心收集菌体，用无菌水和95%的乙醇清洗菌体沉淀；冷冻干燥至 恒重得到细胞干重；
[0016] 步骤4 :在室温条件下，向冷干菌体中加入10倍菌体量的丙酮溶剂混合洗涤一次， 蒸发干燥后，将干菌体包好置于索氏提取器中，加入10倍菌体量的氯仿，90°C萃取4h，萃 取完毕后静置冷却，过滤，吸取上清液得澄清聚3-羟基丙酸溶液；
[0017] 步骤5:使用旋转蒸发仪在45°C将氯仿蒸出，蒸馏烧瓶底部的析出物即为提取纯 化得到的3-羟基丙酸聚合物，60°C干燥12h，完全除尽残留氯仿，获得3-羟基丙酸。
[0018] 步骤1所述LB培养基组成为：胰蛋白胨10. Og/L，酵母浸膏5. Og/L，NaCl 10. Og/ L，pH7. 0。步骤2所述进行发酵的培养基组成为：甘油20g/L，（NH4)2SCM 3g/L，葡萄糖3g/ L，KH2PO4 I. 5g/L，KCl I. 9g/L，柠檬酸 lg/L，柠檬酸钠 lg/L，FeSO4 · 7H20 0· 138g/L，微量元 素 lmL/L，维生素 BI 0· 045g/L，ρΗ7· 0。所述微量元素组成为：（NH4)6Mo7Om · 4Η200· 37g/L， H3BO4 2. 47g/L，MnCl2 · 4H20 I. 58g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 29g/L，CuSO4 · 5H20 0· 25g/L。
[0019] 自杀载体是指能在一种宿主内复制但在另一宿主中却不能复制的质粒，当进入寄 主细胞时，要么不能复制而被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。利用自杀 载体的这个特点，将构建的基因缺失或突变的DNA片段克隆入自杀载体，利用缺失基因两 端的同源片段，定位自杀质粒的整合位点。通过接合法将构建的DNA导入受体菌。利用同 源性DNA片段可发生重组的原理，构建精确基因缺失或突变菌株。本实验中使用的自杀 质粒PRE112具有两个筛选标记：正筛选标记氯霉素抗性基因和负筛选标记蔗糖果聚糖酶 (Levansucrase) sacB 基因。
[0020] prpR是大肠杆菌中与丙酸分解相关的基因，它的缺失既不会对整个细胞内的代谢 反应产生影响，还能避免由于丙酸分解导致P3HP产量下降，因此我们选择prpR片段作为甘 油脱水酶基因 dhaB123及其辅助因子gdrAB的插入位点。利用PCR方法成功扩增出prpR基 因上下游同源臂片段，在其中插入dhaB123和gdrAB基因，并连入pRE112自杀质粒载体成 功构建了重组质粒pRE112(B)。将质粒pRE112(B)转化至E. coli菌株中，与E. coli BL21 接合，通过氯霉素抗性LB平板筛选一次重组菌。此时，发生了第一次重组的细菌染色体上 携带有包含氯霉素抗性基因的PRE112整条序列，因而可在氯霉素平板上生长。只要得到抗 性菌即为一次重组菌，PCR验证一次重组菌。
[0021] SacB基因编码蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并且将果糖 聚合成高分子量的果聚糖。但高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用，可造成细 胞死亡。一次重组菌含有sacB基因，在含有蔗糖的条件下无法稳定传代，会逐渐重组丢失 自杀性载体，因此选取蔗糖平板上生长而氯霉素平板未生长的菌做PCR验证，可获得目标 菌株。
[0022] 微生物代谢甘油生成1，3-PD0的过程会消耗NADH，因此在P3HP的合成途径中引 入1，3-PD0的合成，可以平衡菌体内还原力。通过自杀性载体系统介导的同源重组技术，将 甘油脱水酶及其激活因子的合成基因整合到大肠杆菌基因组中，能够有效地降低质粒的丢 失率，保持质粒稳定性。为了确定共表达dhaT的同源重组突变株对P3HP产量有促进作用， 以甘油为唯一碳源进行发酵，实验结果表明，含有PWQ02和pWQ04的E. coliBL21 (B)发酵后 P3HP为0. 2g/L，占细胞干重的6. 5% ;共表达dhaT基因的同源重组突变株发酵后P3HP为 0.8g/L，占细胞干重的14.6%，P3HP产量为前者4倍。
[0023] 本发明的有益效果是：以甘油为底物生物合成P3HP的代谢途径中，NAD+作为辅酶 在催化3-羟基丙醛生产3HP的同时会产生大量的NADH。NADH的升高所造成的重组菌体内 氧化还原平衡失调是限制P3HP产量进一步提高，本发明所述重组大肠杆菌菌株代谢甘油 生成1，3-PD0的过程会消耗NADH，因此在P3HP的合成途径中引入1，3-PD0的合成，可以平 衡菌体内还原力。通过自杀性载体系统介导的同源重组技术，将甘油脱水酶及其激活因子 的合成基因整合到大肠杆菌基因组中，能够有效的降低质粒的丢失率，保持质粒稳定性。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为重组大肠杆菌以甘油为底物合成聚3-羟基丙酸的代谢途径反应方程式。
【具体实施方式】
[0025] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对 本发明的【具体实施方式】作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
[0026] 实施例1
[0027] 一种重组大肠杆菌菌株，在大肠杆菌基因组上整合甘油脱水酶及其激活因子的合 成基因，以及dhaT基因，重组后的大肠杆菌菌株具有生物合成聚3-羟基丙酸与1，3-丙二 醇的能力。
[0028] 所述dhaT基因是以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为模板，用引物ZG-440和ZG-441 克隆得到的。
[0029] 一种利用所述重组大肠杆菌菌株的构建方法，步骤如下：
[0030] 步骤1 :质粒pET21 (A)的构建：以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为模板，用引物 ZG-440和ZG-441克隆dhaT基因，dhaT片段与质粒pWQ02经HindIII、XhoI酶切后连接；
[0031] 步骤2:质粒pRE112(B)的构建：以E. coliBL21的基因组为模板，分别利用引物 ZG-268和ZG-269、引物ZG-270和ZG-271扩增出片段prpR基因两侧同源片段，再以两个扩 增片段为模板，利用引物ZG-268和ZG-271扩增出片段prpR ;限制性内切酶Sac I和Nhe I酶 切PrpR后，将其连接到经过限制性内切酶SacI和XbaI酶切后的质粒pRE112,构建成重组 质粒pRE112 (A);再利用限制性内切酶XhoI和XbaI酶切重组质粒pRE112 (A)和pWQ04,切 胶回收质粒pRE112(A)和dhaB-gdrAB片段，进行酶连后，构建完成重组质粒pRE112(B);
[0032] 步骤3 :第一次重组：以E. coli/pRE112 (B)为质粒供体菌，以待突变菌种 E. coliBL21 (DE3)作质粒受体菌；将供体菌和受体菌进行活化后，各取I. 5mL，离心后用无 菌水重悬洗2次，以除去抗生素，再用500 μ L的无菌水重悬菌体沉淀后各取100 μ L并混 匀，离心后用50 μ L的1 % DAP重悬菌体，涂布于无抗性平板，于37°C培养12h ;收集平板上 的菌体重悬到无菌水中；将重悬菌液稀释KT1-KT4倍，各倍数均取30 μ L涂布于氯霉素平 板上，于37°C培养24h ;PCR验证单克隆菌落，标记阳性菌；
[0033] 步骤4 :第二次重组：将标记的一次重组阳性单克隆接入无抗性LB试管，于37°C 培养15h ;将菌液稀释KT1-KT6倍，各倍数均取20 μ L涂布于10 %蔗糖平板上，37°C培养 12h ;挑选蔗糖板上的单克隆菌落，分别划到氯霉素平板和10%蔗糖平板，37°C培养IOh ;选 取蔗糖平板上生长而氯霉素平板未生长的菌做PCR验证，标记阳性菌；划蔗糖平板分离单 克隆2次，确保二次重组菌纯净；最终将PCR验证正确、并在氯霉素 LB试管中检测不生长的 菌，于-80°C保存。
[0034] 一种利用所述重组大肠杆菌菌株合成聚3-羟基丙酸的方法，其特征在于，步骤如 下：
[0035] 步骤1 :将所述重组大肠杆菌菌株在LB培养基中活化；
[0036] 步骤2 :活化后，转入1/5装液量的500mL带挡板的三角摇瓶中进行培养基发酵， 接种量1 %，同时加入l〇〇mg/L氨苄青霉素钠和34mg/L氯霉素，37°C、200r/min培养，0D600 达到 0· 6_1· O 时加入 IPTG (Isopropyl β -D-l-Thiogalactopyranoside)，以及 0· 03g/L维生 素 B12并将培养温度调整到30°C ;培养72h ;
[0037] 步骤3 :72h后，离心收集菌体，用无菌水和95%的乙醇清洗菌体沉淀；冷冻干燥至 恒重得到细胞干重；
[0038] 步骤4 :在室温条件下，向冷干菌体中加入10倍菌体量的丙酮溶剂混合洗涤一次， 蒸发干燥后，将干菌体包好置于索氏提取器中，加入10倍菌体量的氯仿，90°C萃取4h，萃取 完毕后静置冷却，过滤，吸取上清液得澄清聚3-羟基丙酸溶液；
[0039] 步骤5:使用旋转蒸发仪在45°C将氯仿蒸出，蒸馏烧瓶底部的析出物即为提取纯 化得到的3-羟基丙酸聚合物，60°C干燥12h，完全除尽残留氯仿，获得3-羟基丙酸。
[0040] 步骤1所述LB培养基组成为：胰蛋白胨10. 0g/L，酵母浸膏5. 0g/L，NaCl 10. Og/ L，pH7. 0。步骤2所述进行发酵的培养基组成为：甘油20g/L，（NH4)2SO4 3g/L，葡萄糖3g/L， KH2PO4 I. 5g/L，KCl I. 9g/L，柠檬酸 lg/L，柠檬酸钠 lg/L，FeSO4 · 7H20 0· 138g/L，微量元素 lmL/L，维生素 BI (λ 045g/L，pH7. 0。所述微量元素组成为：(NH4)6Mo7O24 ·4Η20(λ 37g/L，H3BO4 2. 47g/L，MnCl2 · 4H20 I. 58g/L，ZnSO4 · 7H20 0· 29g/L，CuSO4 · 5H20 0· 25g/L。
[0041] 本发明所述的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴 本发明的内容适当改变各组分配比等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离 本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为 包括在本发明的范围之内。
【权利要求】
1. 一种重组大肠杆菌菌株，其特征在于，在大肠杆菌基因组上整合甘油脱水酶及其激 活因子的合成基因，以及dhaT基因，重组后的大肠杆菌菌株具有生物合成聚3-羟基丙酸与 1，3-丙二醇的能力。
2. 根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述dhaT基因是以肺 炎克雷伯氏菌基因组DNA为模板，用引物ZG-440和ZG-441克隆得到的。
3. -种权利要求1所述重组大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，步骤如下： 步骤1 :质粒pET21(A)的构建：以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为模板，用引物ZG-440 和ZG-441克隆dhaT基因，dhaT片段与质粒pWQ02经Hindlll、Xhol酶切后连接； 步骤2 :质粒pRE112(B)的构建：以E. coliBL21的基因组为模板，分别利用引物ZG-268 和ZG-269、引物ZG-270和ZG-271扩增出片段prpR基因两侧同源片段，再以两个扩增片 段为模板，利用引物ZG-268和ZG-271扩增出片段prpR ;限制性内切酶SacI和Nhel酶切 prpR后，将其连接到经过限制性内切酶SacI和Xbal酶切后的质粒pRE112,构建成重组质 粒pRE112 (A);再利用限制性内切酶Xhol和Xbal酶切重组质粒pRE112 (A)和pWQ04,切胶 回收质粒pRE112(A)和dhaB-gdrAB片段，进行酶连后，构建完成重组质粒pRE112(B); 步骤3 :第一次重组：以E. coli/pRE112 (B)为质粒供体菌，以待突变菌种 E. coliBL21 (DE3)作质粒受体菌；将供体菌和受体菌进行活化后，各取1. 5mL，离心后用无 菌水重悬洗2次，以除去抗生素，再用500 yL的无菌水重悬菌体沉淀后各取100 yL并混 匀，离心后用50 y L的1 % DAP重悬菌体，涂布于无抗性平板，于37°C培养12h ;收集平板上 的菌体重悬到无菌水中；将重悬菌液稀释K^-KT4倍，各倍数均取30 y L涂布于氯霉素平 板上，于37°C培养24h ;PCR验证单克隆菌落，标记阳性菌； 步骤4 :第二次重组：将标记的一次重组阳性单克隆接入无抗性LB试管，于37°C培养 1511;将菌液稀释1〇-1-1〇-6倍，各倍数均取2〇1^涂布于10%蔗糖平板上，371：培养1211; 挑选蔗糖板上的单克隆菌落，分别划到氯霉素平板和10%蔗糖平板，37°C培养10h ;选取蔗 糖平板上生长而氯霉素平板未生长的菌做PCR验证，标记阳性菌；划蔗糖平板分离单克隆 2次，确保二次重组菌纯净；最终将PCR验证正确、并在氯霉素 LB试管中检测不生长的菌， 于-80°C保存。
4. 一种权利要求1所述重组大肠杆菌菌株合成聚3-羟基丙酸的方法，其特征在于，步 骤如下： 步骤1 :将所述重组大肠杆菌菌株在LB培养基中活化； 步骤2 :活化后，转入1/5装液量的500mL带挡板的三角摇瓶中进行培养基发酵，接种 量1%，同时加入l〇〇mg/L氨苄青霉素钠和34mg/L氯霉素，37°C、200r/min培养，0D600达 到 0? 6-1. 0 时加入 IPTG (Isopropyl 0 -D-1-Thiogalactopyranoside)，以及 0? 03g/L维生素 B12并将培养温度调整到30°C ;培养72h ; 步骤3 :72h后，离心收集菌体，用无菌水和95%的乙醇清洗菌体沉淀；冷冻干燥至恒重 得到细胞干重； 步骤4 :在室温条件下，向冷干菌体中加入10倍菌体量的丙酮溶剂混合洗涤一次，蒸发 干燥后，将干菌体包好置于索氏提取器中，加入10倍菌体量的氯仿，90°C萃取4h，萃取完毕 后静置冷却，过滤，吸取上清液得澄清聚3-羟基丙酸溶液； 步骤5 :使用旋转蒸发仪在45°C将氯仿蒸出，蒸馏烧瓶底部的析出物即为提取纯化得 到的3-羟基丙酸聚合物，60°C干燥12h，完全除尽残留氯仿，获得3-羟基丙酸。
5. 根据权利要求4所述重组大肠杆菌菌株合成聚3-羟基丙酸的方法，其特征在于，步 骤1所述LB培养基组成为：胰蛋白胨10. Og/L，酵母浸膏5. Og/L，NaCl 10. Og/L，pH 7. 0。
6. 根据权利要求4所述重组大肠杆菌菌株合成聚3-羟基丙酸的方法，其特征在于，步 骤2所述进行发酵的培养基组成为：甘油20g/L，（NH4)2S04 3g/L，葡萄糖3g/L，KH2P04 1.5g/ L，KC1 1. 9g/L，柠檬酸 lg/L，柠檬酸钠 lg/L，FeS04 ? 7H20 0? 138g/L，微量元素 lmL/L，维生 素 B1 0? 045g/L，pH 7. 0。
7. 根据权利要求6所述重组大肠杆菌菌株合成聚3-羟基丙酸的方法，其特征在于， 所述微量元素组成为：(NH4)6M〇7024 ? 4H20 0? 37g/L，H3B042 . 47g/L，MnCl2 ? 4H20 1. 58g/L， ZnS04 ? 7H20 0? 29g/L，CuS04 ? 5H20 0? 25g/L。
【文档编号】C12P7/62GK104480055SQ201410693426
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】李申 申请人:天津申宗科技有限公司