专利名称：采用重组大肠杆菌生产手性β－(R)－羟基丁酸的方法
技术领域：
本发明属于工业微生物，发酵工程技术领域，特别涉及一种采用生物发酵法直接生产β-(R)-羟基丁酸的方法。
β-(R)-羟基丁酸可用化学合成并拆分或降解聚-β-(R)-羟基丁酸(PHB)得到。这两种方法工艺复杂，生产成本较高。
本发明的目的在于为克服已有技术的不足之处提出采用重组大肠杆菌生产手性β-(R)-羟基丁酸的方法，通过构建带有phbA和phbB基因的质粒并用此质粒转化得到重组大肠杆菌，用该大肠杆菌进行发酵得到β-(R)-羟基丁酸。具有生产工艺简化，生产污染低，产品成本低的优点。
本发明提出一种生产β-(R)-羟基丁酸的方法，由构建的带有phbA和phbB基因的质粒并用此质粒转化得到重组大肠杆菌和发酵该重组大肠杆菌生产β-(R)-羟基丁酸组成，其特征在于所说的发酵过程包括(1)将基因phbA和phbB克隆到质粒中构建出新质粒。(2)将构建质粒转到大肠杆菌中。(3)发酵该重组大肠杆菌获取β-(R)-羟基丁酸。
本发明方法所说的质粒构建与传统的质粒构建方法相同，包括将含基因phbA和phbB的DNA片段和所用的质粒进行相关酶切；利用连接酶进行连接；利用常规转化手段进行质粒转化及筛选。筛选出的含连接好的质粒的菌株即为所需发酵用的菌株。
本发明所用的发酵方法为常规的工业发酵方法，均可采用传统微生物发酵的工艺设备。
本发明利用的是基因重组大肠杆菌直接发酵生产β-(R)-羟基丁酸，简化了传统化学合成对设备的复杂要求和工艺流程的繁琐。省去了手性分离的复杂过程，并降低了由于化学合成和手性分离带来的环境损害。并可能实现生产成本降低。
实施例用重组大肠杆菌发酵生产β-(R)-羟基丁酸菌种大肠杆菌E.coli HB101基因来源phbA和phbB来自菌种Ralstonia eutropha的基因组，基因片段连接在质粒pBHR68上。
(1)质粒构建用限制性内切酶Pst I酶切质粒pBHR68得到基因phbB和phbA。并将其插入到质粒pUC18的Pst I酶切位点。所得到的质粒pUCAB含有位于启动子lac下游的基因phbB和phbA。
(2)质粒转化用电转化将质粒转到菌株E.coli HB101中。筛选出的含连接好的质粒的菌株即为所需发酵用的重组大肠杆菌菌株。
(3)发酵培养利用所得的基因重组菌发酵培养36-48小时后离心(4000g)得上清液，浓缩干燥后以气相色谱检测β-(R)-羟基丁酸，产量为1.2g/l。
培养基为0.5g/L硫酸铵，0.2g/L硫酸镁，9.65g/L十二水磷酸氢二钠，2.65g/L磷酸二氢钾，60mg/L氨卞青霉素，50g/L葡萄糖和1ml/L微量元素。总体积约3L。
微量元素的配制1升1mol/L盐酸中(g)20六水氯化铁，10氯化钙，0.03五水硫酸铜，0.05四水氯化锰，0.1七水硫酸锌，pH 6.8。
权利要求
1.一种采用重组大肠杆菌生产手性β-(R)-羟基丁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将合成聚-β-(R)-羟基丁酸(PHB)的前体基因phbA和phbB克隆到质粒载体中构建出重组质粒；(2)将将含phbA和phbB基因的重组质粒转到大肠杆菌中获得重组大肠杆菌；(3)对该重组大肠杆菌发酵获取β-(R)-羟基丁酸。
全文摘要
本发明属于工业微生物,发酵工程技术领域。包括以下步骤:(1)将合成聚－β－(R)－羟基丁酸(PHB)的前体基因phbA和phbB克隆到质粒载体中构建出重组质粒;(2)将将含phbA和phbB基因的重组质粒转到大肠杆菌中获得重组大肠杆菌;(3)对该重组大肠杆菌发酵获取β－(R)－羟基丁酸。本发明生产工艺简单,容易操作,开创了一种新型生物法生产β－(R)－羟基丁酸的道路。
文档编号C12P7/42GK1357629SQ01118668
公开日2002年7月10日 申请日期2001年6月8日 优先权日2001年6月8日
发明者陈国强, 席建忠, 吴琼, 张广 申请人:清华大学