一种生产乙醇酸基聚合物的重组菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生产己醇酸基聚合物的重组菌及其应 用。
【背景技术】
[000引 己醇酸（glycolic acid, hy化oxyacetic acid)别名居基己酸或α -居基己酸，是 最简单的居基駿酸。作为重要的化工产品和有机合成中间体，己醇酸在化工、医药、纺织、冶 金等多个领域有广泛应用。例如，2%己醇酸和1%甲酸的混合酸是一种高效低成本的清洗 剂，可用于锅炉、管道、冷凝器和热交换器等的清洗；己醇酸分子小，能有效渗透毛孔，解决 皮肤老化、皱纹、暗疮等问题，常用作化妆品添加剂；纺织行业中常用己醇酸作为染整羊毛 纤维及纤维素织品的交联禪合剂；另外，己醇酸还可用作杀菌剂、粘接剂、石油破乳剂、焊接 剂W及化学助剂等。2011年，己醇酸市场为9330万美元，预计未来几年将W每年超过10% 的速度增长，2018年己醇酸市场可能超过2亿美元。
[0003] 己醇酸基聚合物（glycolate based polymers)是一种具有良好生物相容性和生 物可降解性的高分子材料，由己醇酸和其它居基駿酸单体聚合而成。己醇酸基聚合物可W 替代传统的石油来源塑料用作普通包装材料，也可W用于附加值较高的生物医学领域，比 如制备手术缝合线、药物控释载体、骨折固定材料、组织工程支架W及缝合补强材料等。乳 酸和己醇酸的共聚醋（poly lactate-co-glycolate)，简称PLGA或PGLA，是研究较多的己 醇酸基聚合物，常用于制备微囊等控释制剂，作为多种药物、蛋白W及其它大分子的控释载 体。PLGA已由美国食品药品监督管理局（抑A)批准用于医疗器械领域，目前已有多个产品 上市，例如世界卫生组织（WHO)批准的首个一次性注射疫苗微球、全球首个多肤控释微球 注射剂等，日本、法国和我国等也先后批准在医药领域使用PLGA。
[0004] 己醇酸基聚合物在工业上主要通过化学合成的方法制备。例如，W较纯的己交醋 为前体，通过开环聚合可W获得聚己醇酸；W己交醋和丙交醋为前体，通过开环聚合可W获 得己醇酸乳酸共聚醋等。化学聚合过程中往往需要重金属离子作为催化剂，目前广泛使用 的锡盐类催化剂具有细胞毒性，出于人体安全性的考虑，限制了化学法合成的己醇酸基聚 合物在医药和食品等领域的应用。2011年，Matsumoto等利用大肠杆菌脂肪酸氧化的强化 突变株LS5218首次实现了含有己醇酸单体的聚合物的生物合成。送也是目前为止利用微 生物发酵获得己醇酸基聚合物的唯一报道。过表达来源于假单胞菌Pseudomonas SP. 61-3 的PHA聚合酶WiaClSTQK和来源于埃氏巨球型菌Megasphaera elsdenii的辅酶A转移酶 化t，W十二酸和己醇酸为底物，细菌合成的聚合物中含有单体含量为17%的己醇酸组分， 其它居基脂肪酸单体3-居基了酸（3-皿）、3-居基己酸（3-HHx)、3-居基辛酸（3-H0)、3-居 基癸酸（3-皿）和3-居基十二酸（3-HDD)的含量分别为19%、22%、26%、8%和8%。由于 大肠杆菌对脂肪酸和己醇酸利用效果较差，导致细胞干重仅为0. 64g/l，聚合物含量也处于 较低水平，仅占细胞干重的4. 8%。由于生物量和聚合物含量都较低，导致聚合物的提取非 常困难，也无法对其材料学性能进行研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种重组菌。
[0006] 本发明所提供的重组菌是将聚居基脂肪酸醋颗粒结合蛋白基因地aP、P皿生物合 成操纵子地bCAB、辅酶A转移酶基因 pet、异巧樣酸裂解酶基因 aceA、异巧樣酸脱氨酶激酶 基因 aceK和己醒酸还原酶基因曲rA导入宿主大肠杆菌得到的。
[0007] 上述重组菌中，所述大肠杆菌为E. coli JM109或E. coli JM1091化A。
[0008] 上述重组菌中，所述E. coli JM1091化A是E. coli JM109缺失1化A基因后的菌。
[0009] 上述重组菌中，所述大肠杆菌E. coli JM1091化A的构建方法包括如下步骤：
[0010] (1)制备如沈Q ID No. 3所示的DNA片段；
[0011] (2)将质粒地D46 转化至 E. coli JM109 中，得到 E. coli JM109(p邸46);
[0012] (3)诱导所述E. coli JM109(p邸46)菌株中的Red重组系统表达，再将所述DM片 段转入所述E.coli JM109(pKD46)菌株中，经过重组，得到1化A基因被Kan基因替换的重 组菌，记作 E. coli JM1091 化A-K(p邸46);
[0013] (4)去除所述E. coli JM1091化A-K(p邸46)菌株中的质粒地D46,得到的重组菌记 作 E. coli JM1091 化A-K;
[0014] 妨将质粒PCP20转化至E. coli JM1091dM-K菌株中，去除Kan基因，得到的重组 菌记作 E. coli JM1091 化A。
[0015] 上述重组菌中，所述将聚居基脂肪酸醋颗粒结合蛋白基因地aP、P皿生物合成操 纵子地bCAB、辅酶A转移酶基因 pet、异巧樣酸裂解酶基因 aceA、异巧樣酸脱氨酶激酶基因 aceK和己醒酸还原酶基因曲rA导入宿主大肠杆菌的方法具体是将表达盒1和表达盒2导 入宿主大肠杆菌。
[0016] 上述重组菌中，所述表达盒1是启动子序列、聚居基脂肪酸醋颗粒结合蛋白基因 地aP和P皿生物合成操纵子地bCAB依次连接得到的；
[0017] 所述表达盒2是启动子序列、辅酶A转移酶基因 pet、己醒酸还原酶基因曲rA、异 巧樣酸裂解酶基因 aceA和异巧樣酸脱氨酶激酶基因 aceK依次连接得到的。
[0018] 上述重组菌中，所述表达盒是通过表达载体导入宿主菌的，所述表达盒1通过重 组表达载体P19-PCAB导入宿主菌，所述重组表达载体P19-PCAB是将所述表达盒1连入 PMD19-T的Pst I和EcoR I的酶切位点得到；所述表达盒2通过重组表达载体pMCS-pctAAK 导入宿主菌，所述重组表达载体pMCS-pctAAK是将所述表达盒2连入地BR1MCS-2的EcoR I 和化0 I的酶切位点得到。
[0019] 上述重组菌中，所述表达盒1的序列如SEQ ID No. 1所示；所述表达盒2的序列如 沈Q ID No. 2所示；
[0020] 所述聚居基脂肪酸醋颗粒结合蛋白基因地aP的序列如SEQ ID No. 1中第72-650 位核巧酸分子所示；
[0021] 所述P皿生物合成操纵子地bCAB的序列如SEQ ID No. 1中第682-4395位核巧酸 分子所示；
[0022] 所述辅酶A转移酶基因 pet的序列如SEQ ID No. 2中第72-1625位核巧酸分子所 示；
[0023] 所述己醒酸还原酶基因曲rA的序列如SEQ ID No. 2中第1655-2593位核巧酸分 子所示；
[0024] 所述异巧樣酸裂解酶基因 aceA的序列如SEQ ID No. 2中第2623-3927位核巧酸 分子所示；
[00巧]所述异巧樣酸脱氨酶激酶基因 aceK的序列如SEQ ID No. 2中第4110-5826位核 巧酸分子所示；
[0026] 所述启动子序列如SEQ ID No. 1中第13-55位核巧酸分子所示或SEQ ID No. 2中 第13-55位核巧酸分子所示；
[0027] 所述1化A基因的序列如沈Q ID No. 4所示。
[0028] 上述所述的重组菌在生产己醇酸基聚合物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0029] 本发明另一个目的是提供一种生产己醇酸基聚合物的方法。
[0030] 本发明提供的生产己醇酸基聚合物的方法包括如下步骤；W大肠杆菌可W利用的 单糖为底物，发酵培养上述所述的重组菌，得到己醇酸基聚合物。
[0031] 上述方法中，当所述出发菌为E.coli JM109时，所述的己醇酸基聚合物是由己醇 酸、乳酸和3-居基了酸聚合得到的共聚物；当所述出发菌为E. coli JM1091dM时，所述的 己醇酸基聚合物是由己醇酸和3-居基了酸聚合得到的共聚物。
[0032] 上述方法中，所述大肠杆菌可W利用的单糖具体为葡萄糖和/或甘露醇。
[0033] 上述方法中，所述发酵培养使用的培养基是MSG-Amp-Kan液体培养基和/或 LBG-Amp-Kan液体培养基和/或MSM-Amp-Kan液体培养基和/或LBM-Amp-Kan液体培养基。
[0034] 上述方法中，所述MSG