一株韩国假单胞菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株韩国假单胞菌及其应用，可用于克服或缓解连作太子参土传病害问题，属于微生物和生物防治技术领域。
【背景技术】
[0002]太子参(Pseudostellaria heterophylla)别名童参、孩儿参、米参，为石竹科多年生草本植物，以根部入药，具有益气健脾，生津润肺等功效，其用药历史悠久、临床疗效确切，目前已被卫生部确定列入“可用于保健食品的中药材名单”。太子参主产于福建、贵州、安徽等地，其中以福建省柘荣县栽培历史最为悠久，品质最优，素有“中国太子参之乡”美誉。太子参在栽培种植过程中存在严重的连作障碍问题，连作太子参植株生长不良，地下部不能正常膨大(如图1所示)，收获后须隔2?4年后方可再种。连作障碍问题还导致一系列的下游不良问题，如太子参道地产区和规模正逐年缩小，甚至出现产区外移，道地性失真等现象。因此，连作障碍问题研究是当前药用植物资源生态学亟待解决的重要内容，成为国内外同行研究的热点。课题组前期研究发现，尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌(如图2所示)是导致太子参连作障碍的两类重要病原菌，其含量均随太子参连作年限增加而不断增加。而利用拮抗菌进行植物病害的生物防治被认为是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。本发明针对太子参专化型尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌，分离筛选到一株高效拮抗这两类病原真菌的拮抗细菌，经鉴定为韩国假单胞菌，命名为Pseudomonas koreensis CJ-361。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一株韩国假单胞菌及其应用，用于生物防治太子参连续种植过程中常见的根腐病问题，为克服或缓解太子参连作障碍问题提供生防菌株。
[0004]本发明的技术方案如下:
本发明所提供的措抗细菌为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361，该菌株已于2016年I月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为= CGMCC N0.12122。
[0005]本发明所述的韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis CJ-361)对太子参专化型病原菌一尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌均具有很强的拮抗作用。
[0006]所述韩国假单胞菌的生长培养基为1/4LB培养基+1/20不含铁盐MS培养基+0.1wt.%红糖。
[0007]所述的不含铁盐MS培养基其配方为:I)大量元素:1900 mg/L KN03、1650 mg/LΝΗ4Ν03、370 mg/L MgSO4.7出0、170 mg/L ΚΗ2Ρ04、440 mg/L CaCl2.2^0; 2)微量元素:22.3mg/L MnSCU.4Η2〇、8.6 mg/L ZnSCU.7出0、6.2 mg/L H3BO3 n 0.83 mg/L ΚΙ、0.25 mg/LNa2MoO4-7H20^0.025 mg/L CuSO4-5H20^0.025 mg/L CoCl、2.6 mg/L H2O; 3)有机物:2.0mg/L甘氨酸、0.5 mg/L盐酸卩比卩多醇、0.1 mg/L盐酸硫钱素、0.5 mg/L烟酸、100 mg/L肌酸;所述的LB培养基为:胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L。
[0008]本发明所述的有益拮抗菌具有以下几个优点:
(I)本发明所述的措抗菌一韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361是通过大量的筛选工作筛选到的，是从1600株土壤细菌中筛选得到的，对太子参专化型尖孢镰刀菌以及串珠镰刀菌均具有很强的拮抗效果(如图3所示)。
[0009](2)本发明所述的措抗菌一韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361具有较强的纤维素降解能力和解磷能力(如图4所示)。
[0010](3)本发明所述的措抗菌一韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361来源于连作太子参根际土壤中，并非源自其他生境，根际定殖效果较好并且安全可靠，对太子参及后茬其他作物(如水稻、大豆、玉米、蔬菜等太子参道地产区常种作物)均无致病侵染能力。
[0011 ] (4)本发明所述的措抗菌一韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361的培养温度范围优选为4°C?45°C，pH范围为5?9.5，适合生长的温度和pH范围较广，适应性强。
【附图说明】
[0012]图1为正茬、重茬太子参地下部块根生长情况。
[0013]图2为太子参植株病害根部分离到的病原菌(尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌)的菌落形态.A，B:分别表示尖孢镰刀菌菌落正面和反面;C，D:分别表示串珠镰刀菌菌落的正面和反面。
[0014]图3为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361与病原真菌的对峙培养照片.左侧平板为对照组(仅接种病原菌)，右侧平板中心接种各类病原真菌，其中A:尖孢镰刀菌(来源太子参);B:串珠镰刀菌(来源太子参)。
[0015]图4为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361的纤维素降解能力(A)和解磷能力(B)评价。A:CK表示阴性对照，为荧光假单胞菌，不具有纤维素降解能力。
[0016]图5为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361最适培养基优化。
[0017]图6为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361防控尖孢镰刀菌侵染太子参组培苗.Fox:仅接尖孢镰刀菌;361-Fox:同时接拮抗菌CJ-361和尖孢镰刀菌;Gm:仅接串珠镰刀菌;361-Gm:同时接措抗菌CJ-361和串珠镰刀菌。
【具体实施方式】
[0018]以下结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的描述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
[0019]实施例1措抗菌韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361的筛选及其鉴定 1、措抗菌韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361的筛选
本发明所述的措抗菌韩国假单胞菌(Pseudomonas koreensis)CJ_361从连作太子参根际土壤中筛选得到。
[0020]1.1假单胞菌培养基配制
假单胞菌选择性培养基(pseudomonas selective isolat1n agar，PSIA)配制方法如下:称取20 g大豆-酪蛋白消化物琼脂培养基(soybean casein digest agar,SCD)(BD,USA)，加495.5 mL双蒸水加热搅拌，充分溶解后，再加入I mL 0.l%(wt/Vol)结晶紫储备液，121°C高温高压灭菌15 min，冷却至大约50°C时，往培养基中再添加3.5 mL 5%(wt/vol)呋喃咀啶储备液，充分混匀后，迅速倒板，冷却凝固后即制得假单胞菌选择性培养基平板。
[0021]其中，0.l%(wt/vol)结晶紫储备液的配制方法为:称取0.1 g结晶紫(Sangon，上海)，溶于100 mL双蒸水中，室温保存备用；呋喃咀啶储备液的配制方法为:称取5 g呋喃妥因(Sangon，上海)，加入到90 mL N,N-二甲基甲酰胺(Sangon，上海)中充分溶解，再定容至100 mL，室温避光保存备用。
[0022]1.2假单胞菌培养
称取10 g太子参根际土壤，溶于90 mL无菌水中，充分振荡摇匀，得10—1稀释液。取10mL 10—1稀释度的土壤悬浮液至另一瓶90 mL冷却的无菌水中，充分振荡摇匀，得10—2稀释液。依次稀释得10—3稀释液，吸取60 yL的土壤稀释液，涂布到假单胞菌培养基上后置于30°C恒温培养箱中避光培养30 h。挑选培养基上清晰可辨且生长均匀的单菌落，转接至新的假单胞菌培养基30 0C继续培养30 h左右，置于40C冰箱中短暂保存备用。
[0023]1.3拮抗菌筛选
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)，配制如下:马铃薯200 g，用打浆机打成土豆泥后，加适量水煮沸后计时25 min，待其冷却至不烫手后过四层纱布过滤。将滤液收集好后加入葡萄糖30 g、琼脂15 g，加热搅拌混匀并加水定容至1000 mL后分装。115°C高压灭菌15min后保存备用。
[0024]使用时，将已高温高压灭菌过的培养基重新加热溶解，待培养基温度降到55°C左右(不烫手)时快速倒平板。待培养皿充分凝固后在其底部画十字架，在距离圆心约2.5 cm处接种经活化培养的细菌，置于28°C恒温培养箱中避光培养48 h后，在培养皿的中心位置接种太子参专化型串珠镰刀菌，置于28 °C恒温培养箱中避光对峙培养数天，实时观察抑菌圈的有无及大小。对峙培养4天后，通过观察抑菌圈大小筛选出一株对太子参专化型串珠镰刀菌和尖孢镰刀菌具有强拮抗效应的细菌(如图3所示)，对该菌株进行了保藏，保藏编号为CGMCC N0.12122。将筛选到的强拮抗菌株进行纯化培养，并斜面保存备用。
[0025]2、拮抗菌的鉴定
2.1本发明所述的拮抗菌(保藏编号为= CGMCC N0.12122)经显微观察可以看到该菌为短棒状，革兰氏阴性菌。在LB固体培养基上为隆起、波状、湿润的菌落。同时，该拮抗菌的生理生化特性为:能分解蔗糖、果糖、甘露醇、丙三醇