一种重组酵母菌株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组酵母菌株及其构建方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 在世界范围内，随着经济水平和对健康需求的提高，食品的安全性、营养性和功能 性受到越来越多的关注，因此功能性营养化学品已成为发展趋势，代表当代食品发展的新 潮流，具有广阔的市场前景。番茄红素是一种脂溶性天然食用色素，在化学结构上属于类胡 萝卜素，具备极强的抗氧化能力，是近年来国际上功能食品成分研究的热点。
[0003] 番茄红素的制备主要依赖植物提取、化学合成和微生物合成，前两种方法各有其 自身的不足，微生物合成则以低成本、高产量和产品安全性，被认为是最有前途的方法。目 前，在微生物合成番茄红素的研究中，所采用的宿主菌主要集中于大肠杆菌与酿酒酵母。 2011年，Yeong-SuKim等人在大肠杆菌中引入成团泛菌来源的合成番前红素三个基因 crtE、crtB和crtl，同时上调内源MEP途径中的关键基因并在胞内搭建异源MVA路径，最终 通过分批补料发酵优化实现1.35g/L(32mg/gDCW)的番茄红素产量。2014年，天津工业生 物技术研究所马延和课题组通过优化大肠杆菌胞内NADPH和ATP的供给，并利用核糖体结 合位点文库筛选获得一株高产番茄红素的重组大肠杆菌，其在分批补料发酵罐上的产量为 3. 52g/L (50. 6mg/g DCW)，属目前公开报道的重组菌株中最高产量。
[0004] 酿酒酵母作为公认的安全模式微生物，相比大肠杆菌，它的菌体维生素、蛋白质含 量高，可作食用、药用和饲料酵母；相比三孢布拉氏霉菌，它的生长周期更短且更易培养。 因此，实现番茄红素在酿酒酵母中的高产将会在类胡萝卜素产业化上展现极大的竞争力。 2014年Bahieldin等人报道的在酿酒酵母中通过ADH2启动子表达经密码子优化的噬夏孢 欧文氏菌来源的crtE、crtB和crtl的番茄红素产量仅3. 3mg/gDCW。2015年，浙江大学于 洪巍课题组通过蛋白定向进化手段改造红发夫酵母来源的双功能酶crtYB，使其失去番茄 红素环化酶的编码功能，而仅保留其编码八氢番茄红素合成酶的功能；同时，对红发夫酵母 来源的crtE进行定向进化，提高酶的催化性能；再次，通过调整crtE、crtB和crtl的拷贝 数，获得一株高产番茄红素的二倍体重组酿酒酵母，其摇瓶产量达到159. 56mg/L(23. 23mg/ gDCW)，最后通过分批补料发酵优化，番茄红素的产量达到I. 61g/L(24. 41mg/gDCW)，属目 前公开报道的利用重组酿酒酵母合成番茄红素的最高产量。然而，这与此前报道的利用重 组大肠杆菌合成番茄红素的最高产量（50. 6mg/g DCW)相比仍有较大的差距。因此，开发以 酿酒酵母为宿主菌株实现番茄红素的高产依然存在很大的潜力与空间。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组酵母菌株，使得所述重组菌株能够应 用于番茄红素的生物合成中，并保持较高产量，同时提供所述重组菌株的构建方法和应用。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] -种重组酵母菌株，所述酵母基因组敲除gall、gal7、gallO和ypl062w基因或者 gal80和ypl062w基因，且包含经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片段：
[0008] 酵母trpl位点上游同源序列、CYCl终止子、BtcrtI、GAL10启动子、GALl启动子、 PacrtB、PGKl终止子、酵母trpl位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段1 (模式图见 图1);
[0009] 酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACTl终止子、截短的 HMG-CoA还原酶基因tHMGRl、GALlO启动子、GALl启动子、发光古生球菌来源或三孢布拉氏 霉菌来源或曼地亚红豆杉来源的crtE、GPMl终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼接 而成的基因片段2 (模式图见图2)。
[0010] 本发明通过利用特定的酵母内源基因以及外源基因进行基因元件、基因模块的构 建，并转入到敲除gall、gal7、gallO和ypl062w基因或敲除gal80和ypl062w基因的酵母 基因组上，实现重组菌株番茄红素的合成产量提高。
[0011] 其中，所涉及的酵母内源基因包括截短的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶 A(HMG-CoA)还原酶基因tHMGRl，可通过酵母基因组为模板，通过PCR扩增获得；
[0012] 同时，本发明还涉及采用酵母中的氨基酸标记、启动子和终止子，包括CYCl终止 子、GALlO启动子、GALl启动子、PGKl终止子、ACTl终止子、GPMl终止子、LEU2标记、TDH2 终止子、FBAl终止子、EN02终止子、HIS3标记，上述基因元件的获得也可以酵母基因组为模 板，通过PCR扩增获得；
[0013] 在本发明中，上述各基因元件以及相关的上下游同源序列以酿酒酵母菌株BY4741 的基因组为模板，设计并合成合适的引物，通过PCR扩增得到；而LEU2上游同源序列及 LEU2标记是一并从质粒pRS405上PCR扩增下来，HIS3上游同源序列及HIS3标记是一并从 质粒PRS313上PCR扩增下来。
[0014] 本发明所涉及的外源基因包括香叶基焦磷酸（GGPP)合酶基因crtE、八氢番 茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtl。其中CrtE的来源包括成 团泛菌（Pantoeaagglomerans)、三抱布拉氏霉菌（Blakesleatrispora)、曼地亚红豆 杉（TaxusXmedia)、嗜酸热硫化叶菌（Sulfolobusacidocaldarius)以及发光古生球 菌（Archaeoglobusfulgidus)，依次简写为PacrtE、BtcrtE、TmcrtE、SacrtE、Af crtE;crtB的来源包括成团泛菌（Pantoeaagglomerans)和水生副球菌（Agrobacterium aurantiacum)，依次简写为PacrtB、AacrtB;crtl的来源包括成团泛菌（Pantoea agglomerans)、水生副球菌（Agrobacteriumaurantiacum)和三抱布拉氏霉菌（Blakeslea trispora)，依次简写为PacrtI、AacrtI、Btcrtl。上述基因均为经过密码子优化并适当 规避常用限制性酶切位点后通过人工合成得到。
[0015] 作为优选，所述菌株还包括经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片 段：
[0016] 基因片段2中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-KlURA3-DR营养标签、CYCl终 止子、BtcrtI、GAL3启动子、基因片段2中ACTl终止子及其下游同源序列顺次拼接而成的 基因片段3 (模式图见图3)。进一步优选地，所述基因片段3如SEQIDNO: 5所示。
[0017] 更优选地，所述菌株还包括经酵母自身同源重组整合到其基因组上的如下基因片 段：
[0018] 酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、EN02终止子、ACTl终止子、截短的 HMG-CoA还原酶基因tHMGRl、GALlO启动子、GALl启动子、融合基因BTS1-ERG20、FBAl终止 子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接而成的基因片段4 (模式图见图4)。进一步优选 地，所述基因片段4如SEQIDNO:6所示。
[0019] 最优选地，所述重组酵母菌株以酿酒酵母CEN.PK2-1D为出发菌株，包含曼地亚红 豆杉来源的crtE，敲除galI、gal7、gal10和ypl062w基因，保藏编号为CGMCCNo. 10754,在 本发明中记为SyBE_Sc0014D019。并列地，所述重组酵母菌株以酿酒酵母CEN.PK2-1C为出 发菌株，包含曼地亚红豆杉来源的crtE，敲除gal80和ypl062w基因。
[0020] 作为优选地，所述基因片段1如SEQIDNO: 1所示、基因片段2如SEQIDNO:2-4 任意一项所示；
[0021] 其中，包含发光古生球菌来源crtE基因的基因片段2如SEQIDNO:2所示；包含 三孢布拉氏霉菌来源crtE基因的基因片段2如SEQIDN0:3所示；包含曼地亚红豆杉来源 crtE基因的基因片段2如SEQIDNO:4所示。
[0022] 作为优选，所述酵母为酿酒酵母、解脂属酵母或克鲁维属酵母。除此之外，也可以 以藻类、霉菌（如链霉菌等）和细菌（如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等）为改造菌株将本发明 所限定的基因元件和模块根据这些菌株的已被解析的类胡萝卜素生物合成路径来重组。
[0023] 更优选地，所述酿酒酵母为CEN.PK系列酿酒酵母或BY系列酿酒酵母。进一步优 选地，所述CEN.PK系列酿酒酵母为酿酒酵母CEN.PK2-1C或酿酒酵母CEN.PK2-1D。
[0024] 本发明所述重组酵母菌株能够大量的合成番茄红素，因此本发明还提供了所述重 组酵母菌株在生产番茄红素中的应用以及在生产以番茄红素为中间产物的产品中的应用。
[0025] 此外，本发明还提供了所述重组酵母菌株的构建方法，包括：
[0026] 步骤1、构建由酵母gal7基因下游同源序列、DR-KlURA3-DR营养标签、gall基因 下游同源序列顺次连接的敲除盒片段1或由酵母gal80基因上游同源序列、DR-KlURA3-DR 营养标签、gal80基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段2,以及由ypl062w基因上游同 源序列、kanMX抗性标签、ypl062w基因下游同源序列顺次连接的敲除盒片段3,利用敲除盒 片段1和3或者利用敲除盒片段2和3通过酵母自身同源重组敲除酵母gall、gal7、gal10 和ypl062w基因或敲除酵母gal80和ypl062w基因，获得基因敲除酵母，备用；
[0027] 将酵母trpl位点上游同源序列、CYCl终止子、Btcrtl、GAL10启动子、GALl启动 子、PacrtB、PGKl终止子、酵母trpl位点下游同源序列顺次拼接，获得基因片段1，即trpl 位点上游同源序列-la^-crtl-Pa^-PGAu-crtB-Tpaa-trpl位点下游同源序列，备用；
[0028] 将酵母leu2位点上游同源序列、LEU2标记、TDH2终止子、ACTl终止子、截短的 HMG-CoA还原酶基因tHMGRl、GAL10启动子、GALl启动子、发光古生球菌来源或三孢布拉氏 霉菌来源或曼地亚红豆杉来源的crtE、GPMl终止子、酵母leu2位点下游同源序列顺次拼 接，获得基因片段2,即leu2位点上游同源序列-LEU2-TTDH2-TACT1-tHMGRl-PGAUQ-PGAU-CrtE-T (；PM1-leu2位点下游同源序列，备用；
[0029] 步骤2、将基因片段1通过醋酸锂法转入所述基因敲除酵母中，通过基因片段1中 trpl位点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上trpl位点发生重组而整合到基因组 上；
[0030] 将基因片段2通过醋酸锂法转入所述基因敲除酵母中，通过基因片段2中leu2位 点上、下游同源序列与基因敲除酵母基因组上leu2位点发生重组而整合到基因组上，获得 重组酵母菌株。
[0031] 作为优选，所述构建方法还包括：
[0032] 构建基因片段3,并在转入基因片段1和2后，将基因片段3转入基因敲除酵母中 获得重组酵母菌株；
[0033] 具体为，将基因片段2中TDH2终止子及其上游同源序列、DR-KlURA3-DR营养 标签、CYCl终止子、Btcrtl、GAL3启动子、基因片段2中ACTl终止子及其下游同源序列 顺次拼接，获得基因片段3,即TDH2终止子及其上游同源序列-DR-KlURA3-DR-TCTa-Bt Crtl-PGAL3-TACT1-ACT1终止子及其下游同源序列，备用；
[0034] 将基因片段3继续通过醋酸锂法转化到已转入基因片段2的基因敲除酵母中，通 过基因片段3中TDH2终止子及其上游同源序列、ACTl终止子及其下游同源序列，与已整合 的基因片段2上的TDH2终止子和ACTl终止子位点发生重组而插入到已整合基因片段2的 基因敲除酵母基因组上。
[0035] 进一步优选地，所述构建方法还包括：
[0036] 构建基因片段4,并在转入基因片段1、2和3后，将基因片段4转入基因敲除酵母 中获得重组酵母菌株；
[0037] 具体为，将酵母内源FPP合酶基因ERG20和GGPP合酶基因BTSl进行连接，获 得融合基因BTS1-ERG20,然后将酵母his3位点上游同源序列、HIS3标记、EN02终止子、 ACTl终止子、截短的HMG-CoA还原酶基因tHMGRl、GALlO启动子、GALl启动子、融合基因 BTS1-ERG20、FBA1终止子、酵母his3位点下游同源序列顺次拼接，获