多形汉逊酵母重组菌株及其在龙胆苦苷生物合成中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种多形汉逊酵母重组菌株及其在龙胆苦苷生物合成中的应用，主要是运用低能离子注入介导秦艽基因组总DNA转化酵母菌的方法获得一株产龙胆苦苷的重组酵母菌，其为多形汉逊酵母(Hansenula?polymorpha)CGMCC.No.8998，本发明实现了利用重组酵母菌进行生物发酵生产龙胆苦苷的技术突破，为解决龙胆苦苷来源短缺、保护我国龙胆科植物资源及其可持续发展提供新途径。
【专利说明】多形汉逊酵母重组菌株及其在龙胆苦苷生物合成中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于通过遗传转化获得产龙胆苦苷的转基因酵母重组菌领域，具体涉及利用离子注入介导秦艽总DNA在酵母菌中遗传转化获得的多形汉逊酵母重组菌株及其在龙胆苦苷生物合成中的应用。
【背景技术】
[0002]龙胆苦苷(Gentiopicroside)，别名龙胆苦甙，分子式为C16H2tlO9,分子量为356.11,为裂环环烯職苷类化合物，属于倍半職类物质，是药用植物秦究(Gentianamacrophylla)的主要药用成分。近年来的研究表明，龙胆苦苷具有镇痛、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利胆、健胃抗溃疡等作用，如作为国家一类新药注射用秦龙苦素，为秦艽提取物龙胆苦苷的冻干粉针，用于黄疸型病毒性肝炎治疗。
[0003]龙胆苦苷多来源于龙胆科多年生草本植物秦艽。秦艽为龙胆科、龙胆属多年生草本植物，是我国重要的中药材之一。秦艽生长在高海拔地区，生长周期长，易受季节变化影响。近年来因秦艽具有很高的药用价值，过渡采挖使野生秦艽资源出现严重匮乏，加上秦艽人工栽培存活率低的问题，导致龙胆苦苷的供应量难以满足临床需求。因此，迫切需要寻求及扩大龙胆苦苷新药源途 经以满足临床上对其日益增长的需求。
[0004]目前，Tiwari等运用发根农杆菌诱导出秦艽毛状根，但其不能生产龙胆苦苷。此外，齐香君等运用药源植物秦艽细胞生产龙胆苦苷，其龙胆苦苷产量仅为0.242mg/g，而且其发酵周期长。上述研究目前都未能获得理想的结果。在秦艽资源开发研究方面，国外尚未报道。因此，亟需寻求新的研究思路解决龙胆苦苷来源短缺问题。
[0005]近年来，分离天然产物生物合成基因，并借助酵母细胞工厂大量而经济地生物合成植物天然产物成为有效途径之一。然而，植物萜类化合物，如单萜、倍半萜以及双萜等高级萜类不仅拥有特异的合成途径，且具有独特的酶促反应机制。同时，许多已知代谢途径不能作为参考，植物次生代谢网络多且复杂，加上部分关键代谢酶基因处于低表达水平，很难从蛋白分子水平获得表达。
[0006]近年来，在植物天然产物生物合成基因信息及生物合成途径尚未阐明前，LU等通过Ar+和N+注入介导麻黄基因组DNA转化酵母，获得遗传稳定酵母工程菌，麻黄碱和伪麻黄碱产量分别为18.85mg/L和4.llmg/L。Jin等利用低能离子注入介导甘草基因组DNA转化酵母，获得了遗传稳定的酵母工程菌，其五环三萜苷类物质甘草酸的最高产量达114.49mg/Lo同时，由于酵母自身存在甲轻戍酸(MevalonateJflMVA)途径,可自我合成職类物质前体异戊二烯焦磷酸，这为利用微生物合成萜类化合物龙胆苦苷提供了一个很好的基础平台。目前，国外尚未见利用低能离子注入介导药用植物基因组DNA转化酵母技术构建产药用有效成分的重组菌的研究报道。具体在遗传改造酵母生物合成龙胆苦苷的方面，国内外尚未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种多形汉逊酵母重组菌株及其在龙胆苦苷生物合成中的应用。
[0008]为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
[0009]一种多形汉逊酵母重组菌株，该重组菌株的分类命名为多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)，所述重组菌株保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.8998。
[0010]所述重组菌株的筛选方法，包括以下步骤:
[0011]I)运用低能离子注入介导秦艽基因组DNA转化多形汉逊酵母出发菌株；
[0012]2)重组菌株初筛:挑取在YPD固体培养基中培养的经过步骤I)处理后的出发菌株的菌落进行YPD液体发酵，离心取发酵液，采用Molish反应和Fehling试验对重组菌株的发酵液进行分析，初步定性分析发酵液中是否存在龙胆苦苷；
[0013]3)将经过定性方法初筛得到的重组菌株进一步进行YPD液体发酵培养，利用薄层层析和高效液相色谱分析发酵所得发酵液，从而对重组菌株进一步筛选鉴定。
[0014]所述出发菌株为多形汉逊酵母H.polymorpha DL-1 (来源为ATCCN0.26012)。
[0015]所述低能离子注入的条件为:注入离子为N+，注入剂量为1.5 X IO16~ 2.5X1016ions/cm2，注入能量为15~25KeV，脉冲时间为5~IOs,间隔时间为5~10s，真空度为 1.5 ~2.0XlO-3Pa0
[0016]所述重组菌株的发酵方法包括以下步骤:于37°C、转速为300r/min条件下培养60 ~96h0
[0017]所述发酵采用的培养基为YPD液体培养基，发酵过程中流加0.5%的葡萄糖水溶液，流速为12.5mL/h。
[0018]上述多形汉逊酵母重组菌株(CGMCC N0.8998)在龙胆苦苷生物合成中的应用。
[0019]本发明的有益效果体现在:
[0020]本发明通过低能离子注入技术介导秦艽基因组DNA在酵母出发菌株中随机转化，获得一株多形汉逊酵母重组菌株，该重组菌株能够有效地生物合成龙胆苦苷，具有易于高度密度发酵、产物易于分离提取的优点，为龙胆苦苷的工业化生产提供新途径，为解决龙胆苦苷药源短缺问题提供新思路、新方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为发酵产物TLC分析图谱，其中，1:龙胆苦苷标准品，2:重组菌株发酵液样品，3:阴性对照酵母菌株(低能离子注入后用不含秦艽基因组DNA的TE缓冲液温育、洗脱)发酵液样品。
[0022]图2为发酵产物HPLC图谱，其中，A:龙胆苦苷标准品，B:重组菌株发酵液样品，C:阴性对照酵母菌株发酵液样品。
[0023]图3为重组菌株的发酵图谱。
[0024]图4为重组菌株的遗传稳定性图谱。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
[0026]本发明以H.polymorpha DL-1为出发菌株(来源为ATCC N0.26012)，利用低能离子辐照注入介导秦艽基因组DNA随机转化酵母，通过定性、定量筛选获得产龙胆苦苷的重组酵母菌株，并对其进行遗传稳定性和相应的发酵试验。
[0027](一 )培养基
[0028]YPD液体培养基的组成为:葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母膏10.0g/L, pH为 6.5 ;
[0029]Yro固体培养基的组成为:葡萄糖20.(^/1，蛋白胨20.(^/1，酵母膏10.(^/1，琼脂20g/L，pHS6.5。
[0030](二)筛选所依据的方法
[0031](I)环烯醚萜苷类物质检测
[0032]Molish反应:取800mL发酵液，100°C下浓缩发酵液至5mL(即得浓缩发酵液)后，加入IOmL甲醇萃取,过滤萃取液。取滤液3mL,加入两滴Molish试剂(10% α-萘酹乙醇溶液)，小心加入约ImL浓硫酸(18.4mol/L)，切勿摇匀，观察两层液面交界处的颜色变化，出现紫环为阳性。
[0033]Fehling试验:取上述浓缩发酵液3mL加入到3mL Fehling试剂(由甲和乙等体积组成，甲是0.lg/mL的氢氧化钠水溶液，乙是0.05g/mL的硫酸铜水溶液)中。摇匀后,置沸水浴中煮沸5min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化，出现砖红色沉淀的为阳性。
[0034](2)薄层层析(TLC)定性检测:分别将5 μ L上述浓缩发酵液和龙胆苦苷标准品在GF254硅胶薄层板上点样，在展开剂氯仿-甲醇(V/V，20:80)中展开，结束后在紫外灯下观察，记录斑点，并计算其Rf值。
[0035](3)HPLC定量检测:取800mL发酵液，在100°C下浓缩至5mL(即得浓缩发酵液)后，加入IOmL甲醇萃取，过滤萃取液，滤液以0.45 μ m微孔滤膜过滤后用于HPLC法测定龙胆苦苷的含量；HPLC色谱条件为:色谱柱:化学键合型十八烷基柱(SciC18色谱柱)；Pump:K-1001 ；Detecter:K_1501 ;流动相:甲醇-水(V/V,30:70);柱温:25°C。
[0036](三)重组以及筛选流程
[0037]I)提取秦艽基因组DNA:取适量陕西道地产秦艽新鲜叶片5g，用液氮迅速研磨至粉末后，将其装入50mL的离心管中；接着迅速将3mL预热的CTAB提取液(2% CTAB, 1.4MNaCl,0.02M EDTA，0.1M Tris-HCl,0.2%巯基乙醇，pH = 8.0)加入至所述离心管中；之后放入65°C水浴锅中，保温60min后(期间轻摇5次)，加入4mL氯仿-异戊醇(24:1)，轻摇混匀至乳白色后，置于4°C、I 1000rpm离心15min ;取上清液并加入0.6倍体积的异丙醇,摇匀；后置于4°C、I 1000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇漂洗2次，放置于超净工作台中吹干得秦艽基因组DNA。用ImL Tris-EDTA (pH8.0)缓冲液溶解秦艽基因组DNA，并用紫外分光光度计测其浓度，最后放入4°C冰箱保存。
[0038]2)低能N+离子注入菌膜:将本实验室保藏的出发菌株(H.polymorpha DL-1)于370C、YPD固体培养基上划线活化24h后，挑取新鲜菌落接种到YPD液体培养基中，于37°C、110r/min转速条件下培养16h得菌液A，取适量菌液A用无菌水稀释至浓度为1.0XlO7CFU/mL得菌体稀释液，取0.1mL菌体稀释液均匀涂布于直径90mm的无菌平皿中央,无菌风吹干制成菌膜，然后置于离子束注入机的真空靶室中进行低能N+注入，注入能量为20Kev，注入剂量为2.0X 1016ions/cm2，脉冲时间为5s，间隔时间为10s，真空度为1.5X 10_3Pa。
[0039]3)固体培养:经过步骤2)后，用2mL含有秦艽基因组DNA的Tris-EDTA缓冲液(pH8.0)浸泡经低能N+离子注入后的菌膜，于37°C温育2h后，用移液器进行洗脱，将菌全部洗脱下来得菌液B，分别取0.1mL菌液B均匀涂布于YPD固体培养基后于37°C培养72h。
[0040]4)重组菌株初筛:经过步骤3)后，将YPD固体培养基上生长的菌落转接到试管中进行液体培养(37°C、110rpm/min培养96h),于10000r/min离心10min收集发酵液进行浓缩，然后再进行检测分析。
[0041]龙胆苦苷属于环烯醚職苷类,该类物质的检测主要采用Molish反应和Fehling试验。首先利用Molish反应对重组菌株发酵液进行分析，观察样品液的反应中是否出现紫色环(阳性结果为出现紫色环)。然后，再利用Fehling试验对上述出现紫色环的重组菌的发酵液进一步分析，观察样品液中是否有砖红色沉淀生成(阳性结果为出现砖红色沉淀)。上述两种阳性反应结果表明重组菌株的发酵液中存在糖苷类化合物，可作为后续分析的初筛重组菌株。
[0042]5)定性、定量检测:将初筛重组菌株接种于含IOmL YTO液体培养基的试管中，并于37°C、110r/min下培养12h得种子培养液，以体积为5%的接种量将种子培养液接种于含IOOmL YPD液体培养基的250mL三角瓶中，然后于110r/min、37°C下培养90h，然后于10000r/min离心10min,离心得到 的菌体用无菌蒸懼水冲洗两次后于85°C烘干至恒重进行称重分析，离心得到的上清液用于产物定性、定量检测，主要采用薄层层析(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)。
[0043]TLC定性鉴定:分别用毛细管将5 μ L的初筛重组菌株浓缩发酵液、阴性对照酵母菌株的浓缩发酵液及龙胆苦苷标准品点于薄层板上，然后将薄层板置于展开剂氯仿-甲醇(V/V, 20:80)中进行展开。结果如图1所示，初筛重组菌株浓缩发酵液在与龙胆苦苷标准品相对应的位置上出现同样斑点，其Rf值为0.3，与龙胆苦苷标准品Rf值(0.29)非常接近，而阴性对照酵母菌株的浓缩发酵液在该处未出现斑点，表明初筛重组菌株发酵过程有新物质合成。
[0044]HPLC法定量鉴定:分别将初筛重组菌株浓缩发酵液、阴性对照酵母菌株的浓缩发酵液及龙胆苦苷标准品进行HPLC分析，结果如图2所示，保留时间为12.377min处初筛重组菌株浓缩发酵液中出峰(图2B)，与龙胆苦苷标准品出峰(图2A)的保留时间12.370基本一致，而阴性对照酵母菌株的浓缩发酵液在该处未出峰，表明初筛重组菌株具有生物合成龙胆苦苷的能力。通过上述步骤，最终本发明筛选得到了一株重组菌株DL-49，本发明筛选获得的重组菌株的分类命名为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha),该重组菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期为2014年4月3日；保藏编号为CGMCC N0.8998。
[0045](四)重组菌株的发酵及龙胆苦苷分离提取
[0046]重组菌株(CGMCC N0.8998)的发酵工艺:采用15L全自动发酵罐对筛选出来的重组菌株(CGMCC N0.8998)进行高密度发酵生产龙胆苦苷，将重组菌株经种子培养后(参照上文种子培养液的获得)以5% (体积比)的接种量接种于YPD液体培养基中，于37V、转速为300r/min下进行连续发酵96h，pH为6.5，发酵中同时流加0.5% (w/v，每IOOmL水中含0.5g葡萄糖)的葡萄糖水溶液，流速为12.5mL/h，发酵48h后，每隔12h取发酵液500mL，测定酵母细胞生物量和龙胆苦苷。结果如图3所示。可知，菌体浓度随着培养时间的增加不断升高，培养72h后细胞生物量增加到42.35g/L ;龙胆苦苷从60h开始大量出现，并随着时间延长，产量稍有增长，72h时产量达到最高，达7.53mg/L。
[0047]龙胆苦苷分离纯化:依据上述发酵工艺，将重组菌株(CGMCC N0.8998)进行高密度发酵96h，于48h、60h、72h、84h和96h分别取500mL发酵液进行分离纯化检测分析。具体为将发酵液500mL经过12000r/min离心10min后，将上清液于80°C浓缩至10mL，采用D301型大孔树脂对龙胆苦苷进行静态吸附富集8h，后用20mL体积分数8 %的乙醇水溶液对龙胆苦苷进行洗脱，收集洗脱液于60°C浓缩至ImL后进行HPLC检测分析，可得到纯度为84.35%的产物，龙胆苦苷的回收率为73.15%。
[0048](五)重组菌株的遗传稳定性
[0049]将重组菌株(CGMCC N0.8998)活化后接种于含200mL YPD液体培养基的三角瓶中进行培养(37°C、110r/min)，传代培养8代测定重组菌株的遗传稳定性。结果如图4所示，表明传代培养过程中重组菌株发酵液中龙胆苦苷含量基本不变，传代培养8代后龙胆苦苷含量为2.106mg/L,相比于第一代重组菌株的龙胆苦苷含量(2.235mg/L)降低了 6.1%,说明该重组菌株遗传稳定。
[0050]总之，本发明利用低能离子注入技术转化酵母构建产龙胆苦苷重组菌株，并筛选获得了一株可用于发酵生产龙胆苦苷的重组菌株(CGMCC N0.8998)。此外，与植物提取法相t匕，微生物发酵生物合成龙 胆苦苷具有生产成本低、生产周期短、不受自然气候影响、节约土地、胞外产物分离提取简单等优点，这为解决龙胆苦苷来源短缺问题、保护龙胆科植物资源并实现其可持续发展提供了新途径。本发明首次采用低能离子注入技术介导秦艽总DNA在酵母菌中随机转化以筛选产龙胆苦苷重组菌株，为利用微生物生产龙胆苦苷提供实践依据。
【权利要求】
1.一种多形汉逊酵母重组菌株，其特征在于:该重组菌株的分类命名为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha),所述重组菌株保藏于CGMCC,保藏编号为CGMCC N0.8998。
2.根据权利要求1所述一种多形汉逊酵母重组菌株，其特征在于:所述重组菌株的发酵方法包括以下步骤:于37°C、转速为300r/min条件下培养60~96h。
3.根据权利要求2所述一种多形汉逊酵母重组菌株，其特征在于:所述发酵采用的培养基为YPD液体培养基，发酵过程中流加0.5%的葡萄糖水溶液，流速为12.5mL/h。
4.一种如权利要求1所述多形汉逊酵母重组菌株在龙胆苦苷生物合成中的应用。
【文档编号】C12P19/60GK103966112SQ201410174666
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】钱卫东, 付云芳, 蔡长龙, 毛培宏, 王婷, 赵德志, 施春阳 申请人:陕西科技大学