组成型启动子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种包含强组成型启动子的分离的核酸序列和一种在该启动子控制 下的在真核细胞培养基中生产感兴趣的蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 已采用真核宿主成功生产了重组蛋白。最著名的例子是酵母，如啤酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母（Pichiapastoris)或多形汉逊酵母（Hansenula polymo;rpha)，丝状真菌（filamentousfungi),如泡盛曲霉（Aspergillusawamori)或里氏 木霉灯richodermareesei)，或哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞（C册）细胞。尽管某 些蛋白已经实现高速率生产，许多其他蛋白质只能W比较低的产量获得。
[0003] 基因在宿主生物中的异源表达需要一种可实现宿主细胞的稳定转化的载体。该载 体将提供具有紧邻编码序列5'端的功能启动子的基因。从而该启动子序列调节和启动转 录。目前所用的大多数启动子来源于编码通常在细胞中W高浓度存在的蛋白的基因。
[0004]EP0103409A2公开了和糖酵解途径中的特定酶的表达相关的酵母启动子的使用， 例如设及丙酬酸激酶、憐酸丙糖异构酶、憐酸葡萄糖异构酶、憐酸甘油酸变位酶、己糖激酶1 和2、葡糖激酶、憐酸果糖激酶、醒缩酶和糖酵解调苄基因的启动子。
[0005] WO97/44470描述了源自解脂耶氏酵母（Yarrowialipoidica)的转录延伸 因子I(TEFl)蛋白和适合在酵母中表达异源蛋白的核糖体蛋白S7的酵母启动子，并且 EP1951877A1描述了生产异源蛋白的毕赤酵母（P.pastoris)TEFl启动子的使用。
[0006]W02005003310提供了在使用从产油酵母（oleaginousyeast)解脂耶氏酵母 (Yarrowialipoidica)的甘油醒-3-憐酸脱氨酶或憐酸甘油变位酶启动子在酵母中表达 感兴趣的编码序列的方法。
[0007] 源自设及毕赤酵母（Pichiapastoris)甲醇代谢途径基因的启动子序列已经公开 于US4808537 和US485523U醇氧化酶A0XUA0X2)和US6730499B1 (甲醒脱氨酶FLDl)中。 US20080153126A1包括基于AOXl启动子的突变体启动子序列。
[0008] AOXl启动子仅受甲醇诱导，并受到其他碳源例如葡萄糖或乙醇的阻遏。甲醇的弊 端是因为可能具有毒性和易燃性，不适合用于生产某些产品。因此，我们试图寻找AOXl启 动子的替代物。
[0009]Vassileva等人（J.Biotechnol. (2001)88:21-35)描述了使用多拷贝表达盒作为 AOXl启动子的替代物，在毕赤酵母中使用GAP启动子表达乙型肝炎病毒表面抗原（皿sAg)。 提出了维持细胞在对数中期的连续培养的构成体系。
[0010]毕赤酵母中使用的启动子或者受到严格调控（像pAOX或pFLD)，对特定底物例如 甲醇有活性，或者在许多不同的条件，培养基和底物中具有组成型活性。已经报道，在运些 组成型启动子中，特别是GAP和TEF启动子对于重组蛋白的产生具有强的和有用的启动作 用。
[0011] 但是，结果表明两种组成型启动子在分批补料生产过程中不是一直强启动的。特 别是在在该过程的后期，当细胞生长率低时，该启动子活性也降低，因此限制了感兴趣的基 因（GOI)的表达和生产量（Stadlmayr等人，2010.JBiotechnol. 150:519-529)。
[0012]因为即使是高丰度的糖酵解酶例如締醇酶巧NO)，憐酸丙糖异构酶（TPI)或葡萄 糖6-憐酸异构酶（PGI)都没有如pGAP和pTEF-样强的启动子，因此选择合适的启动子 不是凭直觉而是理性的。（Stadlmayr等人 2010.JBiotechnol. 150:519-529;Gasser等 人.2010.Met油olic!Engineering12:573-580).
[0013]Qin等人（Appliedand!EnvironmentalMicrobiology(2011) 3600-3608)报道了 GAP启动子库和各种具有不同活性的启动子。
[0014]W02007/015178A2报道了能够诱导重组蛋白分泌生产的转录融合伴侣和毕赤酵母 cDNA库。
[0015]CN102180954A报道了采用毕赤酵母细胞壁蛋白GCW14作为错定蛋白的细胞表面 显不系统。
[0016] 需要的是提供改善的重组真核细胞系来生产可高产量分离的发酵产品。因此，本 发明的目的是提供适合重组生产方法的可选择的调节元件，该调节元件是简单和高效的。
【发明内容】
[0017] 通过权利要求的主题解决了本发明的目标。
[0018] 本发明提供了一种包含启动子的分离核酸序列，该启动子是一种天然的毕赤酵母 序列，包含SEQID1所示的PCSl核酸序列或由该序列组成，或者其有功能活性的变种，它 是一种长度变种，一种突变体或与其结合。
[0019] 根据一个特定方面，本发明提供了一种包含一种启动子的分离核酸序列，该启动 子是一种天然的毕赤酵母序列，包含SEQID1所示的PCSl核酸序列或由该序列组成，或是 一种其有功能活性的变种，该有功能活性的变种是一种长度变种，一种SEQID1的突变体 或杂合序列，或其结合，其中，所述有功能活性的变种表现与pCSl，特别是SEQID1所示的 pCSl核酸序列实质相同的活性。
[0020] 特别地，所述pCSl核酸序列与所述SEQID1的序列相同。
[0021] 优选地，所述本发明的核酸序列与W02007/015178A2的列表中的SEQID87(即， 本申请的SEQID24)的核酸序列不相同。
[0022] 特别地，所述有功能活性的变种是
[0023]a) -种沈QID1所示的pCSl的长度变种，优选包含选自由沈QID2、3、4、5、6、7 和8组成的组的核酸序列或由该核酸序列组成；
[0024]b) -种SEQID1所示的pCSl的突变体，或一种a)的长度变种的突变体，其突变 体具有与所述序列SEQID1或所述长度变种至少60 %的同源性；
[00幼 C) 一种杂合序列，包含
[0026] -一一种选自由序列为SEQID1所示的pCSl、一种a)的长度变种和一种b)的突 变体组成的组的序列；和
[0027] -一至少一种选自由SEQID1所示的pCSl、一种a)的长度变种、一种b)的突变 体和一种异源序列组成的组的进一步的序列；或
[0028]d) -种序列，所述序列在严谨条件下与任何长度变种杂交，或者与a)或b)的突变 体核酸序列杂交。
[0029] 优选地，所述沈QID1所示的pCSl的长度变种由沈QID2、沈QID3、沈QID4、 沈QID5或沈QID6中任一项组成。
[0030] 根据一特别实施方式，所述有功能活性的变种选自由和下列序列同源的序列组成 的组：
[0031]i)至少约60%的核巧酸序列一致性；
[0032] ii)通过修饰所述SEQID1所示的pCSl的核巧酸序列或其长度变种获得的同源 序列，或者通过插入、删除或替换所述序列内的或者一个或两个末端的一个或多个核巧酸 获得的同源序列，优选地，具有SObp~1500bp，或200bp~ISOObp的核巧酸序列，更优选 地，具有至少2(K)bp的核巧酸序列；和
[0033] iii)源自毕赤酵母W外的种的类似物。
[0034] 特别地，本发明的有功能活性的变种具有与pCSl实质相同的启动子活性。
[0035] 根据一特别实施方式，所述核酸序列与编码POI的核巧酸序列操作性连接，该核 酸与编码POI的核巧酸序列并非天然相关的。
[0036] 根据一特别方面，所述核酸序列进一步包含实现POI分泌的信号肤基因，优选地， 其中，所述信号肤基因定位于临近所述编码所述POI的核巧酸序列的5'端.
[0037] 相应地，本发明特别设及一核酸序列，其进一步包含编码实现POI分泌的信号肤 的核酸序列，优选地，其中，编码所述信号肤的核酸序列定位于临近所述编码POI的核巧酸 序列的5'端处。
[0038] 本发明进一步提供了一种包含本发明所述核酸序列的表达构建物，优选地，提供 一种自主复制载体或质粒，或一种整合到宿主细胞的染色体DNA的构建物。
[0039] 本发明进一步提供了一种包含本发明所述核酸序列或本发明的表达构建物的重 组宿主细胞，优选地，提供一种真核细胞，更优选地，提供一种酵母或丝状真菌细胞，更优选 地，提供一种酿酒酵母属或毕赤酵母细胞属的酵母细胞。
[0040] 根据一特别方面，所述重组宿主细胞包含多拷贝的所述核酸序列，和/或多拷贝 的所述表达构建物。例如，所述包含2, 3,4,或5个拷贝（基因拷贝数GCN)的重组细胞。
[00川特别地，所述重组宿主细胞选自由哺乳动物、昆虫、酵母、丝状真菌和植物细胞组 成的组，优选酵母，优选毕赤酵母株CBS704、CBS2612、CBS7435、CBS9173-9189、DSMZ 70877、X-33、GSl15、KM71和SMDl168中的任一种。在某些实施方式中，所述重组宿主细胞 是X-33W外的毕赤酵母菌株。
[0042]本发明进一步提供本发明的细胞的稳定培养物。
[0043] 本发明进一步提供通过培养重组宿主细胞生产POI的方法，该重组宿主细胞包含 本发明的核酸序列或启动子或本发明的表达构建物，和在所述启动子的转录控制下的编码 POI的核酸，包含步骤：
[0044]a)在表达所述POI的条件下培养所述细胞系，和
[004引 b)回收所述POI。
[0046] 特别地，所述POI是在生长限制条件下表达的，例如在低于最大生长速率的条 件下培养细胞系，典型地，低于细胞最大生长速率的90%，优选地，低于最大生长速率的 80 %，低于最大生长速率70 %，低于最大生长速率60 %，低于最大生长速率50 %，低于最大 生长速率40 %，低于最大生长速率30 %，低于最大生长速率20%，低于最大生长速率10%，低于最大生长速率5 %，低于最大生长速率3 %，低于最大生长速率2%，低于最大生长速率 1%，低于最大生长速率0. 5%，低于最大生长速率0. 4%，低于最大生长速率0. 3,或低于最 大生长速率0.2%。典型地，所述最大生长速率是针对特定宿主细胞单独确定的。
[0047]根据一特别实施方式，所述细胞系是在分批培养、分批补料培养或连续培养条件 下，和/或在包含限制性碳源的培养基中培养。
[0048] 特别地，所述培养是在生物反应器中实施，从分批培养期开始，随后是分批补料培 养期或连续培养期。
[0049] 特别地，所述宿主细胞是在高速率生长（例如，最大生长速率的至少50%，或至少 60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %，至少99 %，或直到最大生长速 率）期间在富含碳源的培养基中生长，并在低生长速率（例如低于最大生长速率90%，或低 于80 %，低于70 %，低于60 %，低于50 %，低于40 %，低于30 %，低于20%，低于10%，低于 5%，低于3%，低于2%，低于1%，低于0. 5%，低于0. 4%，低于0. 3%，或低于最大生长速 率0.2% )期间产生所述P0I，例如，同时优选地，通过补充限制碳源的基础培养基限制所述 碳源。特别地，所述限制碳源的基础培养基不包含诱导转录的碳源。
[0050] 特别地所述POI是一种异源蛋白质，优选自治疗性蛋白，包括抗体或其片段，酶和 多肤，蛋白抗体，毒素融合蛋白，碳水化合物-蛋白质共辆物，结构蛋白，调节蛋白，疫苗和 疫苗类蛋白或颗粒，加工酶，生长因子，激素和细胞因子，或POI的代谢物，特别地，包括本 发明的所述启动子的转录控制下表达感兴趣的基因的重组细胞培养的细胞代谢物。
[0051] 本发明进一步提供从真核细胞识别组成型启动子的方法，包括步骤：
[0052] a)W高生长速率培养真核细胞；
[0053]b)W低生长速率进一步培养所述真核细胞；
[0054]C)提供步骤a)和b)细胞培养物的样品；
[0055] d)在所述样品中实施转录分析，并将所述转录水平与所述细胞的天然pGAP启动 子的转录水平比较；和
[0056]f)选择与高生长速率和低生长速率的天然pGAP启动子比具有更高转录强度的组 成型启动子，优选地，通过决定所述经识别的组成型启动子的转录水平进行选择，该启动子 的转录水平与所述天然PGAP启动子比较至少是1. 1倍，优选至少是1. 2倍，优选至少是1. 3 倍，优选至少是1. 4倍，优选至少是1. 5倍，优选至少是1.6倍，优选至少是1. 7倍，优选至 少是1.8倍，优选至少是1. 9倍，优选至少是2倍，优选至少是3倍，优选至少是4倍，优选 至少是5倍，优选至少是10倍，或至少是15倍。
[0057] 特别地，在0.01~0.2hi范围内，优选0.015~0. 15h1范围的高生长速率和低 生长速率下，例如通过检查一种细胞培养物的至少两个样品来确定转录水平，第一个样品 代表高生长速率，例如至少0. 05h1，优选至少0. 06h1，或至少0. 07h1，至少0. 0她1，至少 0.0化1，至少0.Ih1，例如，在0. 15h1的生长速率，而第二个样品代表低生长速率，例如， 低于第一样品的生长速率，例如，低于0. 〇5h1，优选地，低于0. 04h1，低于0. 03h1或低于 0. 0化1，例如在0. 015h1的生长速率。特别地，例如，根据下述实施例11，转录水平是通过 采用DNA忍片分析基因表达模式确定的。
[0058]本发明进一步提供了包含启动子或由启动子组成的分离的核酸序列的用途，当与 编码POI的核巧酸序列可操作的连接时，该启动子指导POI在宿主细胞中表达，且表达水平 高于高生长速率和低生长速率时的天然PGAP启动子控制下的表达水平，优选在一种通过 培养采用所述核酸序列转化的宿主细胞产生所述POI的方法中的用途，其中，所述培养是 在生物反应器中实施，W分批培养期开始，随即为分批补料培养期或连续培养期。
[0059] 特别地，所述表达水平是在0.Ol~0. 2h1的高和低生长速率范围内，优选在 0.015~0. 15h1范围内通过检查一种细胞培养物的至少两个样品确定的，第一个样品 代表高生长速率，例如至少0. 05h1，优选至少0. 06h1，或至少0. 07h1，至少0. 0她1，至少 0.0化1，至少0.Ih1，例如，在0. 15h1的生长速率下，而第二个样品代表低生长速率，例如， 低于第一样品的生长速率，例如，低于0. 〇5h1，优选地，低于0. 04h1，低于0. 03h1或低于 0. 0化1，例如在0. 015h1的生长速率。特别地，所述表达水平式在生长限制条件下确定的。 实施例10提供了在生长限制条件下例如在葡萄糖限制的恒化器培养中，在高和低生长速 率下确定表达强度的例子。
[0060] 特别地，所述表达水平和所述PGAP启动子比较，至少为1. 1倍，优选地，可至少为 1. 2倍，优选地，至少为1. 3倍，优选地，至少少为1. 4倍，优选地至少为1. 5倍，优选地，至少 为1.6倍，优选地，至少为1. 7倍，优选地，至少为1.8倍，优选地，至少为1. 9倍，优选地，至 少为2倍，优选的，至少为倍，优选至少为4倍，优选至少为5倍，优选至少为10倍，或至少 为15倍。
[0061] 根据一特别的方面，本发明的所述分离的核酸序列或本发明的所述表达构建物可 用于通过培养采用所述核酸序列和/或表达构建物转化的宿主细胞生产POI的方法，优选 地，其中，所述培养在生物反应器中实施，从分批培养期开始，随即是分批补料期或连续培 养期。
【附图说明】
[006引图1 :毕赤酵母的核酸序列pCSl(98化P，SEQID1)和启动子序列，该启动子序列 是包括PCSl和在5'端的附加核巧酸，或促进CSl在毕赤酵母表达的pCSl片段的DNA序列， 包含14886口669102)、76化口669103)、5006口669104)、3446口669105)、2346口（569ID6)、138bp(SEQID7)和 85bp(SEQID8)。
[0063] 图2 :W下菌株的CSl编码核巧酸序列和氨基酸序列
[0064] 1)菌株65115，〔857435 和〔852612任45_。虹1-4_0586)，编码序列（569 10 9)，翻 译序列狂M_002490678. 1，SEQID10);和
[0065] U)菌株DSMZ70382(PIPA02805),编码序列（SEQID11)，翻译序列（SEQID 12).O
[006引 图3 :毕赤酵母（GS1巧）的天然pGAP启动子序列（SEQID蝴。
【具体实施方式】
[0067] 说明书全文使用的特定术语具有下列含义：
[006引本文所用术语"碳源"或"碳源物"指的是一种发酵碳源物，典型的，指一种适合作 为微生物能源的源碳水化合物，例如，可被宿主微生物或生产细胞系代谢的碳源，特别是选 自由单糖、寡糖、多糖，包括甘油的醇类组成的组的碳源，为纯化形式，在基础培养基中，或 在原材料中提供，例如一种复合营养物质。根据本发明，该碳源可用做单一碳源或作为不同 碳源的混合物。
[0069] 本文所用术语"碳源丰富条件"特别指的是适合细胞生长的碳源例如适合真核细 胞生长的营养物质的类型和数量。该碳源可W培养基，例如基础培养基或复合培养基，但也 可在包含纯化的碳源的（化学）限制性培养基的方式提供。
[0070] 本文用于细胞培养过程的生长期的碳源W称为"基础碳源"，并且通常W适于提供 细胞生长的量提供，例如获得至少为5g/L的细胞干物质量，优选地，至少lOg/L的细胞干 物质量，至少15g/L的细胞干物质量的细胞密度，例如在标准次级培养步骤期间，表现超过 90%的，优选超过95%的活力。
[0071] 在生长期，所述碳源通常过量或有剩余地使用，运通常可理解为例如培养高的特 定生长速率的细胞期间，过量提供能量W提高生物量。
[0072] 特别地，该剩余量超过生长限制条件下使用的碳源的限制数量，W在发酵液中获 得过剩浓度，该过剩浓度是可测量的，并且通常比采用包含限制性碳源底物的培养基培养 细胞获得的浓度至少高10倍，优选地，至少高50倍或至少高100倍。
[0073] 本发明术语"碳源限制的条件"或"限制性碳源"也指"补充碳源"，例如，根据本发 明的使用可理解为有利于通过生产细胞系而生产发酵产品的碳源的类型和数量，尤其是在 低于最大生长速率的受控生长速率的培养过程中。特别地，生长期例如分批培养期，分批补 料培养和连续培养过程后接着是生产期。
[0074] 总之，细胞培养过程可分为分批培养、连续培养和分批补料培养。分批培养是运样 的培养过程，通过该过程将少量的种子培养液添加到培养基，而细胞生长时不添加补料或 在培养期间不排出培养液。连续培养是运样的培养过程，通过该过程，在培养期间，连续添 加和排出培养基。连续培养也包括灌流培养。分批补料培养，是介于分批培养和连续培养 之间的一种中间方式，也称为半分批培养，它是运样的培养过程，通过该过程，在培养期间， 不断地或连续添加培养基，但与连续培养不同，培养液不是连续排出。
[00巧]特别优选的是一种W向培养液中补加生长限制因子为基础的分批补料方法。该分 批补料方案，包括单独的分批补料和重复的分批补料发酵，典型地用于生物产业工艺从而 在生物反应器中实现高细胞密度。碳源的控制性添加直接影响培养物的生长，并有助于避 免溢出代谢或形成不需要的代谢副产物。在限制碳源的条件下，特别地，碳源盛装于分批补 料培养过程的补料中。因此，碳源的提供量是受到限制的。
[0076] 在本发明所述恒化器或连续培养中，生长速率可得到严格控制。
[0077] 本发明中，碳源的"限制性量"可理解为保持细胞系处于生长限制条件下，例如在 生长期或在生产模式中必需的碳源的数量。运样的限制性数量可用于分批补料培养过程， 在运里，碳源包含于补料培养基中，低速流加到培养液中W维持能量供应，例如，产生P0I， 同时保持生物量处于低的特定生长速率。典型地，补料培养基是在细胞培养的生产期添加 到发酵液中。
[0078] 例如，碳源的限制性数量可W由细胞培养液中碳源的残留量决定，低于预定的阔 值或甚至低于标准（碳水化合物）检测法测量得到的检测限。典型地，该残留量在经过收 获发酵产品的发酵液中确定。
[0079] 碳源的限制性数量也可通过限制向发酵罐添加碳源的平均补料速率确定，例如由 向整个培养过程例如每次发酵时间的分批-补料期添加的数量决定，来决定计算得出的每 次添加（碳源）的平均数量。该平均补料速率保持低值，W便保证细胞培养物充分利用补 充的碳源，例如，在0.6g/L1 (g碳源/L初始发酵体积，h时间）和25g/LIh1，优选介于 1.6g/L屯i-20g/L屯 1。
[0080] 该碳源的限制性数量也可W通过特定生长速率确定，在生产期间，其特定 生长速率保持低速，如低于最大特定生长速率，例如在预先确定的范围内，例如在 0.OOlh1-0. 20h1，或 0. 02h1-0. 20h1，优选 0. 02h1 或~0. 15h1。
[0081] 可使用任意类型的适合用于真核细胞培养的有机碳源。根据一特定实施方式，