包含包封的antagomir的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及旨在预防或治疗屯、脏疾病，包括屯、脏缺血性疾病的药物制剂的领域。
【背景技术】
[0002] 急性屯、肌梗死（AMI)，也称为屯、肌梗死并通常被称为屯、脏病发作，代表世界上大多 数工业化国家的一个主要健康风险，并且仍然是世界范围内发病率和死亡率的主要原因。
[0003] 通常，AMI是由突然且持续缺乏流向屯、脏组织的血液造成，运一般是冠状动脉狭窄 或闭塞的结果。没有充分的血液供给，所述组织变得缺血，造成屯、肌细胞（屯、脏肌肉细胞） 和血管结构的死亡。
[0004] 近几十年来在治疗AMI中有很多进展，主要设及与药物疗法相结合的冠状动脉再 灌注。再灌注疗法已经通过减少梗死面积和改善短期和长期的发病率和死亡率而成功改变 AMI的自然进展。然而，使用目前可获得的两种再灌注策略有实质性的限制：纤维蛋白溶解 导致低程度的冠状动脉通透性，在AMI进化的开始几小时期间不能频繁应用初期血管成形 术。此外，在一些插管的患者中，除了正常的屯、外膜血流，出现"无复流"现象或缺乏微血管 再灌注，导致不良功能性结果。运意味着再灌注疗法不能预防屯、肌的有害重构（胶原蛋白 瘤痕形成的复杂的内在修复过程，导致屯、室扩张、收缩功能障碍和随后的屯、脏衰竭）的发 生。它在大约30%AMI中的发生主要与仍知之甚少的较大的梗死面积、微血管阻塞及不良 修复反应有关。
[0005] 因为修复性纤维化和缺血组织的功能恢复依赖于建立供应氧合血的网络，已经做 出努力W通过在愈合区域诱导新血管形成来改善血管床，从而在原位实现将损伤区域直接 转变为功能性组织。
[0006] 血管生成的治疗性诱导可W减轻运种现象的发生。尽管如此，若干年静脉促血管 生成因子的临床试验结果并不令人满意。不被理论束缚，认为造成运种失败的原因之一是 静脉途径不能够在严重受损的屯、脏条件下到达并在祀组织中维持有效的药物浓度，从而促 进并维持功能性的血管网络。
[0007] 为了解决运个问题并预防AMI后的屯、功能不全，在过去十年内开始了再生屯、肌和 血管可能性的研究。施用多能祖细胞和灌注血管生长因子的初始研究显示有前途的结果， 但转到临床设置则显示运些治疗不能W足够恢复被破坏的屯、肌的方式再生新血管。
[0008] 今天，血管生成和用细胞治疗的受损屯、脏的再增殖W及特定的药物和再同步化治 疗能够减缓运种现象的进展，但预防它的发生对于屯、脏医学仍然是有疑问的挑战。因此，需 要预防有害的左屯、室重构的新的治疗策略。
[0009] 发巧简沐
[0010] 本发明设及通过施用通过调节microRNA的活性或表达来逆转或预防屯、室重构 的组合物治疗屯、脏疾病，优选缺血性疾病。更具体地，本发明提供包含设及血管生成的 microRNA的抑制剂的组合物，所述抑制剂优选包含于能够将所述抑制剂局部释放至缺血祀 组织的新的递送介质中。此外，本发明提供逆转或预防屯、室重构的方法和用于所述方法的 试剂盒。
[0011] 本发明设及一种组合物，其包含有效量的至少一种设及血管生成的miRNA或其前 体的抑制剂，其中将所述抑制剂微包封成聚合的生物可降解且生物相容的微球。
[0012]在上述组合物的一些实施方案中，所述miRNA选自包含miR-92 (包括miR-92a-l、 miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和miR-16-2)、 miR-374 (包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24 (包括miR-24-l和miR-24-2)、 miR-483、miR-：M(包括miR-：Ma、miR-34b和miR-：Mc)、miR-20 (包括miR-20a和miR-20b)、 miR-15 (包括miR-15a和miR-15b)的家族。
[0013] 在上述组合物的一些实施方案中，所述miRNA的抑制剂是长度为8-49个核巧酸的 具有祀向所述miRNA或其前体的序列的寡核巧酸。在某些实施方案中，所述寡核巧酸是与 所述祀miRNA或其前体至少部分互补的反义寡核巧酸。所述反义寡核巧酸选自核糖核巧 酸、脱氧核糖核巧酸、小RNA、antagomir、LNA、CDNA、PNA、吗嘟代寡核巧酸或它们的组合。
[0014] 在上述组合物的一些实施方案中，所述miRNA的抑制剂由antagomir组成，优选由 包含核巧酸序列的antagomir组成，所述核巧酸序列包含至少16个与选自本文所述的SEQ ID NO :1-58的序列的核巧酸互补的连续核巧酸。
[001引在上述组合物的一些实施方案中，所述miRNA的抑制剂由包含序列SEQIDNO:59 或60和其除碱基替换之外的修饰，及其片段的antagomir组成，所述片段由SEQIDNO:59 或60的至少8个连续核巧酸的子序列组成。
[0016] 在上述组合物的一些实施方案中，所述微球的直径不超过25ym，包括直径为 5-20ym，优选5-15ym的微球。
[0017] 在上述组合物的一些实施方案中，所述微球由聚-d，l-丙交醋（PLA)组成的聚合 物制成，所述聚合物任选地与一种或多种其他聚合物混合。
[0018] 本发明还设及逆转或预防需要其的受试者屯、室重构的方法，包括向所述受试者施 用有效量的上述组合物。
[0019] 本发明还设及生物可降解且生物相容的微球群体用于治疗或预防屯、肌梗死的用 途，其中所述微球：
[0020] -平均直径为 5-20Jim，优选 5-15Jim;
[0021]-由聚-d，^丙交醋-乙交醋共聚物（PLGA);聚-d，1-丙交醋（PLA)或它们的混 合物制成；
[002引-包含1% -15%w/w的能够预防屯、室重构的治疗剂；
[0023] 其中所述治疗剂由选自W下的miRNA或其前体的抑制剂组成：miR-92 (包 括miR-92a-l、miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和 miR-16-2)、miR-374 (包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24 (包括miR-24-1 和 miR-24-2)、miR-483、miR-：M(包括miR-：Ma、miR-34b和miR-：Mc)、miR-20 (包括miR-20a 和miR-20b)、miR-15 (包括miR-15a和miR-15b)，优选miR-92a。
【附图说明】
[0024]图I显示通过扫描电镜测定的antagomi;r-92a-PLGA微球的形态。
[00巧]图2显示通过激光散射测定的antagomi;r-92a-PLGA微球的尺寸分布。
[0026] 图3显示通过重复注射微球直到120mg对血液动力学和左屯、室收缩性的作用。
[0027] 图4显示通过重复注射微球直到240mg对血液动力学和左屯、室收缩性的作用。
[0028] 图5显示单次冠状动脉内注射根据本发明的微球的分子作用的研究方案。
[0029] 图6显示本发明的微球对miR-92a的抑制特异性。
[0030] 图7显示包封的antagomi;r-92a诱导梗死组织中的血管生成。通过将血管总数除 W总的梗死面积计算梗死区的血管密度。N= 20.冲<0. 01。
[003。图8 :间接测量。AMI后一个月，在用包封的antagomir-92a、安慰剂或盐水处理的小猪的梗死相关动脉中测量基础和最小的微血管阻力指数。（a)用血压（mmHg)乘W冠脉流 量（ml/min)来计算基础微血管阻力指数（MRI)，所述血压用位于顶端LAD(Pd)的压力线测 量，和所述冠脉流量用位于LAD远段的感应器定量。用在最大充血测量的相同参数计算最 小微血管阻力指数（MRIhyp)，所述最大充血通过向股静脉12F銷静脉输注140mg/min的腺巧 来实现。n=12*p<0. 01**p=0. 05。化）坏死区中血管总数和MRI之间的关系。R2 0. 41，p =0. 02,n=12。（C)坏死区中血管总数和最小MRI之间的关系。R2 0. 27,P=0. 08,n= 12。
[0032] 图9:直接测量。AMI后一个月，在用包封的antagomir-92a处理和不处理的小猪 的梗死相关动脉中测量基线和实际微循环阻力。（a)用血压（mmHg)除W冠脉流量（ml/min) 来计算基线微循环阻力（基线MR)，所述血压用位于顶端LAD(Pd)的压力线测量，和所述冠 脉血流量用位于LAD远段的感应器定量。处理组的基线MR显著低于对照（7. 47 + 1. 33VS 19. 62 + 2. 98,P= 0.005)。n= 13。用在最大充血测量的相同参数计算实际微循环阻力 (TMROiyp))，所述最大充血通过向股静脉12F銷静脉输注140mg/min的腺巧来实现。在处 理组中观察到显著低于对照的TMR化yp) (5. 0 + 1. 15vs14. 49 + 2. 4,P= 0. 006)。n= 13。 化）所有坏死区中血管密度与基线MR之间的关系。R2= 0. 35,P= 0. 033,n= 13。（C)所 有坏死区中血管密度与TMRQiyp)之间的关系。R2= 0. 31，P= 0. 047,n= 13。
[0033] 图10 :AMI后一个月，用对分配处理盲法的超声屯、动图评估隔顶运动障碍 (S巧toapical diskynesia)的存在。显示了处理和未处理动物中患有隔顶运动障碍动物的 百分比（83. 3%VS16. 7%，P= 0. 0：3)。n= 20。
[0034] 图11:体外评估包封的antagomir92a和未包封的antagomir92a对miR92a表 达的作用。
[0035] 图12:包封的antagomir17和20a对它们各自miRNA的作用。
[0036] 发巧详沐
[0037]W下给出由本发明涵盖的所有实施方案的描述相关的一些定义。
[003引MicroRNA(MiR)是作为生物过程关键调节器的小的非编码RNA。
[0039] "MicroRNA"、"miRNA"或"miR"是指长度为约18至约25个核巧酸的非编码RNA。 运些miR可W来自多种来源，包括：编码miRNA的单个基因，来自蛋白编码基因的内含子，或 来自通常编码多个密切相关的microRNA的多顺反子的转录物。
[0040] 目前的知识显示，miRNA由RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(polIII) 转录，且来自一般为几千个碱基长的称为初级miRNA转录物（pri-miRNA)的初始转录 物。pri-miRNA在细胞核中被RNase化OSha加工成约70-100个核巧酸的发夹型前 体（pre-miRNA)。被运输到细胞质后，发夹pre-miRNA进一步被Dicer加工W产生双链 microRNA;然后被称为成熟microRNA的其中一条链（有时两条链均可使用）被整合到RNA诱导的沉默复合物巧ISC)，其中它与它的祀mRNA通过碱基对互补相关联。在相对罕见情 况下，即当HiiRNA碱基对与信使RNA(mRNA)祀标完全配对时，它促使mRNA降解。更普遍的， microRNA与祀mRNA形成不完美的异源双链体，影响mRNA的稳定性或抑制mRNA的翻译。
[00川"茎环序列"是指具有发夹结构且包含成熟miRNA序列的RNA。pre-miRNA序列和 茎环序列可W重叠。茎环序列的实例可W在名为miRBase的microRNA数据库中发现。
[0042] "microRNA前体"是指来源于基因组DNA且包含含有一个或多个microRNA序列的 非编码结构化RNA的转录物。例如，在某些实施方案中，microRNA前体是pre-miRNA。在某 些实施方案中，microRNA前体是pri-miRNA。
[0043]W下说明书将遵循标准命名系统，其中没有大写的"mir-X"是指pre-miRNA，而大 写的"miR-X"是指成熟形式。当两个成熟microRNA来自相同pre-miRNA的不同臂，它们分 别被加W后缀-化或-5p。当相对表达水平已知时，名称后面的星号表示microRNA相对于 发夹另一条臂的microRNAW低水平表达。
[0044] 在W下说明书中，除非另有说明，表述miR-X(如果有的话）用来指包括-化和-5p 两种形式的成熟miRNA。
[0045] 为了避免疑问，在本说明书中，表述mic;roRNA、miRNA和MiR是指相同产物。
[0046] 因此，在本发明上下文中，目的是用特别关注的设及血管生成的microRNA调控血 管生成或血管生成过程。因此，本发明的目的是调控属于设及血管生成调控的microRNA家 族的至少一种microRNA。
[0047] 表述"microRNA家族"意欲是指具有由调控血管生成或血管生成过程组成的相关 功能的一组microRNA。更具体地且非限制性地，所述microRNA选自显示出抗血管生成活性 的microRNA。
[0048] 更具体地，且非限制性地，运种microRNA选自miR-92 (包括miR-92a-l、miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和miR-16-2)、miR-374(包 括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1 和miR-24-2)、miR-483、 miR-：M(包括miR-：Ma、miR-34b和miR-：Mc)、miR-20 (包括miR-20a和miR-20b)、miR-15 (包 括miR-15a和miR-15b)，或其前体。对血管生成具有调控性质，优选括抗性的任何miRNA应 当被认为是该microRNA家族的一部分，运对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[004引为了避免疑问，除非另有说明，W下说明书中的表述microRNA将是指已经从它的 前体切割的成熟或经加工的RNA。对于非成熟形式，将使用表述"前体"或"microRNA前体"。
[0050] 下表1将本说明书涵盖的microRNA前体的不同序列进行了重新分组。
[0051]
[0053] 表I
[0054] 对于各个microRNA，下表2显示microRNA的序列和进入相应前体序列的相应残基 (参见表1)。
[00 巧]
[0057]表 2
[005引除非另有说明，本申请中所指的前体和microRNA序列是人序列。然而，在某些情 况下，microRNA人序列与来自其他物种的microRNA序列同源。
[0059] 作为一个实例可W提及，人miR-92a与来自其他物种的miR同源。更具体地， 人miR-92a与来自血e(D;rosophilamelanogaster，黑腹果蛹）、mmu(Musmus州lus，小家 鼠）、rno(Rattusnorvegicus，褐家鼠）、dps值rosophilapseudoobscura，拟暗果虫單）、 aga(Anophelesgambiae，冈t：t亚按蚊）、dre值aniorerio,斑马鱼）、mml(Macacamulatta， 雜猴）、xtr(Xenopustropicalis，热带爪赡）、ame(Apismellifera，意大利蜜蜂）、 odi((Mkopleuradioica，异体住囊虫）、cin(Cionaintestinalis，玻璃海銷）、csa(Ciona savign}d，萨氏海銷）、cfa(Canisfamiliaris，家犬）和猪或ssc(Susscrofa，野猪）的 miR同源。
[0060] 根据其公知常识，本领域技术人员将容易发现其他人microRNA序列和来自其他 物种的microRNA序列之间的同源性。
[0061] 本文所述的成熟microRNA的核酸序列W及它们相应的茎环序列是在在线可检索 的microRNA序列和注释的数据库miRBase中发现的序列。miRBase序列数据库的进入代表 预测的microRNA转录物的发夹部分（茎环），W及成熟microRNA序列的定位和序列信息。 数据库中的microRNA茎环序列不是严格的前体miRNA (pre-miRNA)，而在某些情况下可W 包括pre-imRNA和来自假定初级转录物的侧翼序列。
[0062] 因此，本发明的目的是提供用于治疗或预防AMI后屯、室重构的组合物，所述组 合物包含设及控制血管生成