特性，实施如下摇瓶筛选：用含甘油作为碳源的丰富 培养基预培养24小时，继而用丰富培养基进行主培养。
[0356]a)菌株&表达载体
[0357]毕赤酵母野生型菌株（CBS2612,CBS-KNAWF^mgalBiodiversity Centre,CentraalbureauvoorSchimmelcultures,Utrecht,TheNetherlands)用于作为 宿主菌株。用内部设计的命名为pPUZZLE(Stadlmayretal.J.Biotechnol2010 ;Dec; 150(4):519-29)的载体转化菌株，根据博来霉素抗性选择阳性转化子。使用酵母a-交配 因子前导肤进行猪的簇肤酶B(CpB)的分泌表达。
[0358] b)新识别的启动子pCSl在内部设计的表达载体中的扩增和克隆。
[0359] 将在实施例2b扩增的启动子克隆到pPUZZLE表达载体pPMlaZ30_aMF_CpB，产生 pPMlaZ30_pCSl_aMF_CpB。此外，将包含通常使用的甘油醒-3-憐酸脱氨酶启动子（pGAP) 的载体pPMldZ30_pGAP_CpB作为参照。用Apal和訊fl限制性位点将该启动子插入到CpB 基因的起始密码子的上游。通过Sanger测序验证该启动子序列的正确性。
[0360] C)在新确定的葡萄糖限制性诱导启动子控制下毕赤酵母表达CpB
[0361] 用Ascl限制性内切酶将质粒线性化，然后电穿孔法（采用适合毕赤酵母的标准转 化方法）导入毕赤酵母。在每升含下列组分的YTO平板上选择阳性转化子：10g酵母提取 物，20g蛋白腺，20g葡萄糖，20g琼脂，平板含25yg/mL博来霉素。使用菌落PCR保证如实 施例2c所述转化质粒的存在。
[0362] 接种单菌落到液体YPG-Zeo(每升含下列组分：20g蛋白腺、IOg酵母提取物、12.6g 甘油和25mg博来霉素）作为预培养，用于C地表达筛选。大约24小时后，预培养物用于将 主培养物（0D600 = 1)接种到YTO培养基中（每升含下列组分：20g蛋白腺，IOg酵母提取 物，20g葡萄糖）。每隔12小时向主培养物中流加0.5%的葡萄糖。在预培养末期W及接 种主培养物24小时和48小时后取样。通过测定0D600和细胞湿重确定生物量浓度。根据 C地的马尿酷-k精氨酸向马尿酸的转化，通过酶分析定量培养悬浮物中的C地浓度。开始 反应时，通过采用HitachiU-2910分光光度计检测在25°C，254nm的光吸收值测量反应动 力学。用分析缓冲液（25mM化is,IOOmM肥1，pH7.65)缓冲样品和标准品，并用激活缓冲 液化Olmg/L膜蛋白酶，300mMTris,IiiMZnClz,抑7. 65)激活。使用不含膜蛋白酶的 激活缓冲液代替样品作为阴性对照。通过添加底物溶液（ImM的马尿酷-k精氨酸溶于分 析缓冲液）启动反应。
[0363] d)在pCSl启动子控制下的表达CpB毕赤酵母菌株的分批补料培养。如实施例2d 所述用培养基进行实施例4所述的分批补料发酵。
[0364] 实施例7 :用人血清白蛋白化SA)作为胞外表达的报告基因，对新识别的毕赤酵母 多拷贝克隆中的启动子PCS1进行比较启动子活性研究
[036引为研究更高的GCN是否可进一步提高服A的产量，通过Marx等人（2009)所述的 转化后载体扩增方法扩增表达服A的Pcsi克隆。通过同源重组整合到rDNA基因座产生载 体。通过逐步提高的抗体浓度选择扩增。
[036引 a)菌株&表达载体
[0367]毕赤酵母野生型菌株（CBS2612,CBS-KNAWRmgalBiodiversity Centre,CentraalbureauvoorSchimmelcultures,Utrecht,TheNetherlands)用于作 为宿主菌株。用包含核糖体DNA座的NTS区作为整合位点（Marx等人，2009.FEMSYeast Res. 9 (8) : 1260-70.)的载体pPUZZLE的变种转化菌株。根据博来霉素抗性选择阳性转化 子。使用其天然分泌前导肤来分泌表达人血清白蛋白化SA).
[036引将实施例化扩增的pCSl启动子克隆到pPUZZLE表达载体pPMlnZ30JlSA，产生pPMlnZ30_pCSl_HSA。
[0369]用Apal和訊fl限制性位点将该启动子插入到服A基因的起始密码子的上游。通 过Sanger测序验证该启动子序列的正确性。
[0370] C)在新确定的启动子PCSl控制下的转化后载体扩增和毕赤酵母的服A表达
[0371] 用Spel限制性内切酶将质粒线性化，然后用电穿孔法（采用适合毕赤酵母的标准 转化方法）导入毕赤酵母。在每升含下列组分的YTO平板上选择阳性转化子：10g酵母提 取物，20g蛋白腺，20g葡萄糖，20g琼脂，平板含25 yg/mL博来霉素。菌落PCR保证如实施 例2c所述转化质粒的存在。如Marx等（FEMSYeast Res. 2009Dec ;9 (8) :1260-70)所述通 过在包含更高的博来霉素浓度巧0, 100和500 yg/mL博来霉素）的YTO琼脂平板上对克隆 重复划线扩增基因拷贝数。
[0372] 如实施例3c所述通过HSAELISA实施HSA表达筛选和产物定量分析。如实施例5 所述用最高服A分泌水平确定某些克隆的GCN。扩增GCN的Ptd克隆和具有已知GCNQ个 或2个）的Pew和PUi克隆作为对照，在BM培养基上培养48小时。
[0373] 通过提高HSAGCN，也提高了HSA的分泌水平（如表10所示）。与单拷贝克隆比 较，在含3个HSA基因拷贝的pCSl控制下表达HSA的多拷贝克隆每WCW产生2倍或3倍量 的HSA。在如实施例4所述的分批补料生物反应器培养中，也可预期多拷贝pCSl克隆的生 产率具有类似的提升。
[0375] 表10 :在pGAP或pCSl控制下单和多拷贝克隆的服A表达的筛选结果。显示了GCN 和每GCN的滴度。
[0376] 实施例8 :用抗体片段（F油）作为胞外表达的报告基因，对新识别的毕赤酵母启动 子PCSl进行启动子活性比较研究
[0377] 为了分析新识别的启动子的特性，实施如下摇瓶筛选：用含甘油作为碳源的丰富 培养基预培养24小时，继而用丰富培养基进行主培养。
[0378] a)菌株&表达载体
[0379] 毕赤酵母野生型菌株（CBS2612,CBS--KNAWRmgalBiodiversity Centre,CentraalbureauvoorSchimmelcultures,Utrecht,TheNetherlands)用于作为 宿主菌株。将实施例化中扩增的pCSl启动子克隆进入含Hy肥L抗体的LC或含Fab-肥作 为GOI的pPUZZLE表达载体。用Apal和訊fl限制性位点将该启动子插入到F油基因的起 始密码子的上游。测序验证后，通过使用兼容性限制性内切酶化el和Agel将两条链的表 达盒结合到一个载体上。
[0380]b)新识别pCSl启动子控制下F油在毕赤酵母中的表达。
[0381] 用Ascl限制性内切酶将质粒线性化，然后用电穿孔法（采用适合毕赤酵母的标准 转化方法）导入毕赤酵母。在每升含下列组分的YTO平板上选择阳性转化子：10g酵母提 取物，20g蛋白腺，20g葡萄糖，20g琼脂），平板含25yg/mL博来霉素。菌落PCR保证如实 施例2c所述转化质粒的存在。
[0382]F油的表达筛选与实施例3c所述HSA表达筛选类似。采用抗人IgG抗体（Abeam 油7497)作为包被抗体（1:1000)，和一种山羊抗人Ka卵a轻链（结合的和自由的）-碱性 憐酸酶结合的抗体（SigmaA3813)作为检测抗体（1:1000)的化ISA定量检测完整的Fab 的量。人F油/Ka卵a，IgG片段度ethylP80-115)用作标准，初始浓度为50ng/mL。相应 地稀释悬浮培养物样品。用pNPP底物（SigmaS0942)实施检测。在PBSOmMKH2P〇4，l〇mM Na2HP04?2H20,2.7mMgKCl，8mM化Cl，pH7.4)基础上制备包被，稀释，洗涂缓冲液，相应地 用BSA(1% (w/v))和 / 或Tween20(0. 1% (v/v))完成。
[0383] 从选择的克隆分离了基因组DNA，并如实施例5所述确定重链（肥）和轻链化C) 的GCN。GCN与克隆PCS1#5相关联，因此设定了肥和LC的GCN。F油表达产量（ygF油/ gWCW)，相关的GCN和每个GCN的Fab产量示于表11。关于其他模式蛋白，与在pGAP控制 下的表达克隆比较，每个在PCSl控制下表达的克隆的每个GCN的Fab产量大约是前者两倍 (平均 35. 4yg化b/gWCW)。
[0386] 表11 :在pGAP或pCSl控制下的F油表达的筛选结果。GCN和每个GCN的F油产 量显示在右边。
[0387] C)在pCSl启动子控制下表达F油的毕赤酵母菌株的分批补料培养。
[038引按照实施例4所述的相似条件，采用实施例2d所述的培养基实施分批补料培养发 酵。
[0389] 与pGAP比较，在生物反应器培养中，在pCSl控制下的F油的表达产生3.0倍的特 定产量（qP/GCN)(参见表12)。
[0390]
[03川表12 :在pGAP或pCSl控制下的F油表达的的生物反应器培养的结果。显示了分 批补料培末期的Fab产量，平均特异性产量qP(整个分批补料期每单位生物量（干细胞重 量DCW)的平均F油产率），各个克隆的相关GCN，和平均qP/GCN。
[039引实施例9:pCSl变种的比较
[0393]如实施例2a所示克隆了pCSl启动子的长度变种，并如实施例2c所述筛选了相似 变种。用PCSl(标准长度）和pGAP控制的克隆表达做对照。pCSl的正向引物和长度及其 变种列于表13。
[039引表13 :pCSl及其变种：pCSl的长度变种（SEQID1)的正向引物和长度。
[0397]在pGAP、pCSl或pCSl控制下的表达eGFP的克隆的筛选表明，pCSl产生最佳活性 需要大约至少5(K)bp的长度。更短的pCSl变种随着长度降低，活性降低（参见表14)。
[0399] 表14 :在pGAP，pCSl或pCSl变种控制下的eGFP表达的筛选结果（相对巧光）
[0400] 实施例10 :在高生长速率和低生长速率的生长限制条件下，在由启动子控制表达 eGFP的克隆中，该启动子的表达强度验证。
[0401]a)菌株
[0402] 用一个在感兴趣的启动子的控制下表达eGFP的宿主菌株（例如毕赤酵母）和在 pGAP控制下表达eGFP的菌株比较表达水平。
[0403]b)用于启动子比较的eGFP表达菌株的培养。
[0404] 在恒化器中用有效容积为1.化的DASGIP生物反应器在两个固定的特别生长速率 (通过设定稀释率，调节为一个高，一个低的特别生长率）下培养运些菌株。
[0405] 使用下列培养基：
[0406] 每升PTMl微量元素盐母液含：
[0407] 6. Og CuS04 ? 5电0, 0.0 Sg NaI, 3. 36g MnS〇4?电0, 0. 2g化2M0O4? 2电0, 0. 02邑 ?B03,0.82gCoCl2,20.0gZnCl2,65.0gFeS04?7H20,0.2g生物素和5.0ml H2SO4巧5% -98%)。
[0408] 甘油分批发酵培养基每升含：
[0409] 2g -水巧樣酸（C品〇7? &0)，39. 2g甘油，12.6邑畑化口〇4, 0. Sg M拆〇4? 7&0,0. 9g KC1，0. 022g化CI2? 2&0,0. 4mg生物素和4.6ml PTMl微量元素盐母液。添加肥1调抑为 5。
[0410] 恒化器培养基每升包含：
[0411] 2. 5g- 水巧樣酸㈱&〇7.&0)，55.Og- 水葡萄糖，21. 75邑(畑4)2册〇4, 1.Og M拆〇4? 7&0,2. 5gKC1，0. 04gCaClz? 2&0,0. 4mg生物素和 2. 43血PTMl微量元素盐母液。 添加肥I调抑为5。
[0412]采用揽拌速度（400-120化pm)将溶氧控制在DO= 20%。通气速率为24LA空气， 溫度的控制在25°C，而添加NH40H(25% )将抑调到5。为了启动发酵，将400ml分批培养 基灭菌，过滤到发酵罐，（从预培养物）接种毕赤酵母克隆，起始OD为0D600 = 1。大约25 小时分批期（到达大约20g/L的干物质浓度），继而是葡萄糖限制的恒化器发酵培养（20g/ L)恒化器的补料速率和收获速率用于保持需要的恒定的特别的生长速率。在培养期间，为 了保证恒定的生长率，保持培养液容积和细胞干重恒定。分别在0. 15和0. 015A的高和低 细胞生长率进行细胞培养。因此，补料/收获速率分别控制在ISOmLhIl1 (每升培养液每小 时补充的恒化器培养基mL数）和ISmLh15L1。
[041引 C)取样
[0414] 在稳定状态（至少交换5个体积）时取样，并用读板器（Infinite200,Tecan,CH) 分析eGFP表达。因此，将样品稀释到00600 = 5。发酵培养一式两份。如实施例2d所述， 采用计算每个生物反应器的相对巧光比较表达数据。
[0415] 实施例11 :高和低的特别生长速率下实现高速转录的毕赤酵母启动子的确定
[0416] 为了确定高和低的特别生长速率下实现高速转录的毕赤酵母启动子，用DNA基因 忍片分析了基因表达谱。从转录组数据选择了高和低的特别生长速率下的高速转录基因。 因此，毕赤酵母细胞是在分别在实施例1化所述的恒化器内在0. 15和0. 015h1的高和低的 特别生长速率下培养。如实施例Ic)、Id)、Ie)和If)所述实施取样，RNA纯化，基因忍片杂交 样品的制备，基因忍片分析，数据采集和统计评价。通过浏览在低和高生长速率条件下具有 高信号强度的基因忍片数据确定了高和低的生长速率下高速转录的基因和具体启动子。作 为第二标准，在两种条件下，信号强度应高于那些甘油醒-3-憐酸脱氨酶（GAP,又名GAPDH 和TD册）基因。为了分离启动子，扩增了相应基因的起始密码子ATG上游大约1000 bp的核 酸片段。
【主权项】
1. 一种分离的核酸序列，包含启动子，所述启动子是包含SEQID1所示的pCSl核酸序 列的毕赤酵母的天然序列，或者是具有其功能活性的变种，所述变种是长度变种，突变体或 SEQID1的杂交产物，或其组合。2. 根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述启动子由所述SEQID1所示的pCSl核 酸序列或具有其功能活性的变种组成，所述变种是长度变种，突变体或SEQID1的杂合序 列，或其组合。3. 根据权利要求1或2所述的核酸序列，其中，所述具有功能活性的变种表现与所述 SEQID1所示的pCSl核酸序列实质相同的活性。4. 根据权利要求1或2所述的核酸，其中，所述有功能活性的变种是： a) -种SEQID1所示的长度变种，优选包含选自由SEQID2、3、4、5、6、7和8组成的 组的核酸序列或由所述核酸序列组成，最优选自由SEQID2、3、4、5或6组成的组的核酸序 列； b) -种SEQID1所示的pCSl突变体，或一种a)的长度变种的突变体，该突变体与序 列SEQID1或与大小变体具有60 %的同源性； c) 一种杂合序列，包含： 一一一种选自由SEQID1所示的pCSl、一种a)的长度变种和一种b)的突变体组成的 组的序列；和 --至少一种进一步的序列，选自由SEQID1所示的pCSl，一种a)的长度变种，一种 b)的突变体和一种异源序列组成的组；或 d) -种序列，其在严谨条件下与任何长度变种杂交，或与a)或b)的突变体核酸序列杂 交。5. 根据权利要求1到4中的任一项所述的核酸序列，其中，所述有功能活性的变体选自 由具有以下特征的同源序列组成的组： i) 至少约60%的核苷酸序列一致性； ii) 通过修饰所述SEQID1所示的pCSl的核苷酸序列或其长度变种获得的同源序列， 或者通过插入、删除或替换所述序列内的或者序列的一个或两个末端的一个或多个核苷酸 获得的同源序列，优选地具有80bp~1500bp的核苷酸序列，更优选地，具有至少200bp的 核苷酸序列；和 iii) 源自毕赤酵母以外的种的类似物。6. 权利要求1到5中的任一项所述的核酸序列，可操作地与一种编码感兴趣的蛋白 (POI)的核苷酸序列连接，该序列的核酸和所述编码POI的核苷酸序列并非天然关联的。7. 根据权利要求6所述的核酸序列，其进一步包含编码一信号肽的核酸序列，所述信 号肽能够实现POI的分泌，优选地，其中编码信号肽的核酸序列定位于与编码所述POI的核 苷酸序列的5'端相邻。8. -种包含根据权利要求1至7的任一项所述核酸序列的表达构建物，优选一种自主 复制的载体或质粒，或一种整合到宿主细胞的染色体DNA的表达构建物。9. 一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求1至7的任一项所述核酸序列或根据权利 要求8所述的一种表达构建物，优选一种真核细胞，更优选一种酵母或丝状真菌细胞，更优 选酵母属或毕赤酵母属的一种酵母细胞。10. 权利要求9的所述的重组宿主细胞，包含所述核酸序列的多拷贝，和/或所述表达 构建物的多拷贝。11. 权利要求9或10的所述的重组宿主细胞，其选自由哺乳动物、昆虫、酵母、丝状真 菌和植物细胞组成的组，优选一种酵母，优选毕赤酵母株CBS704、CBS2612、CBS7435、CBS 9173-9189、DSMZ70877、X-33、GS115、KM71 和SMD1168 中的任一种。12. 根据权利要求9、10或11中的任一项所述的重组宿主细胞的多细胞稳定培养物。13. -种通过培养包含权利要求1至7的任一项所述启动子或权利要求8所述表达构 建物并包含在启动子的转录控制下编码POI的核酸的重组宿主细胞系或权利要求9至11 的任一项所述的重组宿主细胞生产POI的方法，包含步骤： a) 在表达所述POI的条件下培养所述细胞系，和 b) 回收所述POI。14. 权利要求13所述的方法，其中，所述POI是在生长限制条件下表达。15. 权利要求13或14所述的方法，其中，所述细胞系是在分批培养，分批补料培养或连 续培养下条件，和/或在含限制性碳源的培养基中培养。16. 权利要求15所述的方法，其中，所述培养是在生物反应器中进行，从分批培养期开 始，随后是分批补料培养期或连续培养期。17. 权利要求13至16中的任一项所述的方法，其中，所述POI是一种异源蛋白，优选 自治疗性蛋白质，包括抗体或其片段、酶和多肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合 物-蛋白质结合物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗类蛋白质或微粒、加工酶、生长因子、 激素和细胞因子，或一种POI的代谢物。18. -种鉴定来自真核细胞的组成型启动子的方法，包括步骤： a) 以高生长速率培养真核细胞； b) 进一步以低生长速率培养所述真核细胞； c) 提供步骤a)和b)的所述细胞培养物的样品， d) 在所述样品实施转录分析，将转录水平与所述细胞的所述天然pGAP启动子的转录 水平比较；和 f)选择与所述高速率和低速率生长的天然PGAP启动子比较具有更高的转录强度的所 述组成型启动子，优选的，通过确定所述经识别的组成型启动子的转录水平，其至少是所述 天然PGAP启动子的I. 1倍。19. 一种分离的包含一种启动子的核酸序列的用途，当与编码感兴趣的蛋白（POI)的 核苷酸序列可操作的连接时，该启动子指导其在宿主细胞中的表达，且表达水平高于高生 长速率和低生长速率时的天然pGAP启动子控制下的表达水平，优选在一种通过培养采用 所述核酸序列转化的宿主细胞产生所述POI的方法中的用途，其中所述培养是在生物反应 器中实施，以分批培养期开始，随后为分批补料期或连续培养期。20. 权利要求19所述的用途，其中，所述表达水平在0. 015-0. 15/h范围内的高生长速 率和低生长速率时确定。21. 权利要求19或20所述的用途，其中，所述表达水平至少为pGAP启动子的I. 1倍。22. 权利要求1~7中任一项所述的分离的核酸序列或权利要求8所述的表达构建物 在通过培养采用所述核酸序列和/或所述表达构建物转化的宿主细胞生产POI的方法中的
【专利摘要】本发明涉及一种包含启动子的分离的核酸序列，其是一种包含SEQ？ID？1所示的pCS1的核酸序列或其有功能活性的变种的天然毕赤酵母序列，该变种是一种长度变种，一种突变体或SEQ？ID？1的杂合序列，或其结合，涉及包含所述启动子的表达构建物和重组细胞，还涉及在所述启动子的控制下产生感兴趣的蛋白质的方法。本发明进一步涉及一种从真核细胞中识别组成型启动子的方法，和一种包含启动子的分离的核酸序列，该启动子在与编码POI的核苷酸序列可操作的连接时，指导其在宿主细胞中的表达水平高于在高和低生长速率的天然pGAP启动子控制下的表达水平。
【IPC分类】C12N15/81
【公开号】CN105229154
【申请号】CN201380076047
【发明人】D·马塔诺维赫, B·加塞尔, R·普里尔霍弗
【申请人】龙沙有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2013年12月18日
【公告号】CA2903568A1, EP2970994A1, WO2014139608A1