marrays,Agilent)。根据基因忍片杂交室用户指南 (MicroarrayHybridisationQiamberUserGuide)(AgilentG2534A)实施了基因忍片杂 交。首先，打开垫玻片，将样品管置于样品室基座上，Agilent标记面向上。将样品（每个 忍片40yL)加载到八个正方形的每一个的中间。然后，小屯、的将基因忍片玻片置于垫玻片 (Agilent标记面向下），并盖好样品室盖，固定在管夹上。在杂交炉中在65°C下杂交17小 时。扫描前，洗涂基因忍片。因此，拆除样品室，沉入洗涂缓冲液1时，=层玻片互相脱离。 将基因忍片直接转移到另一个装盛洗涂缓冲液1的盘中，洗涂1分钟，转移到缓冲液2(溫 度至少3(TC)，并再洗涂1分钟。通过将玻片边缘与组织接触将基因忍片玻片干燥后，置于 玻片支架中（Agilent标签向上），将玻片支架置于传送带上，开始扫描。
[0277]f)基因忍片数据的数据采集和统计评价
[0278] 将采用G2565AA基因忍片扫描仪（Agilent)在50皿分辨率扫描获得的图像输入 Agilent特征提取9. 5软件。Agilent特征提取9. 5用于点强度定量。将原始平均点强度 数据输入开源软件R进行进一步标准化和数据分析。
[0279] 采用Iimma包，vsn及m阵列进行数据预处理和标准化。强度数据并不是背景纠 正的，并且采用VSN进行标准化。
[0280] 为进入高信号强度，浏览两种状态下的基因忍片数据，W便识别强表达的组成型 基因。表1显示具有两种状态下的信号强度的最强转录基因。添加了pGAP和pTEF的数据 作为参照。平均地，在两种条件下（甘油分批培养和葡糖限制性恒化器培养），PCSl超过 pGAP约 30 %，而pTEF比pGAP弱约 12 %。
[0282] 表1 :基因忍片数据，选择其启动子用于进一步表征，pGAP和pTEF数据作为对照
[0283] 1在甘油分批培养期（两个通道的平均）
[0284] 2在葡糖限制的恒化器（两个通道的平均）
[0285] 实施例2 :用绿色巧光蛋白（eGF巧作为胞内表达的报告基因，对新识别的毕赤酵 母启动子PCSl进行比较启动子活性研究
[0286] 为了分析新识别的启动子的特性，实施如下摇瓶筛选：用含甘油作为碳源的丰富 培养基预培养24小时一一模拟整个过程的分批培养期，继而用基础培养基和葡萄糖补料珠 进行主培养一一模拟整个过程的葡糖限制的分批补料期。用绿色巧光蛋白（(eGF巧作为启 动子活性的胞内报告基因。
[0287] a)菌株&表达载体
[028引 毕赤酵母野生型菌株（CBS2612,CBS-KNAWRmgalBiodiversity Centre,CentraalbureauvoorSchimmelcultures,Utrecht,TheNetherlands)用于作 为宿主菌株。用内部设计的命名为pPUZZLE(Stadlmayretal.J.Biotechnol2010; 150(4):519-29)的载体转化菌株，该载体包含一个大肠杆菌（pUC19)复制起点，一个用于 在大肠杆菌和酵母菌中进行选择的抗生素抗性盒（提供博来霉素抗性的化ble基因），一 个用于感兴趣的基因（GOI)、由多克隆位点和酿酒酵母CYCl转录终止子组成的表达盒，和 整合进毕赤酵母基因组的基因座（3 0X1区）。
[0289]b)将新确定的启动子pCSl扩增和克隆进包含eGFP作为GOI的pPUZZLE表达载 体。
[0290]pCSl启动子（SEQID)包含CSl基因的98化P的5'非编码区（参见实施例1)上 行到起始密码ATG，并通过PCR(杂合聚合酶，新英格兰生物实验室）用表2所示引物从毕 赤酵母基因组DNA扩增。将该序列克隆进入pPUZZLE表达载体pPMlaZ10_eGFP，用Apal和 訊f1酶切割，产生pPMlaZ10_pCSl_eGFP。此外，将包含通常使用的3-憐酸甘油醒脱氨酶启 动子（毕赤酵母的pGAP,本发明称为SEQID13)的载体pPMlaZ10_pGAP_eGFP作为参照。 用Apal和Sbfl限制内切酶位点（参见表2和3)将该启动子插入到eGFP基因的起始密码 子的上游。通过Sanger测序验证该启动子序列的正确性。
[0292]表2:用于启动子的PCR扩增的引物
[0294] 表3 :扩增引物，克隆酶和克隆启动子的长度
[0295] C)在毕赤酵母表达eGFP用于分析启动子活性
[0296] 通过3'AOX基因组整合区内的Ascl将全部质粒线性化，然后电穿孔法 (2kV, 4ms,Gene化Iser,BioRad)打入感受态的毕赤酵母。
[0297] 在包含25yg/mL博来霉素（Invivogen，CA)的酵母浸出粉腺葡萄糖灯PD)平板 上选择阳性转化子（每升含：l〇g酵母提取物，20g蛋白腺，20g葡萄糖，20g琼脂）。菌 落PCR用于保证转化质粒的存在。因此，通过冷却和冰冻毕赤酵母克隆5分钟获得基因 组DNA，直接与合适的引物用于PCR。为了进行表达筛选，将单菌落接种到液体YPG-Zeo液 体培养基预培养，（每升YPG-Zeo液体培养基含：20g蛋白腺，IOg酵母提取物，12.6g甘 油和25mg博来霉素）。大约24小时后，预培养物用于接种0D600为0. 1的主培养物到 2mL合成筛选培养基中（每升含：22g-水葡萄糖，22g巧樣酸，3. 15旨(畑4)2册〇4, 0. 〇27g CaClz? 2&0, 0. 9gKC1，0. 5gM拆〇4? 7&0, 2ml500x生物素和 1. 47ml微量盐母液[每升 含：6gCuS04.51^0,0.OSgNaI, 3gMnS04?&0,0. 2gNazMoO* ^HzO, 0.02g&803,0.5邑C0CI2， 20gZnCl2,5gFeS04.7H20和SmlHzSOJ;用5MKOH将抑调到5;过滤灭菌）和四份葡萄糖补 料珠中的两份（2glucosefeedbeadquarters) (24小时后加入第二补料珠；Kuhner,CH)。 由于运些补料珠具有如下方程式所述的慢的葡萄糖释放动力学，可获得葡萄糖限制的生 长条件：（葡萄糖）=1.63^^0. 74虹肖/培养盘].在每次预培养结束时取样，接种主培养 物后24小时和48小时分别取样。通过测定0D600确定细胞密度，通过在Stadlmayr等 人.（J.Biotechnology2010Dec;150(4) :519-29)所述的流式细胞仪分析eGFP的表达。 (J.Biotechnology2010Dec; 150 (4) :519-29).每个样品分析 10000 个细胞。用未转化的 毕赤酵母野生型细胞测定毕赤酵母的自动巧光，从中减去信号。相关eGFP表达水平（与细 胞大小相关的巧光强度）显示为在组成型PGAP控制下表达eGFP的克隆的eGFP表达水平 的百分比。
[0298]结果显示于表4。在预培养（分批）末期，在pCSl启动子控制下的克隆表达超过 了pGAP38%，在主培养（分批补料）末期，具有4倍的GFP表达水平。
[030。表4 :在新的pCSl启动子控制下表达eGFP的毕赤酵母克隆的每个细胞大小的平 均GFP巧光。数据显示在同时间点与pGAP相关。
[030引 d)实施例2C确定毕赤酵母克隆的eGFP基因的拷贝数（GW
[0303]GCN代表整合到毕赤酵母基因组内的报告蛋白表达盒的数量。如下列进一步的实 施例5所述，在pCSl或pGAP控制下表达eGFP的克隆的GCN决定。eGFP的表达水平分析如 实施例2c。作为实例，表5显示了每个启动子的一个克隆的结果。在筛选培养中，与在具有 相同GCN的pGAP启动子控制下表达的克隆比较，在新的pCSl启动子控制下表达eGFP的克 隆产生两倍数量的eGFP。
[0304]
[0305] 表5:在与GCN相关的pGAP或pCSl控制下的筛选培养中的eGFP表达。每个 GCN，pCSl克隆表达的eGFP量是pGAP克隆的两倍。
[0306]e)在分批补料发酵中分析pCSl启动子强度
[0307] 为了评估在生产过程类似的条件下PCSl启动子活性，分批补料培养了 1个PCSl 克隆（pCSl_eGFP#4)和一个pGAP克隆（pGAP_eGFP#2)，每个都含一个拷贝的eGFP表达盒 (参见实施例2d).
[0308] 在DASGIP反应器中进行终体积为1.化的分批补料发酵。
[0309] 采用下列培养基：
[0310]PTMl微量元素盐母液，每升含：
[0311] 6.OgCuS〇4? 5&0,0.OSg化I，3. 36gMnS〇4 ? &0,0. 2g化2M0O4? 2&0,0. 02gH3BO3， 0. 82gCoCl2,20.OgaiCl2,65.OgFeS〇4? 7&0,0. 2g生物素和 5.Oml&5〇4(95% -98% )。
[0312] 甘油分批培养基每升含： 阳引引 2g-水巧樣酸（C品〇7? &0)，39. 2g甘油，12.6gNH4H2PO4,0. 5gM拆〇4? 7&0,0. 9g KC1，0. 022gCaClz? 2&0,0. 4mg生物素和4.6mlPTMl微量元素盐母液。添加肥1调抑到 5。
[0314] 葡萄糖分批补料培养基，每升含：
[031引 464g-水葡萄糖，5. 2gM拆04? 7肥0,8. 4gKC1，0. 28gCaClz? 2&0,0. 34mg生物 素和10.I血PTMl微量元素盐母液。
[0316] 采用揽拌速度（400-120化pm)将溶氧控制在DO= 20%。通气速率为24LA空气， 溫度控制在25°C，而添加NH40H(25% )将抑调到5。
[0317] 为了启动发酵，将400ml分批培养基灭菌，过滤到发酵罐，（从预培养物）接种毕赤 酵母克隆pCSl_eGFP#l，起始OD为1 (0D600)。大约25小时分批期（到达大约20g/L的干 物质浓度），继而是葡萄糖限制的分批补料发酵培养（从指数补料7小时开始，恒定补料速 率15g/L达13小时，产生最终大约llOg/L的干物质浓度）。在分批培养和分批补料培养期 取样，并采用读板器分析eGFP表达（Infinite200,Tecan,CH)。因此，将样品稀释到0D600 =5。一式两份进行发酵。结果W每个生物反应器的相对巧光值（FL/r)显示在表6。与整 个发酵过程的PGAP比较，在pCSl启动子控制下的克隆表达平均具有42倍的eGFP表达。 [031引
[0319] 表6:两个不同的在优化的分批补料培养中表达eGFP的毕赤酵母克隆的每个生物 反应器的相对巧光，t表示补料时间。
[0320]f)在不同生长条件和底物中的pCSl的启动子活性。
[0321] 为了获得关于在不同的培养条件和生长条件下PCSl的启动子活性的更多信息， 将菌株pCSl_eGFP#4在含不同碳源，具有不同的PH值的YP培养基和在合成基础培养基上 培养。接种主培养物后24小时和48小时后取样，通过实施例2c所述的流式细胞仪分析。
[0322] 如参考，将pCSl-eGFP#4或pGAP-eGFP#2单菌落接种在液体YPG-Zeo培养基（每 升含：20g蛋白腺，IOg酵母提取物，12. 6g甘油和25mg博来霉素）作为预培养基。预培养 大约24小时后，预培养物用于将0D600为0. 1的主培养物接种到2血主培养基。主培养基 组成如下：每升YP培养基含：20g蛋白腺，IOg酵母提取物，pH7. 0-7. 5 ;YPD:YPW%葡萄 糖。￥?6:￥?巧％甘油，￥?1:￥?+1%甲醇，￥?6:￥?+1%乙醇，￥?补料珠：￥?+1葡萄糖补料珠 (Kuhner,CH,直径6mm) ;YPD地4. 5 :用肥1将Yro调抑为4. 5;SCD:合成的筛选培养基（每 升含：22g-水葡萄糖，22g巧樣酸，3. 15g(畑4)2册〇4, 0. 〇27gCaClz? 2&0, 0. 9gKC1，0. 5g M拆〇4? 7&0, 2血500X生物素和I. 47血微量元素盐母液[每升含：6g化S04 ? 5&0， 0.OSg化I，3gMnS04.H20,0.2gNazMoCM.2H20,0.02gH3B03,0.5gCoClzJOgZnCl2,5g FeS04? 7&0和5mLH2SO4];用5MKOH调抑为5 ;过滤灭菌）。除了采用补料珠的培养，在 19小时和43小时后，其他全部培养都采用5 %的各自碳源培养。每个细胞大小的eGFP巧 光的结果显不在表7。
[0323] 24小时和48小时后，在YPD上，pCSl表达水平超过pGAP的表达水平2倍，而24 小时和24小时后，在YPG上pCSl的表达水平是pGAP的3. 9倍。采用甲醇或乙醇作为碳源 时，或在抑4. 5(表7)在新pCSl启动子的控制下的表达水平甚至更高。
[0325] 表7:在不同的筛选培养基上培养24小时和48小时后，毕赤酵母克隆pGAP_ eGFP#2或pCSl-eGFP#4每个细胞大小的相应eGFP巧光值。运里给出了 2个培养的平均值 和SD。
[0326] 实施例3 :用人血清白蛋白化SA)作为胞外表达的报告基因，对新识别的毕赤酵母 启动子PCSl进行比较启动子活性研究
[0327] 为了分析新识别的表达分泌的报告蛋白的启动子的特性，实施如下摇瓶筛选：用 含甘油作为碳源的丰富培养基预培养24小时一一模拟整个过程的分批期，继而用缓冲的丰 富培养基（2%的葡萄糖）进行主培养。用每隔12小时0. 5%的葡萄糖主培养补料进行主 培养：
[0328]a)菌株&表达载体
[032引 毕赤酵母野生型菌株（CBS2612,CBS-KNAWF^mgalBiodiversity Centre,CentraalbureauvoorSchimmelcultures,Utrecht,TheNetherlands)用于作为 宿主菌株。用命名为pPUZZLE(Stadlmayretai.J.Biotechnol2010Dec;150(4):519-29) 的内部设计的载体进行菌株转化，根据博来霉素抗性选择阳性转化子。对于人血清白蛋白 化SA)的分泌表达，采用其天然分泌前导物。
[0330] b)新确定的启动子pCSl的扩增和克隆进入表达载体。
[033。将在实施例化扩增的启动子克隆进入pPUZZLE表达载体pPMlaZlOJlSA，产生pPMlaZ10_pCSl_HSA。此外，包含通常使用的甘油醒3-憐酸脱氨酶启动子（pGAP)的载体 pPMlaZ10_pGAPJlSA作为参照。用Apal和訊n限制性位点将该启动子插入服A基因的起 始密码子上游（参见表3)。通过Sanger测序验证该启动子序列的正确性。
[0332]C)在新确定的启动子pCSl的控制下表达毕赤酵母中的HSA [033引用Ascl限制性内切酶将全部质粒线性化，然后电穿孔法导入P.pastoris。在YPD 平板（每升含：上选择阳性转化子IOg酵母提取物，20g蛋白腺，20g葡萄糖，20g琼脂糖）上 选择阳性转化子，平板含25yg/血博来霉素。菌落PCR用于保证实施例2c所述转化质粒 的存在。
[0334] 将单菌落接种到液体YPG-Zeo培养基作为预培养基，用于HSA表达筛选（每升 含：20g蛋白腺，IOg酵母提取物，12. 6g甘油和25mg博来霉素）。大约24小时预培养后， 预培养物用于在BM培养基（每升含下列组分：20g蛋白腺，IOg酵母提取物，20g葡萄糖， 13. 4g含硫酸锭的酵母氮源，0. 4mg生物素和IOOmM憐酸钟缓冲液抑6. 0)中接种0D600 为0.1的主培养物。用0.5%的葡萄糖每隔12小时向主培养物补料。在主培养末期取 样。通过测定0D600或湿细胞重确定了生物量浓度。按照供应商说明书通过人血清白蛋 白ELISA定量试剂盒HumanA化uminELISA如antitationSet(化t.No.E80-129,Behyl L油oratories,TX，USA)定量测定了培养悬浮液中HSA的浓度。HSA标准采用起始浓度 400ng/mL。相应地，用样品稀释液巧OmMTris-肥I，140mM化Cl，l% (w/v)BSA，0. 05% (v/ v)Tween20,抑8.0)稀释样品。在表8介绍了在pGAP(l个服A基因拷贝）控制下表达服A 的克隆筛选的服A滴定量和9个在pCSl下表达eGFP的克隆。所有pCSl控制的克隆分泌的 HSA相当于带1个基因拷贝的pGAP控制的克隆两倍。如实施例5所述确定HSA中的GCN。 所有分析的在pCSl控制下的克隆在筛选培养中具有1拷贝的表达盒（IGCN)，因此，所有在 新pCSl启动子控制下的克隆服A分泌量（mg分泌的服A/g生物量）是具有相同GCN的pCSl 克隆的两倍。
[033引表8:筛选培养48小时后，pGAP和pCSl控制下的表达服A的毕赤酵母克隆在悬浮 液中分泌的HSA水平的定量。
[0337] 实施例4 :pCSl启动子控制下的表达HSA的毕赤酵母的分批补料培养
[0338] 为了分析在生产过程类的条件下pCSl驱动HSA表达的能力，分批补料培养了 1个 携带1拷贝的HSA表达盒（参见实施例3)的pCSl克隆（pCSl_HSA#l)。
[0339] 在有效容积为1.化的DASGIP生物反应器中进行发酵。按照参考文献培养了两个 不同的pGAP(Prie化Ofer等人在2013.Microb.Cell.Fact. 12:5所述的有1个HSA基因拷 贝的pGAP_HSA#3和具有两个HSA基因拷贝的pGAP_HSA#4)控制下表达HSA的毕赤酵母菌 株。
[0340] 使用了如下培养基：
[034。 每升PTMi微量元素盐母液含：
[034引6. Og CuS04? SHzO, 0.0 Sg NaI，3. 36g MnS04.屯0, 0. 2g化2M0O4? 2电0, 0. 02邑 H3B03,0.82gCoCl2,20.0gZnCl2,65.0gFeS04?7H20,0.2g生物素和5.0mlH2SO4巧5% -98%)。
[0343] 甘油分批发酵培养基每升含：
[0344]39. 2g甘油，27. 9gH3PO4(85% )，7.8gM拆〇4?7&0, 2.6gK0H，9. 5gKzSO" 0.6g CaS〇4? 2肥0,0. 4mg生物素和4.6血PTMl微量元素盐母液。灭菌过滤进入发酵罐后调抑 为 5. 85。
[0345] 葡萄糖分批补料培养基每升包含：
[0346] 550g-水葡萄糖，6.5gM拆〇4? 7&〇,IOgKC1，0. 35gCaClz? 2&〇, 0. 4mg生物素 和12mLPTMl微量元素盐母液。
[0347] 采用揽拌速度（400~1200巧m)将溶氧控制在DO= 20%。通气速率为24LA空 气，溫度控制在25°C，而添加NH40H(25% )将抑调到5. 85。
[034引为了启动发酵，将400ml分批培养基灭菌，过滤到发酵罐，（从预培养）接种毕赤 酵母克隆，起始OD为0D600 = 1。大约25小时分批期（到达大约20g/L的干物质浓度）， 继而是葡萄糖分批补料培养100小时（恒定补料速率2g/l，产生最终大约lOOg/L的干物质 浓度）。分批培养期间，pH为5. 85,整个发酵期间保持5. 85。在分批培养和分批补料培养 期取样。如实施例3c用人血清白蛋白ELISA定量试剂盒度ethyl,化t.No.E80-129)进行 HSA浓度定量。
[0349] 如前所示，具有2个HSA拷贝的pGAP克隆分泌相当于具有1拷贝的pGAP克隆分 泌量的两倍。（Prie化Ofer等人，2013.Microb.Cell.Fact. 12:5)。与单拷贝GAP克隆比较， 在PCSl控制下分泌HSA的两个克隆在分批培养和分批补料培养末期分泌高过4倍的HSA 滴定量（结果如表9所示）。与生物量和GCN相关，pCSl克隆产生的分泌的HAS的量相当 于相同基因拷贝数的PGAP克隆的390%。
[035。表9:在分批培养末期和分批补料培养末期的悬浮液中酵母干物质浓度和HSA滴 定量，和在pCSl或pGAP控制下表达HSA的毕赤酵母克隆在生物反应器培养的分批补料末 期的HSA滴定量/每干物质量。
[035引实施例5 :所选克隆的基因拷贝数（GCN)的确定
[0353] 表达强度通常与整合到毕赤酵母基因组的表达盒的数量相关。因此，确定了 选择的克隆的基因拷贝数。采用DNeasyBlood&TissueKit(如iagen,(^it.No.69504) 分离了基因组DM。用定量PCR确定了基因拷贝数。因此，采用了SensiMixSYBR Kit度ioline，QT605-05)。将巧光染料SensiMixSYBR分别与引物（Prie化Ofer等人 给出，2013.Microb.Cell.化Ct. 12:5)和样品混合，用于实时PCR的实时分析（Rotor Gene,Qiagen)。所有样品实施一式S份或一式四份分析。采用RotorGene软件进行数据 分析。
[0354] 实施例6:用猪的簇肤酶基因B(CpB)作为胞外表达的报告基因，对新识别的毕赤 酵母启动子PCSl进行启动子活性比较研究
[0355] 为了分析新识别的启动子的