一种受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6及其应用
【专利摘要】本发明提供一种受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、重组表达载体和宿主菌。利用本发明的水稻特异性启动子Psub6驱动抗逆基因表达，使水稻可以抵抗水淹胁迫正常生长，适应日益恶劣的气候环境，具有重要的现实意义和实用价值。经实验验证，本发明的启动子在与目标基因结合并转入到水稻植株中之后，在水淹胁迫条件下，水淹3天后即可使目的基因表达量为淹前的6.5倍，水淹6天后可使目的基因表达量达到淹前的14.2倍，进而可以很好地证明，本发明的Psub6启动子具有显著的受水淹胁迫诱导性状。
【专利说明】
一种受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6及其 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种受水 淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psube及其应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上重要的粮食作物之一，近年来由于气候的厄尔尼诺现象，使水稻在 生长阶段遭遇干旱或洪涝的极端气候，严重影响了水稻的产量。通过植物基因工程的方法 改良农作物对极端气候的抗性具有重要的应用前景。启动子对基因表达的调控启示我们通 过基因工程改变或添加启动子来激活抗逆基因的表达，提高农作物的抗逆性。
[0003] 植物工程中常用的启动子可分为三类:组成型启动子、组织特异性启动子和诱导 性启动子。常用的CaMV35S启动子就是组成型启动子，能有效驱动抗逆基因在植物各组织中 表达，增强抗逆性，但在顺境中也会大量表达抗逆基因，过量消耗植物能量，降低目标基因 的作用效率，甚至可能产生毒害作用。因此，寻求高效、特异的启动子是植物基因工程发展 的必然方向。
[0004] 诱导启动子是指能够在某些物理或化学信号等的刺激下，显著地提高转录活性的 一类启动子。与组成型启动子和组织特异性启动子相比，诱导启动子有着独特的优点：它可 根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下，快速诱导基因转录，适时地调控 "开"与"关"。在植物转基因研究中，应用诱导启动子实现在特定环境下启动目的基因转录， 可有效避免因外源基因不必要表达造成的物质能量浪费和对植物的伤害，也能减少人们对 转基因表达产物长期存留的担心。目前研究较多的有非生物胁迫诱导启动子，如光诱导表 达启动子、温度诱导表达启动子和水分诱导表达启动子，以及生物胁迫诱导启动子。随着转 基因水稻研究的深入，基于转基因水稻产量、品质与安全性的多元需求，对驱动外源基因表 达的启动子的要求越来越高。
[0005] 但是，目前对水淹或渍涝胁迫的启动子的研究并不充分。水稻是一种半水生作物， 对水分的需求量很大，但正常生长的水层深度也有一定范围，长期没顶淹水下不能生存。具 体表现为，水稻在淹水条件下，其有氧呼吸收到抑制，水稻由有氧呼吸转成以生成乙醇的无 氧酵解途径，进而引发乙醇、R0S、N0等有害物质的生成。同时，淹水条件下，水稻的光合作用 也受到严重的抑制，这些都影响了水稻的正常生长，造成减产甚至绝收。
[0006] 而我国水稻产区又主要处在长江淮河流域，经常会有洪涝灾害的发生。因此，能够 开发出在水稻中特异表达的水淹胁迫启动子具有显著的经济和社会价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psube及其应 用。
[0008] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性 启动子Psub6，
[0009] 所述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6的DNA序列包含序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列；或者
[0010] 所述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6的DNA序列为与序列表中SEQ ID NO: 1所不序列具有至少80%序列同一性的序列;或者
[0011] 所述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6的DNA序列为在序列表SEQ ID NO: 1所示的序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或衍生 物;或者
[0012] 所述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6的DNA序列具有与SEQ ID NO: 1所示的序列杂交的产物。。
[0013] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的序列，本文中称为Psub6或启动子Psub6。具体而言，本申请的发明人从日 本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)分离克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1所示的 DNA序列，并发现这段2122bp的DNA序列能够驱动目标基因在受水淹胁迫诱导的情况下表 达。
[0014] 优选地，本发明提供的受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psube的DNA序列 为SEQ ID No:l所示的序列，即Psub6或启动子Psub6。
[0015] 另一方面，本发明还提供一种包含上述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子 Psub6的表达盒。
[0016] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的受水 淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6,在所述重组表达载体中，所述受水淹胁迫诱导 表达的水稻特异性启动子Psub6连接于待表达的基因序列的上游;优选地，所述待表达的基 因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-Psub6,该重组表达载体为将SEQ ID No:l 所示的序列即Psub6或启动子Psub6构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称 为pCAMBIA1391-Psub6。
[0017] 或者待表达基因可以为任何对水稻的抗水淹胁迫具有改善能力的基因。
[0018] 再一方面，本发明提供上述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psube在培 育转基因作物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述受水淹胁迫诱导表达的水稻特 异性启动子Psube连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于/插 入目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或 器官中进行培育。
[0019] 再一方面，所述应用可以改良作物抗逆性，所述作物为禾谷类作物:水稻、小麦、高 粱、大麦、燕麦、黑麦等;优选为水稻。
[0020]综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)中具有转录活性的2122bp的DNA序列，并将其命名为Psub6(序列表中的SEQ ID No: 1)。具体而言，发明人发现该序列具有在受水淹胁迫诱导情况下驱动基因特异性表 达的能力，因而提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。发明人将该序列经酶切后连接到 作物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质 粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水 稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，水淹处理3天后的Psube-GUS植株叶 片中出现明显的蓝色，代表着Psub6驱动报告基因⑶S表达，而在未处理的Psub6-GUS植株叶 片仍为白色，代表目标启动子没有表达。表明Psube启动子活性受水淹胁迫的诱导，是水淹 诱导启动子。通过定量PCR检测报告基因 GUS的表达强度发现，Psub6-GUS植株叶片水淹3天 后GUS表达量为淹前的6.5倍，水淹6天后为淹前的14.2倍，这个结果表明Psub6启动子受水 淹胁迫的显著诱导。
[0021 ]技术效果
[0022]本发明所述的受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6可与作物双元表达 载体连接，用于取代组成型启动子。在水稻遭遇洪涝灾害时，驱动抗逆基因表达，保护水稻 抵抗水淹的逆境胁迫，保障水稻的生产安全，具有重要的理论及实际意义。
【附图说明】
[0023]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0024] 图1为将Psub6启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为 PCAMBIA1391示意图，B为pCAMBIA1391-Psub6示意图，其中示出了利用Psub6启动子驱动位 于其下游的Gus基因表达；
[0025]图2为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。
[0026] 图3为Psub6-GUS植株⑶S染色结果。水淹处理3天后的Psub6-GUS植株叶片中出现 明显的蓝色，代表着Psub6驱动报告基因⑶S表达，而在未处理的Psub6-GUS植株叶片仍为白 色，代表目标启动子没有表达；因此，本实验表明，Psub6启动子活性受水淹胁迫的诱导，是 水淹诱导启动子。图中标尺为0.2cm 〇
[0027] 图4为水淹处理不同天数的Psub6-GUS植株中⑶S相对表达强度。Psub6-GUS植株叶 片水淹3天后GUS表达量为水淹前的6.5倍，水淹6天后为水淹前的14.2倍，这个结果表明 Psub6启动子受水淹胁迫的显著诱导。
【具体实施方式】
[0028] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0029] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的生 化试剂，载体耗材等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0030] 实施例1
[0031] 含有酶切位点的Psub6启动子的获得 [0032]步骤1、引物的设计
[0033] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组 序列，依据水稻启动子Psube的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设计引物的酶切位点。
[0034] 本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIAl 391 (图1中A部分，来自于CAMBIA，公开 使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存） 为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物5 '端带酶切位点Hindi 11 (AAGCTT)，反向引物5'端带酶切位点EcoRI(GAATTC)，引物序列如下(SEQ ID N0:2-3):
[0035] 正向引物：AAGCTTGGACGACTGCTATTGTTGAGAG HindIII
[0036] 反向引物：GAATTCCATGGTGCTCACTACTCACTCA EcoRI [0037]由深圳华大基因公司合成。
[0038]步骤2、启动子Psub6的获得
[0039]以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子Psub6,按常规 PCR体系，采用如下扩增程序：
[0040] 95 °C 预变性 5min; 95 °C 变性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 2min30s，35 个循环；最后 72°C 延伸 lOmin。
[00411回收PCR扩增的目的片段，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载 体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛 选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用HindIII和EcoRI进行双酶切验证，目的片段 长度2122bp，如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克 隆即为所要获得的启动子Psub6,其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0042]重组表达载体的构建和农杆菌的转化
[0043]从上面"启动子Psub6的获得"过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindII I和 EcoRI双酶切，回收启动子Psub6片段。同时利用HindIII和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化 处理、回收PCAMBIA1391，将上述的Psub6片段和pCAMBIA1391片段用T4DNA连接酶（购于 TaKaRa公司）进行连接，得到启动子Psub6与Gus基因融合的作物表达载体pCAMBIA1391-Psub6(图1B)，利用冻融法将作物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）。
[0044] 利用启动子Psub6驱动Gus报告基因在水稻中表达
[0045] 步骤1:农杆菌介导的水稻遗传转化
[0046] 将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有1滴 Tween 20的50%次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4% )溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉 次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种 子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤组织与 胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于 农杆菌转化。
[0047] 采用上述"重组表达载体的构建和农杆菌的转化"过程中转入了重组表达载体的 根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参 照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(0ryza sativa L.) [J] .Plant Cell Report，2012.D0I 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。获得 Psub6-GUS株系植株。
[0048] 步骤2、水淹胁迫实验
[0049] 1 · Psub6_GUS 株系 GUS 染色
[0050] 将Psube-GUS株系种子消毒后，于无菌条件下在浸润有超纯水的滤纸上萌发，注意 超纯水不要没过种子。在萌发5天后，将材料按数量均分为两份，其中一份继续在滤纸上有 氧萌发3天作为对照；另一份置于IOcm深无菌水底部，在28°C，16小时光照/8小时黑暗条件 下水淹处理3天。剪取对照和水淹处理材料的叶片，用于⑶S组织化学染色，参照Jefferson (Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J] .EMBO J.，1987,6:3901_3907)等提出的方法。 将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，在⑶S染液中染色0.5小时后，即可观察结果 (见图3)。水淹处理3天后的Psub6-GUS植株叶片中出现明显的蓝色，代表着Psub6驱动报告 基因 GUS表达，而在未处理的Psub6-GUS植株叶片仍为白色，代表目标启动子没有表达；因 此，本实验表明，Psub6启动子活性受水淹胁迫的诱导，是水淹诱导启动子。
[0051 ] 2 · Psub6-GUS株系⑶S定量分析
[0052]取萌发后21天的水稻植株，将全株完全置于水面下进行水淹处理。分别在水淹前 (0天），淹后3天和6天剪取叶片材料，通过定量PCR检测报告基因⑶S的表达强度。RT-PCR采 用天根生化科技有限公司的SuperReal荧光定量预混液试剂盒（TIANGEN SYBR Green， FP205)。以水稻ACTIN基因作为内参基因对所用RNA模板量进行定量。每个基因做3次重复。 本实验用到的基因的定量引物为(SEQ ID NO 4-7):
[0053] ACTIN-FP:5 '-CCTGACGGAGCGTGGTTAC-3'，
[0054] ACTIN-RP:5 '-CCAGGGCGATGTAGGAAAGC-3 '
[0055] 用于ACTIN的扩增；
[0056] Gus-FP:5 '-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3 '
[0057] Gus-RP:5 '-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3 '
[0058] 用于⑶S的扩增。
[0059] 实验结果见图4，？8仙6-61^植株叶片水淹3天后^3表达量为淹前的6.5倍，水淹6 天后为淹前的14.2倍，这个结果表明Psub6启动子受水淹胁迫的显著诱导。
[0060] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【主权项】
1. 一种受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6,其特征在于，所述启动子 Psub6能够驱动目的基因在水淹胁迫条件下诱导表达。2. 根据权利要求1所述的受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6,其特征在 于， 所述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6的DNA序列为序列表中SEQ ID NO: 1所示的序列;或者 所述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6的DNA序列为与序列表中SEQ ID NO: 1所不序列具有至少80%序列同一性的序列;或者 所述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6的DNA序列为在序列表SEQ ID NO: 1所示的序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或衍生物； 或者 所述受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6的DNA序列具有与SEQ ID N0:1所 示的序列杂交的产物。3. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求2所述的受水淹胁迫诱导表达的 水稻特异性启动子Psub6。4. 一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的受水淹胁 迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6,在所述重组表达载体中，所述受水淹胁迫诱导表达 的水稻特异性启动子Psub6连接于载体中待表达的基因序列的上游。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为 pCAMBIA1391-Psub6,其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体，所述待表达的基因为Gus基 因；或者所述待表达的基因是抗逆境胁迫基因。6. -种根据权利要求2所述的受水淹胁迫诱导表达的水稻特异性启动子Psub6在培育 转基因作物中的应用，其特征在于，所述应用包括:将权利要求2所述的受水淹胁迫诱导表 达的水稻特异性启动子Psub6连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载 体;将所述重组表达载体转化到作物细胞、组织或器官中进行培育，进而获得相应转基因植 株。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良作物抗逆性，所述作物 为禾谷类作物:水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦或黑麦。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在对所述重组表达载体进行转化时，所采 用的转化方法为农杆菌介导方法。9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括： A) 、以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增所述受水淹胁迫诱导 表达的水稻特异性启动子Psub6; B) 、将所扩增的目的片段与待表达的基因相连，进而获得相应重组表达载体； C) 、利用冻融法将所获得的重组表达载体转入根癌农杆菌中； D) 、通过农杆菌介导方法利用所获得的根癌农杆菌对水稻愈伤组织进行遗传转化； E) 、利用转化后的水稻愈伤组织培育相应的水稻植株。
【文档编号】C12N15/84GK105861507SQ201610389753
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】秦瑞英, 杨剑波, 李 浩, 李娟 , 魏鹏程, 杨亚春, 李莉, 许蓉芳
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所